Xúc tác sinh học và xúc tác enzyme

Xúc tác sinh học, hoặc xúc tác enzyme, sử dụng các thành phần hoạt tính sinh học để xúc tác các biến đổi hóa học. Xúc tác sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho một phổ các phản ứng chủ yếu lấy carbon làm trung tâm trong môi trường khác nhau, từ không có tế bào, hoàn toàn trong ống nghiệm đến các quá trình qua trung gian lên men trong nuôi cấy tế bào sống.

Xúc tác sinh học đại diện cho một giải pháp thay thế hữu ích cho xúc tác hóa học truyền thống vì một số lý do. Phản ứng chất xúc tác sinh học enzym:

• Có tính hóa học, quy mô và enantiospecific cao
• Thường có động học nhanh
• Hoạt động trong điều kiện nhẹ hơn chất xúc tác hóa học
• Loại bỏ vấn đề chất thải, độc tính và chi phí của chất xúc tác kim loại
• Giảm nhu cầu năng lượng liên quan đến phản ứng hóa học

Kỹ thuật có hướng của chất xúc tác sinh học giúp cải thiện độ ổn định trong dung môi ở nhiệt độ cao, cho phép áp dụng rộng rãi xúc tác sinh học trong ngành dược phẩm, hóa chất, nhiên liệu sinh học và thực phẩm.

Tải xuống sách trắng miễn phí này để tìm hiểu cách PAT và khoa học dữ liệu trong nghiên cứu, phát triển và sản xuất các quy trình xúc tác sinh học cho phép xác định nhanh các tuyến đường tổng hợp không khả thi, đo phản ứng động học, sàng lọc và kiểm soát các thông số quy trình.

Xúc tác sinh học gắn liền với sản xuất sản phẩm hóa chất "xanh", bền vững và tiết kiệm chi phí. Liên quan đến xúc tác hóa học, chất xúc tác sinh học mang lại những lợi thế vốn có cho tổng hợp, bao gồm:

• Sự đa dạng hợp chất đáng kể, từ các nguồn tự nhiên hoặc biến đổi gen, để giải quyết một loạt các biến đổi hóa học
• Tính đặc hiệu của các phản ứng xúc tác sinh học giúp giảm thiểu nhu cầu về các chiến lược tổng hợp / xử lý hóa học cổ điển cụ thể, chẳng hạn như sử dụng các nhóm chặn/khử khuôn, tách hỗn hợp đối kháng và làm việc để loại bỏ các sản phẩm phụ không mong muốn
• Đơn giản hóa cơ sở hạ tầng và yêu cầu nguyên liệu thô vì nhiều quy trình xúc tác sinh học có thể được thực hiện trong các phản ứng một nồi và loại bỏ các bước phản ứng theo yêu cầu của xúc  tác hóa học truyền thống

Các enzym được sử dụng trong xúc tác sinh học có các khả năng quan trọng và thường xuyên được tận dụng bao gồm:

A) Liên kết nhóm chức năng hoặc vị trí cụ thể và nhận dạng mục tiêu của các sinh phẩm hoặc phân tử nhỏ khác

B) Thúc đẩy sự liên kết hoặc dịch chuyển của các sinh phẩm hoặc phân tử nhỏ khác

C) Các đặc điểm cấu trúc hoặc tĩnh điện tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển ion

D) Các biến đổi cấu trúc bị trật tự và do đó, các hoạt động xúc tác khác nhau

E) Các biến đổi dị ứng hoặc gián tiếp gây ra hoặc ức chế hoạt động của enzyme

Nghiên cứu về chất xúc tác sinh học tái tổ hợp cải tiến hoặc sửa đổi tiếp tục mở rộng tiện ích của chúng trong hóa học khắc nghiệt, cải thiện phạm vi phản ứng, độ bền và khả năng tái sử dụng của enzyme. Các chất xúc tác sinh học tự nhiên và kỹ thuật hiện có sẵn để thực hiện các biến đổi hóa học quan trọng như hình thành liên kết C-C, liên kết amide, hình thành amin chiral và chức năng C-H.

Phạm vi của các enzyme được sử dụng để biến đổi sinh học cực kỳ rộng và trải dài hầu như tất cả các lĩnh vực công nghiệp bao gồm thực phẩm, dược phẩm, dệt may, nhiên liệu sinh học, giấy, hóa chất và các sản phẩm gia dụng. Trong quá trình tổng hợp hóa chất tốt, dược phẩm và các chất trung gian liên quan, xúc tác sinh học (tức là xúc tác enzym hoặc xúc tác qua trung gian enzyme) đã phát triển nhanh chóng như một công nghệ cho phép. Các enzym có sẵn cho các biến đổi sinh học khác nhau như oxy hóa, khử, bổ sung và loại bỏ. 

Sáu loại enzyme chính và ví dụ ứng dụng: 

1. Oxidoreductase xúc tác quá trình oxy hóa và khử phân tử. Các enzym monooxygenase với oxy phân tử cho phép hình thành liên kết CO và các enzym cụ thể đã được thiết kế để cho phép oxy hóa rượu, xeton, aldehyde và amin. Đối với quá trình khử, ketoreductase (KREDS) và dehydrogenase cho phép tổng hợp các loại rượu đối kháng đặc hiệu. Các enzyme khác có thể làm giảm liên kết như C = N, chuyển đổi nitrile thành amin. 

2. Transferase rất hữu ích để chuyển các nhóm chức từ phân tử này sang phân tử khác. Kinase và phosphatase (bổ sung và loại bỏ phốt phát) đặc biệt quan trọng đối với các tầng tín hiệu phân tử, sao chép DNA, phiên mã RNA và các chức năng khác. Ngoài ra còn có nhiều transferase có ý nghĩa sinh học phục vụ các chức năng, chẳng hạn như chuyển đổi xeton hoặc aldehyde thành amin và có thể làm như vậy một cách rập tắt.

3. Hydrolases xúc tác thủy phân các chất nền khác nhau. Nuclease hoặc protease rất sung mãn và cần thiết trong tái chế axit nucleic và peptide. Các chất hydrolase như lipase, protease và acylase hoạt động như chất xúc tác cho các chất bổ sung Michael 1,4, được sử dụng rộng rãi để tạo thành liên kết CC và carbon-dị nguyên tử.

4. Lyase thường xúc tác các phản ứng thông qua sự hình thành hoặc loại bỏ các liên kết đôi. Khác với phản ứng thay thế bằng hydrolas, phản ứng carboxylase hoặc decarboxylase phổ biến trong xúc tác sinh học dược phẩm để bổ sung hoặc loại bỏ CO₂, cũng như lyase CN có thể được sử dụng để tạo ra các axit amin bao gồm axit aspartic thay thế và alanine.

5. Isomerase cho phép sắp xếp lại các nguyên tử trong một phân tử. Isomerase, chẳng hạn như racema, đảo ngược hóa học lập thể tại cacbon chiral mục tiêu và đồng phân cis-trans xúc tác sự đồng phân của các đồng phân cis-trans trong alkenes hoặc cycloalkane. Sự chuyển đổi glucose thành fructose thông qua isomerase glucose đại diện cho một quá trình biến đổi sinh học enzyme công nghiệp chính.

6. Ligases tạo thành các liên kết hóa học mới bằng cách nối hai phân tử để tạo thành một phân tử lớn hơn. Một trong những ứng dụng quan trọng nhất là sử dụng DNA ligase trong việc hình thành các phân tử DNA tái tổ hợp và là chất bổ sung cho endo- hoặc exonuclease.

Sản xuất chất xúc tác enzyme. Nói chung, các enzyme tự nhiên hoặc tái tổ hợp để xúc tác sinh học đầu tiên được tổng hợp thông qua quá trình lên men, thường sử dụng vi khuẩn, nhưng đôi khi có nguồn gốc từ nuôi cấy nấm men. Mặc dù các enzym có thể được sản xuất trong nuôi cấy tế bào động vật có vú phức tạp hơn, vi khuẩn và nấm men thường chứa các con đường phân tử đủ và tự nhiên để đạt được các sửa đổi gấp và sau dịch thuật vừa phải cần thiết cho các enzym xúc tác sinh học tái tổ hợp. Các enzym được tạo ra thông qua quá trình lên men như vậy thường được thu hoạch bằng cách ly giải hoặc phá vỡ cấu trúc tế bào khác để giải phóng các enzym tái tổ hợp và được tinh chế thêm trong một quá trình tương tự như các sinh học khác Dược phẩm. Quá trình lên men, thu hoạch và chế biến hạ nguồn đưa ra những thách thức riêng được giải quyết bằng cách tận dụng Công nghệ Phân tích Quy trình (PAT).

Ổn định và cố định. Cố định enzyme được sử dụng để đạt được các enzym ổn định, hoạt động và có thể tái sử dụng hơn. Nói chung, các tập hợp enzyme liên kết ngang (CLEA) có thể được hình thành với một số chất nền rắn khác nhau như silica, nhựa hoặc polyme như PEG và thậm chí cả các phức hợp khác như hạt nano lipid (LNP). Đối với một số ứng dụng hóa học dòng chảy, CLEA cũng có thể được hình thành trên các bề mặt và cảm biến như những cảm biến được sử dụng trong các phép đo tăng cường bề mặt cho mục đích phân tích và xúc tác. Các giải pháp tương tự cho công thức vắc-xin và quy trình bổ trợ giải quyết những thách thức về tổng hợp thành phần liên quan, hấp phụ, liên hợp hoặc các liên kết khác, cũng như tính ổn định và công thức của sản phẩm.

Thu thập và cách ly sản phẩm. Sau khi xúc tác sinh học, CLEA được tách ra khỏi sản phẩm và các chất phản ứng còn sót lại và sau đó có thể được tái chế hoặc giữ lại. Các sản phẩm phân tử nhỏ sau đó có thể được phân lập thông qua quá trình lọc hoặc sắc ký, mặc dù nhiều quy trình tiếp tục ủng hộ các phương pháp kết tinh. Các sản phẩm xúc tác sinh học phân tử lớn thường sẽ tiếp tục với quy trình xử lý hạ nguồn truyền thống.

Hiểu được thời gian bán hủy thực tế và độ ổn định của bất kỳ enzyme tự do, liên kết với chất nền hoặc cố định bề mặt nào có thể rất quan trọng đối với việc thiết kế các phác đồ xúc tác sinh học thích hợp. Những cân nhắc bao gồm:

• Dung môi—Nhiều enzyme tự nhiên phải vật lộn để đối phó với các phản ứng dung môi hữu cơ. Hồ sơ không ngừng phát triển của các enzyme kỹ thuật hoặc tái tổ hợp đang cải thiện khả năng tương thích với các điều kiện dung môi hữu cơ. Ví dụ, các enzym tái tổ hợp hiện có khả năng xúc tác các phản ứng trong môi trường dung môi hữu cơ, cho phép sử dụng phosphoramidit biến tính trong tổng hợp oligonucleotide.
• Độ pH—Các enzyme thường hoạt động tốt nhất trong phạm vi pH hẹp và chịu được sự thay đổi pH <0,5 đơn vị pH. Do đó, kiểm soát độ pH thường là một thông số quan trọng để xem xét cho nhiều phản ứng xúc tác sinh học và có thể khó hoặc tẻ nhạt để kiểm soát thủ công. 
• Nhiệt độ—Các enzyme tự nhiên và các đối tác tái tổ hợp của chúng hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ cụ thể với phạm vi khá hẹp. Độ lệch nhiệt độ có thể gây ra những thay đổi về động học phản ứng, năng suất sản phẩm hoặc các kết quả quy trình quan trọng khác.
• Oxy hòa tan—Thông số quá trình quan trọng này, đặc biệt quan trọng đối với các phản ứng oxy hóa và khử, thường được kiểm soát bằng cách phun hoặc định lượng oxy hoặc khí trơ. Tối ưu hóa số lượng và sự truyền khối lượng của oxy hòa tan (bao gồm các đặc tính bong bóng) vào hỗn hợp phản ứng là rất quan trọng để đảm bảo rằng các enzym oxidoreductase có thể hoạt động ở hiệu suất cao nhất.
• Pha trộn, Động lực học chất lỏng và khí—Thiết bị trộn thích hợp có thể ảnh hưởng lớn đến vòng đời của các enzym xúc tác sinh học, đặc biệt là trong thời gian dài, hóa học dòng chảy hoặc chạy kiểu tưới máu. Việc mở rộng quy mô của các phản ứng xúc tác sinh học có thể không tối ưu nếu trộn không được đặc trưng đầy đủ. Trộn cũng rất quan trọng để phân phối khí và truyền khối lượng thích hợp.
• Cân bằng phản ứng—Tỷ lệ thuốc thử trên enzyme chính xác là rất quan trọng và có thể được xác định bằng các nghiên cứu Thiết kế Thí nghiệm (DoE), được tự động hóa bởi các lò phản ứng hóa học và được hỗ trợ bởi PAT tích hợp trong quá trình phát triển.

Sự phát triển và mở rộng quy mô của các phản ứng xúc tác sinh học phụ thuộc vào bản chất của các chất xúc tác sinh học cụ thể được sử dụng, chất nền, đồng yếu tố và điều kiện phản ứng được áp dụng. Cũng như trong xúc tác hóa học, ma trận phức tạp, phụ thuộc lẫn nhau này được hiểu rõ nhất bằng cách kiểm soát cẩn thận các biến phản ứng khi kết hợp với thông tin từ các phép đo phân tích thời gian thực. Tuy nhiên, phần lớn các giới hạn về phát triển quy trình, mở rộng quy mô và mật độ dữ liệu đối với các quy trình hiện đại gắn liền với việc tiếp tục định hướng thủ công các phản ứng xúc tác sinh học, có chi phí thời gian và nguồn lực đáng kể. Vận hành thủ công có nghĩa là nhân viên có mặt tại lò phản ứng sinh học để chăm sóc, điều chỉnh và lấy mẫu gần như liên tục để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của quy định và thể chế về mô tả đặc tính quy trình và chuyển giao công nghệ.

Có thể vận hành xúc tác sinh học không giám sát thông qua các nền tảng tự động hóa trong phòng thí nghiệm đáp ứng các điều kiện phản ứng động được đo liên tục thông qua các cảm biến tích hợp và công nghệ phân tích quy trình (PAT). Các nền tảng lò phản ứng tổng hợp tự động tạo điều kiện thử nghiệm nhanh hơn với sự can thiệp hoặc lỗi của con người được giảm thiểu. Kết hợp với lấy mẫu lò phản ứng tự động, mô-đun để phân tích sắc ký ngoại tuyến, tất cả các thông số quy trình quan trọng (CPP) có thể được phủ lên và theo xu hướng. Kiểm soát thông số và dữ liệu phân tích quy trình được tự động ghi lại trong thời gian thực và được cấu trúc để quản lý và lưu trữ dữ liệu. Giảm sự thay đổi thí nghiệm và tăng khả năng tái tạo trên các quy mô lò phản ứng khác nhau hợp lý hóa hơn nữa việc mở rộng quy mô dựa trên bằng chứng.

• Lò phản ứng tự động EasyMax và OptiMax có vai trò quan trọng để đảm bảo rằng ảnh hưởng của các biến số chính của quá trình biến đổi sinh học, chẳng hạn như nhiệt độ, pH, tốc độ trộn và liều lượng, được kiểm soát chính xác, mô hình hóa và ghi lại hiệu quả.
• Công nghệ quang phổ tại chỗ ReactIR và ReactRaman rất hữu ích để theo dõi và đo lường các loại phản ứng chính trong thời gian thực. ReactIR theo dõi các chất phân tích chính trong dung dịch mà không có sự can thiệp từ các hạt lơ lửng như toàn bộ tế bào.
• ParticleTrack với công nghệ FBRM đo kích thước hạt và sự phân bố trong huyền phù không đồng nhất. EasyViewer chụp hình ảnh tại chỗ của các hạt và thực hiện phân tích hình ảnh theo thời gian thực về độ đục, hình dạng, kích thước, hình thái, số lượng và phân bố của hệ thống.
• EasySampler cho phép lấy mẫu hoàn toàn tự động và không cần giám sát các phản ứng hóa học, bao gồm làm nguội và pha loãng mẫu để chuẩn bị cho phân tích ngoại tuyến.
• Phần mềm phát triển quy trình và mở rộng quy trình Scale-up Suite cho phép phát triển nhanh chóng, quy trình tối ưu và mở rộng quy mô mạnh mẽ.

Lò phản ứng tự động EasyMax là một máy trạm hoàn chỉnh để tối ưu hóa thông số trong xúc tác sinh học để hỗ trợ phát triển, mở rộng quy mô và thực hiện. Hệ thống hoàn toàn tự động này cho phép kiểm soát chính xác các thông số quy trình.

• Quản lý CPP, bao gồm xác định nguyên liệu nguồn, tốc độ định lượng, nhiệt độ, khuấy, khoảng trống, phun phản, đo pH và chuẩn độ
• Dễ dàng tích hợp với phân tích tại chỗ để xúc tác sinh học, bao gồm ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (phân tích hình ảnh tại chỗ) và EasySampler (lấy mẫu lò phản ứng tại chỗ tự động)
• Chạy thử nghiệm khi không có người giám sát; Thực hiện lấy mẫu tự động thông minh khi cần phân tích ngoại tuyến
• Phần mềm iC cho phép thực hiện và kiểm soát tự động tất cả các thí nghiệm và thiết bị ngoại vi cũng như thu thập dữ liệu đầy đủ và lưu trữ hồ sơ

ReactIR sử dụng quang phổ FTIR để đo các thành phần hòa tan trong nước và hữu cơ trong các nghiên cứu xúc tác sinh học. Các phép đo ReactIR không bị ảnh hưởng bởi chất rắn lơ lửng, bong bóng hoặc khối lượng hạt khác.

ReactRaman sử dụng quang phổ Raman để cung cấp phân tích phân tử của các hạt và phân tích phản ứng.

• Giám sát nhiều thuộc tính chất lượng sản phẩm tại chỗ và trong thời gian thực trong một bình hoặc dòng quy trình chảy
• Loại bỏ sự chậm trễ liên quan đến lấy mẫu
• Định lượng tác động của các bước xử lý đối với năng suất sản phẩm và hiệu quả quy trình
• Cung cấp phân tích dữ liệu hữu ích để ra quyết định và kiểm soát theo thời gian thực
• Hỗ trợ các hướng dẫn quy định về ICH thông qua thử nghiệm và số hóa giàu dữ liệu
• Hỗ trợ mở rộng quy mô từ R&D đến sản xuất
• Đo nồng độ chất phân tích thấp tới 500 ppm trong thể tích từ vài ml đến hàng nghìn lít

ParticleTrack sử dụng công nghệ Đo lường phản xạ chùm tia hội tụ (FBRM) và là một thiết bị dựa trên đầu dò quang học được đưa trực tiếp vào bình để theo dõi sự thay đổi kích thước hạt và số lượng trong thời gian thực. ParticleTrack sử dụng các phép đo Phân bố độ dài hợp âm (CLD) để có được Phân bố kích thước hạt (PSD).

• Các hạt và cấu trúc hạt được theo dõi liên tục khi các điều kiện hoặc thông số thí nghiệm khác nhau
• Đặc điểm tổng hợp hạt pha rắn, cố định enzyme, phân tách và hình thái quá trình liên quan
• Theo dõi sự phát triển hàng loạt hoặc liên tục của các sản phẩm xúc tác sinh học trong quá trình xúc tác sinh học trong thời gian thực mà không cần loại bỏ mẫu
• Mô tả đặc điểm của các điều kiện hệ thống hạt ảnh hưởng đến quá trình tạo mầm, lượng mưa, đa hình và các thuộc tính khác của hệ thống

EasyViewer là một máy phân tích kích thước hạt dựa trên đầu dò được đưa trực tiếp vào bình để chụp ảnh của hệ thống hạt. EasyViewer thực hiện phân tích hình ảnh và đo số lượng hạt, phân bố kích thước và hình thái từ các hình ảnh nội tuyến được phân giải theo thời gian của quá trình cho phép các quần thể có xu hướng theo thời gian.

• Các hạt và cấu trúc hạt được theo dõi liên tục khi các điều kiện hoặc thông số thí nghiệm khác nhau
• Đặc điểm tổng hợp hạt pha rắn, cố định enzyme, phân tách và hình thái quá trình liên quan
• Đo sự truyền khối lượng (_KLA) thông qua đặc tính bong bóng
• Theo dõi sự phát triển hàng loạt hoặc liên tục của các sản phẩm xúc tác sinh học trong quá trình kết tinh trong thời gian thực mà không cần loại bỏ mẫu
• Mô tả các điều kiện hệ thống hạt ảnh hưởng đến sự hình thành mầm, kết tủa, đa hình và các thuộc tính khác của hệ thống

Thiết kế thí nghiệm (DoE) là một phương tiện hữu ích về mặt thống kê để giảm thiểu số lượng thí nghiệm cần thiết để khám phá ảnh hưởng của các biến đối với hiệu suất phản ứng trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, việc mở rộng quy trình xúc tác enzyme để sản xuất vẫn còn nhiều vấn đề. Ví dụ, nhiều nghiên cứu xúc tác sinh học không xem xét các biến số như dung môi, pH, nhiệt độ và pha trộn trong việc mở rộng quy mô. Mô hình Dynochem cho phép tính đến các tính chất vật lý và nhiệt quan trọng trong việc mở rộng quy mô. Khi thông tin động học được sử dụng với mô hình Dynochem, các điểm cuối lấy mẫu phù hợp có thể được xác định cho các quá trình xúc tác sinh học, tiết kiệm thời gian và nguồn lực. Do đó, mô hình Dynochem tăng cường sự phát triển của các thông số quy trình quan trọng và không gian thiết kế quy trình hiệu quả.