Chế biến hạ nguồn trong dược phẩm sinh học

Xử lý hạ nguồn (DSP) là một loạt các hoạt động đơn vị sau khi hoàn thành sự phát triển và mở rộng tế bào, và hoàn thành việc sản xuất hoặc tổng hợp các chất thuốc hoặc các thành phần khác. Chế biến hạ nguồn nhằm mục đích cô lập, tinh chế và cô đặc dược chất (DS) đã được tổng hợp trước đó hoặc các sản phẩm khác khỏi ma trận trồng số lượng lớn. Trong lịch sử, đầu tư đã được thực hiện để cải thiện năng suất và hiệu giá ngược dòng, giúp phát triển thuốc sinh học tiết kiệm hơn. Trong những năm trước, các quy trình hạ nguồn không được giải quyết ở cùng một cấp độ và bây giờ cần được tối ưu hóa hơn nữa.

Chế biến hạ nguồn dược phẩm sinh học đề cập đến việc thu hồi và tinh chế một chất dược phẩm từ các nguồn tự nhiên, chẳng hạn như tế bào động vật hoặc vi khuẩn. DSP dược phẩm sinh học có thể áp dụng trong các kháng thể đơn dòng (mAb) hoặc các quy trình protein và sản xuất oligonucleotide, polysaccharide, các loại vắc-xin, liên hợp sinh học, liệu pháp gen và các sản phẩm trị liệu tế bào.

Chế biến hạ nguồn có thể bao gồm các hoạt động công thức ban đầu, biểu thị sự chuyển đổi từ DS sang sản phẩm thuốc (DP). Các cân nhắc quan trọng bao gồm quản lý và đo lường các thuộc tính chất lượng sản phẩm, nhiều thông số quy trình, nguồn và số lượng tạp chất, dòng chất thải và các mối nguy sinh học.

Các hoạt động DSP được thực hiện ở quy mô phát triển quy trình, thí điểm và quy mô sản xuất quy mô phòng thí nghiệm và được hỗ trợ bởi các nhóm công nghệ phân tích quy trình (PAT) và Khoa học và Công nghệ Sản xuất (MSAT) tập trung vào tối ưu hóa quy trình, mở rộng quy mô và khắc phục sự cố. Xử lý hạ nguồn có thể so sánh ở quy mô sinh học khám phá hoặc giai đoạn đầu của sàng lọc mục tiêu thông lượng cao không phổ biến, mặc dù có thể được thực hiện tương tự, về nguyên tắc.

Hướng dẫn này thảo luận về cách các nhà khoa học sử dụng công nghệ phân tích quy trình (PAT) để chuyển đổi quy trình làm việc hàng ngày và cải thiện đáng kể các quy trình hạ nguồn. Các chủ đề bao gồm:

• Theo dõi nồng độ protein
• Tối ưu hóa quy trình trao đổi bộ đệm
• Thành phần, phân bố và hình thái chất bổ trợ vắc-xin
• Tự động hóa bất hoạt vi-rút
• Phát triển quy trình liên hợp sinh học

• Tiền điều trị: 
  Ly giải chất hoạt động bề mặt, hấp thụ pha hữu cơ: Tách sản phẩm bằng ly giải thường theo đuổi mục tiêu cơ bản: phá vỡ hiệu quả các cấu trúc cô lập có chứa dược chất hoặc sản phẩm và tạo ra sự tách biệt vật lý giữa bất kỳ mảnh vụn, tạp chất nào và dược chất. Ly giải axit hoặc chất hoạt động bề mặt hầu như chỉ được sử dụng với nuôi cấy vi khuẩn hoặc nấm men. Tương tự, hấp thụ và thu giữ sản phẩm theo pha hữu cơ phổ biến nhất trong các hệ thống sản xuất và biểu hiện của vi khuẩn và đôi khi được sử dụng cho các hệ thống nấm men.
  Keo tụ và kết tủa: Đây là những phương pháp thao tác hệ thống hạt chủ động để đạt được mục tiêu tách. Keo tụ thường được áp dụng như một phương pháp chuẩn bị trước khi lọc hoặc ly tâm. Áp dụng keo tụ đảm bảo thông lượng khối lượng cao trên các đơn vị lọc cũng như tách vật liệu tế bào khỏi chất trên trung hưởng hiệu quả và tiết kiệm chi phí. Các phương pháp loại bỏ chất keo tụ và quy trình xác minh bổ sung có thể được yêu cầu. Kết tủa là một thao tác hạt tích cực được kích hoạt bởi sự thay đổi các thông số, chẳng hạn như dung môi và cường độ ion để giảm độ hòa tan.
• Ly tâm: Được áp dụng rộng rãi như một phương pháp phân tách trong xử lý sinh học, ly tâm là một kỹ thuật phổ biến và chính được sử dụng để tách các mảnh vụn hạt một cách bừa bãi dựa trên khối lượng hoặc trọng lượng phân tử như một hàm của tốc độ bát, tốc độ lấp đầy và tốc độ xả. Các máy ly tâm công nghiệp thông thường loại bỏ một lượng đáng kể (lên đến 99%) khối lượng hạt đối với kích thước hạt nhỏ tới 5μm và đôi khi nhỏ tới 1μm đối với các quy trình được tối ưu hóa cao. Mặc dù hiệu quả này, máy ly tâm vẫn có thể truyền một lượng vi hạt có vấn đề, và đặc biệt là các hạt nano, vào các hoạt động hạ nguồn sẽ yêu cầu xử lý thêm. Với các quy trình sinh học thường đạt được tổng sinh khối cao đến rất cao (hạt vi mô và nano) và mật độ tế bào sống cuối cùng thay đổi, khả năng ly tâm cố định cũng có thể hạn chế thông lượng quy trình và không được coi là thực tế cho quá trình xử lý sinh học liên tục.
  
• Lọc sâu, sợi rỗng: Tùy thuộc vào tính chất của sản phẩm và quy trình, các phương pháp thu hoạch thường bao gồm lọc độ sâu (Hình 1-1) hoặc bộ lọc sợi rỗng (Hình 1-2). Với lọc sâu, hỗn hợp chứa hạt được bơm qua màng hoặc một giao diện khác để tách các mảnh vụn khỏi sản phẩm trong huyền phù lỏng. Bộ lọc sợi rỗng được sử dụng trong các hoạt động xử lý sinh học liên tục để loại bỏ chất thuốc biểu hiện trên thanh (DS) trong khi tạm thời giữ một phần sinh khối trong sợi rỗng trước khi xả ngược bằng môi trường ngược dòng chảy. Tách dòng trường âm thanh là một kỹ thuật mới nổi khác hiện được tìm thấy chủ yếu trong môi trường phát triển. Với nhiều chế độ hoạt động và cấu hình khác nhau, kết quả có thể:
  • Điều chỉnh không phân tách tế bào hoặc hạt (Hình 1-3a)
  • Chọn sự tách tế bào hoặc hạt từ các luồng nguồn cấp vào một luồng bắt mới với sự chuyển hướng hoặc tách quần thể hạt thứ hai (Hình 1-3b)
  • Di dời toàn bộ hệ thống hạt vào một dòng mới và / hoặc phân bổ lại chất lỏng, có thể trong tuần hoàn (Hình 1- 3c)
  • Tương tác thủy động lực học, nơi hỗn hợp điều chế của cả lựa chọn hạt và trao đổi chất lỏng có thể xảy ra (Hình 1-3d)

Máy phân tích kích thước hạt nội tuyến, chẳng hạn như ParticleTrack™ với công nghệ FBRM®, đo sự tích tụ hạt và phân bố kích thước của nguồn cấp nước dùng tế bào đi vào hoặc thoát ra khỏi bộ lọc và có thể cung cấp mối tương quan công suất hoặc kiểm soát phản hồi để giảm thiểu sự gián đoạn quy trình. EasyViewer™ với Image2Chords™ thực hiện phân tích hình ảnh và trích xuất sự tích tụ hạt, phân bố kích thước và hình thái từ các hình ảnh nội tuyến được phân giải theo thời gian của quy trình. Được đặt trên hoặc dưới bộ lọc, EasyViewer có thể cung cấp khả năng tương quan công suất hoặc kiểm soát phản hồi nhưng có giá trị nhất khi được áp dụng để phân tích nguyên nhân gốc rễ, đặc điểm và hình thái.

Phương pháp và chiến lược bắt thay đổi một chút tùy thuộc vào bản chất của phân tử đích. Kháng thể được thu giữ bởi các loại nhựa ái lực như Protein A và Protein G, cũng như một số phương pháp được thiết kế có chọn lọc khác. Các protein không kháng thể và oligonucleotide thường được thu giữ bằng sắc ký trao đổi ion (IEX). Các sản phẩm như polysaccharid và cấu trúc glycan phức tạp thường được thu giữ bằng sắc ký tương tác kỵ nước (HIC) hoặc sắc ký pha ngược (RPC).

Các mục tiêu đo lường chính trong quá trình sắc ký bao gồm tối đa hóa khả năng liên kết của sản phẩm với cột, được đo bằng khối lượng của sản phẩm được nạp vào cột (tải trọng cột), trừ khối lượng của sản phẩm thoát ra khỏi đầu ra của cột (được gọi là "đột phá"). UV là phương pháp đo sản phẩm phổ biến nhất, được sử dụng rộng rãi để đo protein và DNA. Các phương pháp đo lường sản phẩm và phi sản phẩm thay thế cũng có thể thực hiện. Quang phổ FTIR nội tuyến có thể được sử dụng để định lượng và phân biệt các thành phần như chất hoạt động bề mặt, đường thông thường hoặc dung dịch đệm axit amin, lipid, sản phẩm liên hợp và thậm chí cả các sản phẩm có cấu trúc cấu trúc thay đổi, chẳng hạn như dạng mAb. FTIR thường được sử dụng cùng với tia cực tím khi chỉ riêng tia cực tím không thể đo các thành phần quan trọng không phải protein / không axit nucleic.

• Sắc ký ái lực (Protein A / G) là một phương pháp sắc ký lần đầu tiên (thường được gọi là Protein A hoặc ProA) tách và cô đặc sản phẩm quan tâm (thường là mAb) khỏi các vật liệu hòa tan khác bằng cách liên kết ngược hoặc giữ lại protein mục tiêu vào cột thông qua các tương tác liên kết cụ thể (hình ảnh a) trong khi các thành phần khác "rửa giải" qua cột (hình ảnh b). Rửa giải chọn lọc tuân theo một loạt các bước rửa và sau đó giải phóng phân tử mục tiêu (hình c). 
  
  

• Sắc ký trao đổi ion (IEX) tách và cô đặc sản phẩm quan tâm (protein, oligonucleotide và các vật liệu khác) khỏi các vật liệu hòa tan khác bằng cách liên kết đảo ngược hoặc giữ lại phân tử mục tiêu vào cột dựa trên cường độ tương tác tĩnh điện với vật liệu pha rắn (Hình 2d) trong khi các thành phần khác "rửa giải" qua cột. IEX thường được sử dụng như một phương pháp tinh chế bổ sung hoặc thay thế và do đó, không bị giới hạn trong các ứng dụng nắm bắt.

Tốc độ lấy mẫu và giới hạn phát hiện (LoD) với máy quang phổ FTIR tại chỗ như ReactIR™ có lợi cho sắc ký bắt sơ cấp, ghi lại nhiều điểm đo trong các đỉnh hoặc phân đoạn rửa giải nhanh trong khi phân biệt định lượng nhiều thành phần. Quang phổ FTIR nội tuyến cho phép người dùng theo dõi đầu vào nguồn cấp dữ liệu thay đổi, cũng như chất lượng nhựa và hiệu suất tuổi thọ, xác định và lấy dấu vân tay rửa giải các thành phần, đồng thời loại bỏ sự chậm trễ trong việc nhận kết quả phân tích để đưa ra quyết định dựa trên dữ liệu trong thời gian thực.

Siêu lọc (UF) thường được sử dụng trong xử lý sinh học hạ nguồn để cô đặc dòng sản phẩm loãng. Siêu lọc tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước lỗ màng hoặc ngưỡng trọng lượng phân tử. Diafiltration (DF) thường được sử dụng để trao đổi sản phẩm thành dung dịch đệm mong muốn (ví dụ: từ dung dịch đệm rửa giải thành dung dịch đệm công thức cuối cùng).

Siêu lọc và lọc (gọi chung là trao đổi bộ đệm) thường sử dụng Lọc dòng tiếp tuyến (TFF), trong đó nguồn cấp dữ liệu chảy song song với bề mặt màng thay vì vuông góc với bề mặt (Hình 3). Trao đổi bộ đệm vẫn là một hoạt động thủ công cao và hiếm khi được tối ưu hóa. Nồng độ sản phẩm thường được phân tích bằng một dạng quang phổ UV, độc lập, như một máy dò cho HPLC hoặc như một phương pháp có chiều dài đường dẫn thay đổi.

Một số thách thức phát sinh trong quá trình trao đổi bộ đệm:

• Theo dõi chính xác khối lượng trao đổi
• Dự đoán quy trình tự tin từ các mẫu lấy không đại diện
• Thời gian phản hồi bị trì hoãn hoặc tắc nghẽn của các phép đo ngoại tuyến
• Tổn thất sản phẩm tích lũy khi lấy mẫu khai thác
• Nhân rộng các lỗi trong quá trình chuẩn bị mẫu cho các phép đo UV và HPLC ngoại tuyến

Quang phổ hồng ngoại và Raman tại chỗ cho phép phân tích đồng thời nhiều thành phần, với độ chính xác và dải động cao hơn và không có độ trễ liên quan đến phân tích ngoại tuyến.  Quang phổ FTIR tại chỗ với ReactIR có thể mang lại nhiều lợi ích trong quá trình trao đổi bộ đệm:

• Định lượng đồng thời nhiều tá dược và các loại dược chất (DS) trong thời gian thực
• Kiểm soát việc sử dụng bộ đệm
• Theo dõi hiệu ứng màng
• Sử dụng nồng độ tại chỗ trực tiếp thay vì xấp xỉ thể tích
• Tăng độ chính xác nồng độ từ +/- 5% lên +/- 2%
• Loại bỏ sự chậm trễ phân tích

Các lò phản ứng tự động như EasyMax™ đẩy nhanh quá trình phát triển quy trình lên đến 80% thông qua việc thu thập dữ liệu thí nghiệm, kiểm soát chính xác tất cả các thông số quy trình quan trọng (CPP) và tích hợp các cảm biến vật lý sinh học bao gồm pH, độ dẫn điện, oxy hóa khử và oxy hòa tan (DO).

Có một số phương pháp được sử dụng theo trình tự được sử dụng để tăng độ tinh khiết của dược chất (DS). Bắt đầu với các bước làm sạch và chiết xuất sớm, tiếp theo là phương pháp thu giữ thích hợp và phân lập số lượng lớn đầu tiên, tiếp theo là giai đoạn tinh chế trung gian và sau đó là giai đoạn tinh chế cuối cùng, giai đoạn sau bao gồm sắc ký đánh bóng, lọc nano / vô trùng, kết tinh và thanh thải vi rút (Hình 4).

Bằng cách loại bỏ độ trễ liên quan đến phân tích ngoại tuyến, các phép đo FTIR tại chỗ cải thiện các bước sắc ký đánh bóng bằng cách cung cấp phản hồi ngay lập tức để định lượng và phân loại các thành phần phân đoạn bao gồm dung dịch đệm, dược chất và tạp chất trong các bước tinh chế trung gian. Điều này dẫn đến cải thiện việc cắt phân đoạn, phân biệt tổng hợp hoặc mảnh và tổng nồng độ trong thời gian thực.

Để loại bỏ virus, bất kỳ virus nào có trong hỗn dịch điều trị được gộp và bán tinh khiết đều bị cố ý làm hỏng hoặc đột ngột biến dạng thành dạng không gây bệnh, thường bằng cách thay đổi môi trường xung quanh virus. Việc kiểm soát và tinh chỉnh các thông số quy trình quan trọng (CPP) này được kích hoạt bởi các nền tảng lò phản ứng tự động với các cảm biến vật lý sinh học tích hợp. Công nghệ phân tích quy trình nội tuyến (PAT) rất hữu ích để mô tả đặc điểm của các tạp chất trong các giai đoạn sau của quá trình tinh chế vì nồng độ thường cao hơn và dễ dàng phân biệt các sản phẩm trong ma trận bán tinh khiết. 

Các phân tử liên hợp sinh học được thiết kế để tăng hiệu quả nhờ chức năng kết hợp của hai hoặc nhiều loại phân tử điều trị khác nhau. Hóa học liên hợp sinh học yêu cầu đặc tính và tối ưu hóa quy trình chi tiết. Các công cụ thông thường như ống ly tâm siêu nhỏ, cốc, đĩa nóng, thanh khuấy từ tính và pipet chuyển không còn có thể đáp ứng nhu cầu tái tạo xung quanh pH, nhiệt độ, liều lượng, trộn và các thông số khác.

Hóa học liên hợp sinh học dựa trên một loạt các bước được kiểm soát tốt theo trình tự, có thể bao gồm giảm nhóm chức năng, kích hoạt, liên hợp liên kết API với sinh học chính và bất kỳ số lượng bước rửa, dung môi hoặc trao đổi đệm nào trong suốt (Hình 5). Các nhà khoa học dược phẩm sinh học đang áp dụng công nghệ đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phát triển phân tử nhỏ, chẳng hạn như các lò phản ứng tổng hợp tự động EasyMax. EasyMax cung cấp một kiến trúc gắn kết để các thông số quy trình liên quan bao gồm pH, độ dẫn điện, oxy hóa khử, nhiệt độ, khuấy, định lượng, v.v., được kiểm soát chính xác và dữ liệu thí nghiệm được thu thập chính xác. Tự động hóa học liên hợp sinh học cung cấp tích hợp dữ liệu, tương quan sự kiện quy trình, tính toàn vẹn của thí nghiệm và các thông số mở rộng quy mô Thiết kế Thí nghiệm (DoE ). 

EasyMax cho phép đánh giá nhanh chóng và kiểm soát CPP tốt không gian DoE, bao gồm điều kiện trộn, kiểm soát nhiệt độ, chiến lược định lượng và tốc độ. Loại bỏ sự thay đổi thử nghiệm liên quan đến các phương pháp thủ công, ngoại tuyến và kiểm soát thông số quy trình quan trọng kém. FTIR tại chỗ và quang phổ Raman có thể cung cấp thông tin cơ học chi tiết trong thời gian thực, loại bỏ sự chậm trễ ngoại tuyến và không chính xác trong việc lấy mẫu.

Mục tiêu của công thức là chuyển phân tử sản phẩm từ môi trường, dung môi hoặc trạng thái vật lý khác được sử dụng để tổng hợp sản phẩm thành dạng có thể chấp nhận được cho việc sử dụng lâm sàng ở người (Hình 6). Phân tử sản phẩm được bào chế theo cách sản phẩm cuối cùng sẽ được sử dụng thông qua đường hít, tiêm hoặc uống thuốc. Tính ổn định lâu dài của sản phẩm và tá dược liên quan được đánh giá để đảm bảo liều lượng đo được và các thuộc tính chất lượng tới hạn (CQA) nằm trong thông số kỹ thuật sau khi xử lý, bảo quản và vận chuyển. Bên cạnh vô trùng, đảm bảo loại bỏ tạp chất và nội độc tố và ngăn ngừa sự phân hủy của sản phẩm thuốc (DP) là điều cần thiết trong việc duy trì sự an toàn và hiệu quả trong quá trình sản xuất và bảo quản lâu dài một liệu pháp protein.

Các sản phẩm thuốc có công thức bao gồm protein (cụ thể là mAb), polysaccharide, hệ thống hạt nano, chất hữu cơ, oligonucleotide, liệu pháp gen và nhiều loại vắc-xin. Một số loại vắc-xin sẽ được pha chế với chất bổ trợ, thường là hạt gốc nhôm hoặc nhũ tương hữu cơ. Đặc biệt, công thức vắc-xin và tổng hợp chất bổ trợ là quy trình làm việc được định vị tốt để tạo lợi thế cho các máy trạm lò phản ứng song song tự động, số hóa quy trình làm việc và công nghệ phân tích quy trình trực giao (PAT) Tích hợp. Với PAT thời gian thực, có được nhiều kiến thức hơn về quy trình, thay vì chỉ phân tích điểm bắt đầu và điểm cuối.

Các hệ thống lò phản ứng song song như EasyMax kiểm soát tất cả các thông số quy trình quan trọng và tích hợp các công cụ PAT nội tuyến như ReactIR, ReactRaman™, ParticleTrack, EasyViewer, trong số các cảm biến vật lý sinh học khác. Các công nghệ này thường được sử dụng trong công thức để mô tả tính ổn định của dược chất và sản phẩm thuốc, nồng độ cuối cùng, tổng hợp bổ trợ, trùng hợp, đóng gói, hấp phụ và các sự kiện hạt khác.

Nếu bạn có thắc mắc hoặc cần trợ giúp về ứng dụng kỹ thuật của mình, đội ngũ Tư vấn ứng dụng kỹ thuật của chúng tôi sẵn sàng hướng dẫn bạn đi đúng hướng.