Syntéza oligonukleotidů

Oligonukleotidy nebo oligonukleotidy jsou krátké jednovláknové nebo dvouvláknové segmenty nukleových kyselin, které jsou spojeny dohromady za vzniku jednořetězcových biologických polymerů. Jednotlivé nukleotidové báze lze považovat za ekvivalentní monomerům, které tvoří klasické chemické polymery. Nukleotid se skládá ze tří částí: báze obsahující dusík, molekuly cukru s pěti uhlíky (tyto dvě části jsou nukleosid) a jedné nebo více fosfátových skupin. Alternativně se nukleotidy mohou skládat z nepřirozených nebo nekanonických bází. Mezi běžné příklady patří LNA (uzamčené nukleové kyseliny), Morpholino a strukturálně modifikované báze nebo páteře. 

Složitá vazba nukleotidů tvoří biologicky kritické biomolekuly RNA a DNA. V případě RNA, což je jednořetězcový biopolymer, je cukrem ribóza. V DNA obsahuje dvouřetězcová molekula cukr deoxyribózu. Právě krátké sekvence deoxyriobonukleových kyselin a ribonukleových kyselin jsou stavebními kameny důležitých oligonukleotidů. Specifické vazby těchto nukleotidů vytvářejí cílové biomolekuly, které se používají v biologických, lékařských, forenzních a klinických aplikacích. 

Oligonukleotidy mohou být tvořeny buď enzymaticky štěpením větších biomolekul, nebo cílenou chemickou syntézou. V druhém případě je syntéza organonukleotidů chemickým procesem, při kterém jsou syntetizovány nukleosidfosforamidity – klíčový monomerní prvek oligonukleotidů. Nukleosidfosforamidity (také známé jako nukleosidy nebo amidity) jsou samy o sobě deriváty přírodních nebo syntetických nukleosidů.

Nukleotidy jsou tedy složené molekuly sestávající z kovalentně vázaného nukleosidu a fosfátové skupiny. Nukleotidy jsou spojeny ve specifické sekvenci za vzniku požadovaného produktu. Oligonukleotidy se tedy skládají z krátkých segmentů nukleových kyselin, které jsou spojeny dohromady a vytvářejí jednořetězcové biologické polymery ("-mery"). Protože většina oligonukleotidů (oligonukleotidů) se obvykle skládá až z 20 spojených nukleotidů (i když je jich možné i více), lze je považovat za malé biofarmaceutické molekuly. 

Stejně jako jiné farmaceuticky relevantní malé molekuly, syntéza oligonukleotidů vyžaduje pečlivou kontrolu s ohledem na teplotu, pH, kvalitu substrátů atd. Vzhledem k typickým metodám používaným při syntéze oligonukleotidů platí, že čím delší a komplikovanější je nukleotidová sekvence, tím obtížnější je splnit cíle v oblasti výtěžnosti, čistoty a nákladů. Procesní analytické technologie (PAT) jsou užitečné při dosahování těchto cílů.

Oligonukleotidové primery a sondy

Nejběžnější použití syntetických oligonukleotidů je jako relativně krátké sondy a primery (až 30-mer) v široké škále aplikací. To zahrnuje syntézu nukleotidové sekvence, která je párová nebo "reverzně doplňková" k většímu cílovému řetězci DNA nebo RNA (cílová sekvence). Jako primery se oligonukleotida obvykle používají k iniciaci enzymatických reakcí, např. k vytvoření milionů až miliard kopií krátké nebo dlouhé cílové sekvence. Známými příklady jsou polymerázová řetězová reakce (PCR) nebo Sangerova metoda sekvenování. Aplikace oligoprimerů zahrnují sekvenování DNA, genovou expresi, klonování a molekulární diagnostiku.

Oligonukleotidy jako sondy slouží k identifikaci a navázání se na konkrétní cílovou sekvenci DNA nebo RNA za účelem potvrzení přítomnosti této sekvence v daném materiálu. Aplikace využívající oligosondy zahrnují blotovací procedury, jako je northern blotting (pro RNA) nebo southern blotting (pro DNA), jako fluoroforově konjugované sekvence v mikročipech, které detekují změny v genové expresi nebo se používají při screeningu genetických onemocnění nebo k identifikaci specifických patogenů (molekulární diagnostika).

Oligoterapeutika/genová terapie

V terapeutických aplikacích antisense oligonukleotidy (ASO), obecně 20 až 30-mer druhy, využívají přirozenou biologii a usnadňují inhibici genů nebo umlčení (zničení) genů nežádoucích nebo nadměrně aktivních sekvencí RNA, což zase blokuje expresi určitých poškozených nebo nadměrně aktivních proteinů, které mohou způsobovat nebo usnadňovat onemocnění. Výzkum terapeutik na bázi oligonukleotidů se nesmírně zintenzivnil a v posledních letech bylo schváleno několik léků.

Budoucí použití syntetických nukleotidů: Zkoumání modalit DNA a RNA vakcín

Ačkoli se nejedná o oligonukleotid podle přísné definice, vakcinační produkty na bázi DNA nebo RNA, jako jsou mRNA nebo plazmidové nebo vektorové nukleové kyseliny, o délce mnoha stovek nebo tisíců bází, představují přední linii vyvíjejících se technologií syntetických nukleotidů.

V konceptu by se DNA nebo RNA vakcíny obešly bez všech nepotřebných nebo škodlivých částí patogenní bakterie nebo viru. Místo toho by taková vakcína na bázi nukleových kyselin obsahovala kód jen pro několik částí DNA nebo RNA patogenu. Tyto řetězce DNA nebo RNA instruují vlastní tělo pacienta, aby produkovalo jednotlivé antigeny nebo fragmenty patogenu, a poté podporují imunitní odpověď na antigen. S moderními výpočty a modelováním in silico jsou tyto modality oligonukleotidové vakcíny schopny být vytvořeny během několika dnů nebo týdnů a mají vhodnou cílovou sekvenci, podle které lze navrhovat. Vakcíny na bázi nukleových kyselin se jako platformová technologie spoléhají na standardní sady stavebních bloků nebo surovin, které umožňují nesčetné množství kombinací téměř podle libosti. Jako takové jsou také relativně levné a snadno se vyrábějí ve srovnání s tradičními způsoby očkování. Pro biofarmaceutický průmysl se však stále jedná o zrající paradigma a neustále se řeší nové výzvy, z nichž některé jsou jedinečné pro oligo a produkty s dlouhou nukleovou kyselinou a některé jsou sdíleny s jinými bioterapeutickými modalitami.

Syntéza oligonukleotidů je chemický proces, při kterém jsou nukleotidy specificky spojeny za vzniku požadovaného sekvenovaného produktu. Kontinuální syntéza na pevné fázi pomocí kolony s plněným ložem se běžně používá pro výrobu oligonukleotidů. V některých případech se používá dávková suspenzní reakce.

Proces výroby cílové oligomerní sekvence probíhá v několika cyklech, které se skládají ze specifických syntetických kroků. V prvním kroku se odstraní 4,4' dimethoxytritylová ochranná skupina na nukleotidu podporovaném pevnou fází. Dále se aktivuje fosforoamiditický monomer a rychle se spojí přes volnou hydroxylovou skupinu na nukleotidu vázaném na pevnou fázi, aby se vytvořil dinukleosid, který obsahuje fosfitovou triesterovou vazbu. Ve třetím kroku se oxiduje triester fosfitu. V posledním kroku (prvního cyklu) jsou všechny nezreagované podporované nukleosidy "uzavřeny" acetylací, aby se zabránilo tvorbě nežádoucích vedlejších produktů v dalším cyklu.

Délka oligonukleotidu je definována počtem nukleotidů, které tvoří sekvenci. Pokud jde o názvosloví, sekvence dlouhá 20 nukleotidů je definována jako "20-mer". Délka oligo je rozhodující pro různé aplikace. Například short-mer oligonukleotidy se běžně používají při PCR, zatímco velmi dlouhé sekvence (200 bází a více) se používají v náročných aplikacích, jako je klonování nebo editace CRISPR. Syntéza specializovaných oligonukleotidů s dlouhým obsahem je náročná a dodání čisté sekvence vyžaduje jak efektivní řízení syntézy, tak purifikační metody. V průměru je většina oligonukleotidů kratší než 60 merů. Vzhledem k tomu, že způsob, jakým jsou oligonukleotidy syntetizovány, vyžaduje opakující se reakční cykly, které přidávají další nukleotidy, čím delší je požadovaná sekvence, tím větší je pravděpodobnost tvorby nežádoucích vedlejších produktů – což může zahrnovat deleční nebo zkrácené sekvence.

V závislosti na kvalitě, množství a nákladových cílech se používají různé metody čištění. Například oligonukleotidy bez soli mají odstraněny vedlejší produkty chemické syntézy, ale porucha sekvence zůstává. Tyto odsolené oligotidy jsou z hlediska nákladů a účinnosti užitečné pro rutinnější aplikace, jako je PCR. U náročnějších aplikací chromatografie na reverzní fázi odstraňuje nežádoucí sekvence z produktu, ale ne tak účinně jako gelová elektroforéza, která dodává vysoce čištěný sekvenční produkt, ale obvykle v omezeném množství. Zejména u klinických obav je zachování výtěžku všudypřítomným problémem během syntézy i následného zpracování.

Klasická chemická syntéza na pevné fázi obvykle zahrnuje použití polymeru nebo specializovaných skleněných kuliček, které nejsou ovlivněny reakčními podmínkami. Tyto kuličky mohou být obsaženy ve kolonách, ve kterých protékají reaktanty, činidla a rozpouštědla. Účelem kuliček je fungovat jako platforma, na které jsou molekuly substrátu kovalentně vázány a poté na ně působí chemickou reakcí. Ochrana a deprotekce určitých funkčních skupin na molekule substrátu je klíčem k syntéze a k zajištění získání požadovaného produktu. Produkt syntézy se odstraní chemickým přerušením vazby mezi ním a podkladovou polymerní kuličkou.

Syntéza na pevné fázi je účinná při rychlém získávání vyčištěného produktu, protože nečistoty a nezreagované materiály se v různých krocích syntézy odplavují. Kromě toho je celá syntéza přístupná počítačovému řízení a automatizaci. Syntéza na pevné fázi je nejběžnější metodou používanou pro vlastní produkci peptidů a oligonukleotidů. V druhém případě je zapotřebí mnoho opakujících se cyklů k postupnému přidávání nukleotidů, aby se vytvořila cílová sekvence.

Syntéza oligonukleotidů na pevné fázi představuje mnoho výzev, včetně snižování výtěžku s rostoucí délkou řetězce. Sterická překážka je často považována za mechanismus špatného výnosu, kdy jeden nebo více pramenů fixovaných na povrchu může interferovat s každým následným prodloužením svého souseda.

K řešení těchto a dalších výzev existují různé metody syntézy oligonukleotidů v kapalné fázi.

Mnoho základních kroků syntézy v kapalné fázi je analogických se syntézou v pevné fázi. Hlavní rozdíl spočívá v tom, že syntéza probíhá v roztoku nebo v kapalné fázi (tj. NENÍ fixována na žádný povrch). Protože tento proces stále probíhá v cyklech, existuje několik doprovodných metod pro odstranění nezreagovaných činidel při zachování prodlouženého oligonukleotidového produktu.

Technika použití PCR pro syntézu oligonukleotidů byla zavedena v roce 1985. V roce 1986 bylo představeno první použití enzymu Taq polymerázy . Přesto se průmyslová syntéza oligonukleotidů potýkala s přijetím enzymatické syntézy oligonukleotidů ze tří klíčových důvodů:

1. Enzymatická syntéza vyžaduje templát, na kterém může fungovat enzym DNA polymeráza rozšiřující sekvenci. Syntéza oligonukleotidů de novo enzymem jako taková nemůže fungovat bez templátu . 
   
2. Mnoho oligoprimerů, sond nebo ASO terčů, které by mohly být použity jako templát, je samo o sobě příliš krátké na to, aby účinně primovalo a spustilo syntézu polymerázy.
   
3. Mnoho umělých terapeutických oligonukleotidů je chemicky modifikováno tak, aby usnadňovaly prodloužený poločas rozpadu a zvýšenou funkčnost v humorálním oběhu, což jsou modifikace, které téměř nebo úplně zakazují jejich interakci s evolučně odvozenými polymerázami (to se většinou týká delších oligotypů , jako je mRNA).

Pokračuje výzkum a vývoj  upravené polymerázy schopné syntézy ASO pomocí chemicky modifikovaných nukleotidových zásob

Složitá povaha syntézy oligonukleotidů by mohla těžit z vyššího stupně pozorování procesu, pochopení reakčních mechanismů a odchylek a použitelných kontrol. Analýzy v reálném čase pomocí PAT by mohly minimalizovat nebo eliminovat potřebu časově náročných nebo pomalých offline analýz.

• ReactIR a ReactRaman lze použít ke sledování kinetiky reakcí syntézy oligonukleotidů a srovnání mezi běhy.
• Přesné řízení teploty, míchání a dávkování pomocí automatických reaktorů pro chemickou syntézu EasyMax spolu s integrací reakčních trendů a mechanismů usnadňuje sběr dat a snadnou správu prostřednictvím softwaru iC 

Monitorovací schopnosti in-situ FTIR a Ramanovy spektroskopie v reálném čase pro chemii prováděnou za podmínek proudění jsou dobře prokázány a jsou použitelné v klíčových krocích syntézy oligonukleotidů.

• Syntéza modifikovaného fosforamiditu a přírodních nukleotidových monomerů pro zajištění struktury a čistoty
• Zmírnit rizika způsobená mechanickými problémy syntezátoru nebo nesprávnými vstupy roztoku
• Track coupling reakce fosforoamiditového monomeru na volnou hydroxylovou skupinu na nukleotidu vázaném na pevnou fázi
• Stopová denaturace a žíhání komplementárních oligonukleotidů ve dvouřetězcové syntéze.
• Určit kinetiku chemických reakcí v procesu žíhání – identifikovat a sledovat meziprodukty nebo neznámé
• Korelace změn ve spektrech s klíčovými body v procesu
• Použitelné pro SPS, dávkovou a konvergentní syntézu peptidů (SPS + fáze roztoku)

Dobře kontrolované prostředí syntézy je životně důležité pro zajištění výsledku reakce. Automatizované reaktorové platformy poskytují jistotu a konzistenci napříč všemi kritickými parametry procesu současně.

• Reprodukovatelné prostředí je základem dobré vědy
• Pochopte dopad procesních parametrů na kritické atributy kvality kombinací dat ze senzorů a inline PAT
• Protokol a automatizace zmírňují manuální rizika nebo nekonzistence
• Usnadňují vyhledávání a strukturovaná data
• Spolehněte se na desítky let citací a důkazů pro rozšíření
• Použitelné pro SPS, dávkovou a konvergentní syntézu peptidů (SPS + fáze roztoku)