Následné zpracování v biofarmacii

Downstream processing (DSP) je řada jednotkových operací po dokončení růstu a expanze buněk a po dokončení výroby nebo syntézy léčivých látek nebo jiných složek. Následné zpracování má za cíl izolovat, vyčistit a koncentrovat dříve syntetizovanou léčivou látku (DS) nebo jiný produkt z hromadně rostoucí matrice. Historicky se investovalo do zlepšení výtěžku a titru v předcházejícím proudu, čímž se vývoj biologických léků stal ekonomičtějším. V předchozích letech nebyly navazující procesy řešeny na stejné úrovni a nyní vyžadují další optimalizaci.

Biofarmaceutické následné zpracování se týká získávání a čištění léčivé látky z přírodních zdrojů, jako jsou zvířecí nebo bakteriální buňky. Biofarmaceutický DSP je použitelný v monoklonálních protilátkách (mAb) nebo proteinových procesech a při výrobě oligonukleotidů, polysacharidů, různých vakcín, biokonjugátů, genových terapií a produktů buněčné terapie.

Následné zpracování může zahrnovat počáteční formulace, což znamená přechod od DS k léčivému přípravku (DP). Mezi důležitá hlediska patří řízení a měření atributů kvality produktu, více parametrů procesu, zdrojů a množství nečistot, odpadních toků a biologických rizik.

Aktivity DSP jsou prováděny v laboratorním měřítku vývoje procesů, pilotního a výrobního měřítka a jsou podporovány týmy procesní analytické technologie (PAT) a výrobní vědy a technologie (MSAT), které se zaměřují na optimalizaci procesů, rozšiřování a odstraňování problémů. Srovnatelné následné zpracování v měřítku objevitelské biologie nebo v raných fázích vysoce výkonného screeningu cílů není tak běžné, i když může být provedeno podobně. v zásadě.

Tato příručka pojednává o tom, jak vědci využívají procesní analytické technologie (PAT) k transformaci každodenních pracovních postupů a výraznému zlepšení navazujících procesů. Témata zahrnují:

• Monitorování koncentrace proteinů
• Optimalizace procesu výměny vyrovnávací paměti
• Složení, distribuce a morfologie adjuvans vakcíny
• Automatizace virové inaktivace
• Vývoj biokonjugačního procesu

• Předběžná úprava: 
  Lýza povrchově aktivní látky, absorpce v organické fázi: Separace produktu lýzou obvykle sleduje základní cíl: účinně narušit sekvestrační struktury obsahující léčivou látku nebo produkt a vytvořit fyzické oddělení mezi veškerými nečistotami, nečistotami a léčivou látkou. Lýza kyselinou nebo povrchově aktivní látkou se téměř výhradně používá u bakteriálních nebo kvasinkových kultur. Podobně absorpce a zachycení produktu v organické fázi je nejběžnější u bakteriálních expresních a výrobních systémů a příležitostně se používá pro kvasinkové systémy.
  Flokulace a srážení: Jedná se o metody manipulace se systémem aktivních částic k dosažení cíle separace. Flokulace se obecně používá jako metoda přípravy před filtrací nebo centrifugací. Aplikace flokulace zajišťuje vysoký hmotnostní tok přes filtrační jednotky a také efektivní a nákladově efektivní separaci buněčného materiálu od supernatantu. Mohou být vyžadovány další metody odstraňování flokulantů a ověřovací protokoly. Srážení je aktivní manipulace s částicemi spuštěná změnou parametrů, jako je rozpouštědlo, a iontová síla za účelem snížení rozpustnosti.
• Odstřeďování: Odstřeďování, které je široce přijímáno jako metoda separace v biologickém zpracování, je běžnou a hlavní technikou používanou k nerozlišující separaci zbytků částic na základě hmotnosti nebo molekulové hmotnosti jako funkce rychlosti bubnu, plnění a rychlosti vypouštění. Běžné průmyslové odstředivky odstraňují značné množství (až 99 %) hmotnosti částic při velikosti částic od 5 μm a někdy až po 1 μm pro vysoce optimalizované procesy. Navzdory této účinnosti mohou odstředivky stále předávat problematická množství mikročástic, a zejména nanočástic, do navazujících operací, které budou vyžadovat další zpracování. Vzhledem k tomu, že bioprocesy běžně dosahují vysoké až velmi vysoké celkové biomasy (mikročástice a nanočástice) a proměnlivé konečné hustoty životaschopných buněk, mohou propustnost procesu omezit také pevné centrifugační kapacity, které nejsou obecně považovány za praktické pro kontinuální biologické zpracování.
  
• Hloubková filtrace, duté vlákno: V závislosti na povaze produktu a procesu metody sklizně obvykle zahrnují hloubkovou filtraci (obr. 1-1) nebo filtry z dutých vláken (obr. 1-2). Při hloubkové filtraci je směs obsahující částice čerpána přes membránu nebo jiné rozhraní, aby se oddělily nečistoty od produktu v kapalné suspenzi. Filtry z dutých vláken se používají v nepřetržitých operacích biologického zpracování k odstranění léčivé látky exprimované supernatantem (DS) a zároveň dočasně zachycují část biomasy v dutém vlákně před zpětným proplachem protiproudým médiem. Separace akustického pole a toku je další nově vznikající technikou, která se v současné době vyskytuje převážně ve vývojových prostředích. S různými režimy provozu a konfigurace mohou výsledky:
  • Nemodulujte žádnou separaci buněk nebo částic (obr. 1-3a)
  • Vyberte separaci buněk nebo částic z přiváděcích toků do nového záchytného proudu s odkloněním nebo separací druhé populace částic (obr. 1-3b)
  • Přemístit celý systém částic do nového proudu a/nebo přerozdělit tekutiny, případně do recirkulace (obr. 1-3c)
  • Hydrodynamická interakce, kde může dojít k modulované směsi výběru částic a výměny tekutin (obr. 1-3d)

Inline analyzátory velikosti částic, jako je ParticleTrack™ s technologií FBRM®, měří akumulaci částic a distribuci velikosti buněčného buněčného vývaru, který vstupuje do filtrů nebo z nich uniká, a mohou poskytovat korelaci kapacity nebo řízení zpětné vazby pro minimalizaci narušení procesu. EasyViewer™ s Image2Chords™ provádí analýzu obrazu a extrahuje akumulaci částic, distribuci velikosti a morfologii z časově rozlišených vložených snímků procesu. EasyViewer, umístěný nad nebo pod filtry, může poskytovat korelaci kapacity nebo řízení zpětné vazby, ale je nejcennější, když se používá pro analýzu hlavních příčin, charakterizaci a morfologii.

Způsob a strategie záchytu se mírně mění v závislosti na povaze cílové molekuly. Protilátky jsou zachycovány afinitními pryskyřicemi, jako je protein A a protein G, stejně jako některými dalšími selektivně navrženými metodami. Neprotilátkové proteiny a oligonukleotidy jsou často zachyceny iontovou výměnnou chromatografií (IEX). Produkty, jako jsou polysacharidy a složité glykanové struktury, jsou často zachycovány hydrofobní interakční chromatografií (HIC) nebo chromatografií s reverzní fází (RPC).

Mezi hlavní cíle měření během chromatografie patří maximalizace vazebné kapacity produktu na kolonu, měřená jako hmotnost produktu vloženého do kolony (zatížení kolony), minus hmotnost produktu, který unikne z kolony (známý jako "průlom"). UV je nejběžnější metoda měření produktů, která se hojně používá pro měření bílkovin a DNA. Možné jsou i alternativní metody měření produktů a neproduktů. Inline FTIR spektroskopii lze použít ke kvantifikaci a rozlišení složek, jako jsou povrchově aktivní látky, běžné pufry cukru nebo aminokyselin, lipidy, konjugované produkty a dokonce i produkty s proměnlivou konformační strukturou, jako jsou fragmenty, monomery nebo agregované formy mAb. FTIR se nejčastěji používá jako doplněk k UV záření, když samotné UV záření není schopno měřit důležité složky neproteinové/nenukleové kyseliny.

• Afinitní chromatografie (protein A/G) je chromatografická metoda prvního průchodu (obvykle nazývaná protein A nebo ProA), která odděluje a koncentruje požadovaný produkt (obvykle mAb) od jiných rozpustných materiálů reverzibilní vazbou nebo udržením cílového proteinu v koloně prostřednictvím specifických vazebných interakcí (obrázek a), zatímco ostatní složky "eluují" kolonou (obrázek b). Selektivní eluce následuje po sérii promývacích kroků a poté se uvolní cílová molekula (obrázek c). 
  
  

• Iontoměničová chromatografie (IEX) odděluje a koncentruje sledovaný produkt (proteiny, oligonukleotidy a další) od jiných rozpustných materiálů reverzibilní vazbou nebo zadržením cílové molekuly k koloně na základě síly elektrostatické interakce s materiálem v pevné fázi (obr. 2d), zatímco ostatní složky "eluují" kolonou. IEX se pravidelně používá jako doplňková nebo alternativní metoda čištění, a proto není omezen na aplikace zachycování.

Rychlost vzorkování a mez detekce (LoD) pomocí in-situ FTIR spektrometrů, jako je ReactIR™ , jsou výhodné pro primární záchytnou chromatografii, která zaznamenává více měřicích bodů v rychle eluujících pících nebo frakcích a zároveň kvantitativně diferencuje více složek. Inline FTIR spektroskopie umožňuje uživatelům sledovat proměnlivé vstupy vstupu, stejně jako kvalitu pryskyřice a životnost po celou dobu životnosti, identifikovat a odstraňovat otisky prstů komponent a eliminovat zpoždění při přijímání analytických výsledků, aby bylo možné činit rozhodnutí založená na datech v reálném čase.

Ultrafiltrace (UF) se často používá v následném biologickém zpracování pro koncentraci zředěného toku produktů. Ultrafiltrace separuje molekuly v roztoku na základě velikosti pórů membrány nebo mezní molekulové hmotnosti. Diafiltrace (DF) se nejčastěji používá k výměně produktu do požadovaného pufru (např. z elučního pufru do pufru konečné formulace).

Ultrafiltrace a diafiltrace (společně známé jako výměna pufru) obvykle používají tangenciální průtokovou filtraci (TFF), kde přívod proudí paralelně s povrchem membrány, nikoli kolmo k povrchu (obr. 3). Výměna vyrovnávací paměti zůstává vysoce manuální operací, která je jen zřídka optimalizována. Koncentrace produktu se obecně analyzuje formou UV spektroskopie, a to buď samostatně, jako detektor pro HPLC, nebo jako metoda s proměnlivou délkou dráhy.

V procesu výměny nárazníkových rezerv vyvstává několik problémů:

• Přesné sledování výměnných objemů
• Spolehlivá predikce procesu z nereprezentativních uchopovacích vzorků
• Zpožděná nebo úzká doba odezvy offline měření
• Kumulativní ztráty produktu při extraktivním vzorkování
• Šíření chyb při přípravě vzorků pro offline UV a HPLC měření

In-situ infračervená a Ramanova spektroskopie umožňují analyzovat více komponent současně, s větší přesností a dynamickým rozsahem a bez zpoždění spojených s offline analýzou. In-situ FTIR spektroskopie s ReactIR může nabídnout mnoho výhod při výměně pufrů:

• Kvantifikujte více pomocných látek a druhů léčivých látek (DS) současně v reálném čase
• Řízení využití vyrovnávací paměti
• Monitorování membránových efektů
• Používejte přímou koncentraci in-situ spíše než diaobjemové aproximace
• Zvýšení přesnosti koncentrace z +/-5 % na +/-2 %
• Eliminujte analytická zpoždění

Automatizované reaktory, jako je EasyMax™, urychlují vývoj procesů až o 80 % díky zachycení experimentálních dat, přesnému řízení všech kritických procesních parametrů (CPP) a integraci biofyzikálních senzorů včetně pH, vodivosti, redoxu a rozpuštěného kyslíku (DO).

Existuje několik metod používaných v sekvenci, které se používají ke zvýšení čistoty léčivé látky (DS). Začíná se časnými kroky čiření a extrakce, po nichž následuje vhodná metoda záchytu a první hromadná izolace, po níž následují střední a poté konečné fáze purifikace, z nichž druhá zahrnuje lešticí chromatografii, nano/sterilní filtraci, krystalizaci a virovou clearance (obr. 4).

Odstraněním zpoždění spojených s offline analýzou zlepšují měření in-situ FTIR kroky lešticí chromatografie tím, že poskytují okamžitou zpětnou vazbu pro kvantifikaci a specifikaci složek frakcí včetně pufrů, léčivých látek a nečistot během mezikroků čištění. To má za následek lepší řezy frakcí, diskriminaci agregátů nebo fragmentů a celkovou koncentraci v reálném čase.

Pro odstranění viru je jakýkoli virus přítomný ve sloučené a polopurifikované terapeutické suspenzi záměrně poškozen nebo náhle deformován do nepatogenní formy, obvykle změnou prostředí kolem viru. Řízení a zdokonalování těchto kritických procesních parametrů (CPP) je umožněno automatizovanými reaktorovými platformami s integrovanými biofyzikálními senzory. Inline procesní analytická technologie (PAT) je užitečná pro charakterizaci nečistot v pozdějších fázích čištění, protože koncentrace jsou obecně vyšší a je snazší rozlišit produkty v poločištěné matrici. 

Biokonjugované molekuly jsou navrženy tak, aby měly zvýšenou účinnost umožněnou kombinovanou funkcí dvou nebo více různých terapeutických typů molekul. Chemie biokonjugátů vyžaduje podrobnou charakterizaci a optimalizaci procesů. Konvenční nástroje, jako jsou mikrocentrifugační zkumavky, kádinky, horké desky, magnetická míchací zařízení a přenosové pipety, již nejsou schopny splnit požadavky na reprodukovatelnost týkající se pH, teploty, dávkování, míchání a dalších parametrů.

Biokonjugační chemie se opírá o řadu dobře kontrolovaných kroků v sekvenci, které mohou zahrnovat redukci funkční skupiny, aktivaci, konjugaci API-linkeru s primárním biologickým a libovolný počet kroků promývání, rozpouštědla nebo výměny pufru v průběhu (obr. 5). Biofarmaceutičtí vědci přijímají technologie, které se již hojně používají ve výzkumu a vývoji malých molekul, jako jsou automatizované reaktory pro syntézu EasyMax. EasyMax poskytuje soudržnou architekturu, takže relevantní parametry procesu včetně pH, konduktivity, redoxu, teploty, míchání, dávkování atd. jsou přesně řízeny a experimentální data jsou přesně zachycena. Automatizace biokonjugační chemie zajišťuje integraci dat, korelaci procesních událostí, experimentální integritu a parametry škálování návrhu experimentu (DoE ). 

EasyMax umožňuje rychlé posouzení a jemné řízení CPP prostoru DoE, včetně podmínek míchání, regulace teploty, dávkovacích strategií a rychlostí. Eliminujte experimentální variabilitu spojenou s offline, manuálními metodami a špatným řízením kritických parametrů procesu. In-situ FTIR a Ramanova spektroskopie mohou poskytnout podrobné mechanické informace v reálném čase, čímž se eliminují zpoždění offline a nepřesnosti vzorkování.

Cílem formulace je převést molekulu produktu z prostředí, rozpouštědla nebo jiného fyzikálního stavu použitého k syntéze produktu do formy, která je přijatelná pro humánní klinické podání (obr. 6). Molekula produktu je formulována podle toho, jak bude konečný produkt použit inhalací, injekcí nebo perorálním podáním. Posuzuje se dlouhodobá stabilita produktu a souvisejících pomocných látek, aby se zajistilo, že naměřená dávka a kritické kvalitativní atributy (CQA) jsou po zpracování, skladování a přepravě v rámci specifikace. Kromě sterility je pro zachování bezpečnosti a účinnosti při výrobě a dlouhodobém skladování proteinového terapeutika zásadní zajištění odstranění nečistot a endotoxinů a prevence degradace léčivého přípravku (DP).

Mezi formulované léčivé přípravky patří proteiny (konkrétně mAb), polysacharidy, nanočásticové systémy, organické látky, oligonukleotidy, genové terapie a mnoho typů vakcín. Některé vakcíny budou formulovány s adjuvans, obvykle částicemi na bázi hliníku nebo organickou emulzí. Formulace vakcíny a zejména adjuvantní syntéza jsou pracovní postupy s dobrou pozicí pro využití automatizovaných paralelních reaktorových pracovních stanic, digitalizace pracovních postupů a ortogonální procesní analytické technologie (PAT) integrace. Díky PAT v reálném čase se získá mnohem více znalostí o procesu, než se pouze analyzovat počáteční a koncové body.

Paralelní reaktorové systémy, jako je EasyMax , řídí všechny kritické parametry procesu a integrují inline nástroje PAT, jako jsou ReactIR,ReactRaman™, ParticleTrack, EasyViewer a další biofyzikální senzory. Tyto technologie se často používají při formulaci k charakterizaci stability léčivých látek a léčivých přípravků, konečné koncentrace, adjuvantní syntézy, polymerací, zapouzdření, adsorpcí a dalších částicových událostí.

Pokud máte dotazy nebo potřebujete pomoc s vaší technickou aplikací, náš tým konzultantů pro technické aplikace je připraven vás nasměrovat správným směrem.