Biokatalýza a enzymatická katalýza

Biokatalýza neboli enzymatická katalýza využívá biologicky aktivní složky ke katalýze chemických transformací. Biokatalýza usnadňuje spektrum primárně uhlíkocentrických reakcí v prostředích od bezbuněčných, plně in vitro až po fermentací zprostředkované procesy v živé buněčné kultuře.

Biokatalýza představuje užitečnou alternativu k tradiční chemické katalýze z několika důvodů. Reakce enzymatického biokatalyzátoru:

• Jsou vysoce chemo-, regio- a enantiospecifické
• Často mají rychlou kinetiku
• Provoz v mírnějších podmínkách než chemické katalyzátory
• Eliminovat problém odpadu, toxicity a nákladů na kovové katalyzátory
• Snížit energetické nároky spojené s chemickými reakcemi

Řízené inženýrství biokatalyzátorů zlepšuje stabilitu v rozpouštědlech při zvýšených teplotách, což umožňuje široké přijetí biokatalýzy ve farmaceutickém, chemickém, biopalivovém a potravinářském průmyslu.

Stáhněte si tuto bezplatnou bílou knihu a zjistěte, jak PAT a datová věda ve výzkumu, vývoji a výrobě biokatalytických procesů umožňuje rychlou identifikaci neživotaschopných tras syntézy, měření kinetických reakcí a screening a řízení procesních parametrů.

Biokatalýza je spojena se "zelenou", udržitelnou a nákladově efektivní výrobou chemických produktů. Ve srovnání s chemokatalýzou nabízejí biokatalyzátory inherentní výhody pro syntézu, včetně:

• Významná rozmanitost sloučenin, ať už z přírodních nebo geneticky upravených zdrojů, pro řešení široké škály chemických transformací
• Specifičnost biokatalytických reakcí, které zmírňují potřebu specifických klasických strategií chemické syntézy/zpracování, jako je použití blokovacích/deblokovacích skupin, separace enantiomerních směsí a work-up k odstranění nežádoucích vedlejších produktů
• Zjednodušení infrastruktury a požadavků na suroviny, protože mnoho biokatalytických procesů lze provádět v reakcích v jedné nádobě a eliminuje reakční kroky vyžadované tradiční chemickou katalýzou  

Enzymy používané v biokatalýze mají důležité a často využívané schopnosti, mezi které patří:

A) Vazba ve funkční skupině nebo místně specifickém a rozpoznání cíle jiných biologických látek nebo malých molekul

B) Podporovala asociaci nebo vytěsnění jiných biologických látek nebo malých molekul

C) Strukturální nebo elektrostatické vlastnosti, které usnadňují transport iontů

D) Uspořádané k neuspořádaným strukturním přeměnám a tím i různorodé katalytické činnosti

E) Allosterické nebo nepřímé modifikace, které indukují nebo potlačují aktivitu enzymů

Výzkum vylepšených nebo modifikovaných rekombinantních biokatalyzátorů nadále rozšiřuje jejich použitelnost v drsné chemii, zlepšuje rozsah reakcí, robustnost enzymů a opakovanou použitelnost. Přírodní a inženýrské biokatalyzátory jsou nyní k dispozici pro provádění klíčových chemických transformací, jako je tvorba CC vazeb, amidových vazeb, tvorba chirálních aminů a C-H funkcionalizace.

Rozsah enzymů používaných pro biotransformace je mimořádně široký a zasahuje prakticky do všech průmyslových odvětví, včetně potravinářského, farmaceutického, textilního, biopalivového, papírenského, chemického a domácího zboží. Při syntéze čistých chemikálií, léčiv a příbuzných meziproduktů se biokatalýza (tj. enzymatická katalýza nebo enzymy zprostředkovaná katalýza) rychle rozvinula jako technologie. Enzymy jsou k dispozici pro různé biotransformace, jako jsou oxidace, redukce, adice a eliminace. 

Šest hlavních tříd enzymů a příklady použití: 

1. Oxidoreduktázy katalyzující molekulární oxidace a redukce. Enzymy monooxygenázy s molekulárním kyslíkem umožňují tvorbu vazeb C-O a specifické enzymy byly vyvinuty tak, aby umožňovaly oxidaci alkoholů, ketonů, aldehydů a aminů. Z hlediska redukcí umožňují syntézu enantiospecifických alkoholů ketoreduktázy (KREDS) a dehydrogenázy. Jiné enzymy mohou redukovat vazby, jako je C=N, a přeměňovat nitrily na aminy. 

2. Transferázy jsou užitečné pro přenos funkčních skupin z jedné molekuly do druhé. Kináza a fosfatázy (adice a odstraňování fosfátů) jsou zvláště důležité pro molekulární signální kaskády, replikaci DNA, transkripci RNA a další funkce. Existuje také mnoho biologicky významných transferáz, které plní funkce, jako je přeměna ketonů nebo aldehydů na aminy, a které tak mohou činit stereoselektivně.

3. Hydrolázy katalyzují hydrolýzu různých substrátů. Nukleázy nebo proteázy jsou plodné a nezbytné při recyklaci nukleových kyselin a peptidů. Hydrolázy jako lipáza, proteáza a acyláza působí jako katalyzátory pro Michaelovy 1,4-adice, široce používané k tvorbě vazeb CC a uhlík-heteroatomů.

4. Lyázy obecně katalyzují reakce tvorbou nebo eliminací dvojných vazeb. Na rozdíl od substituční reakce hydrolázami, karboxylázovými nebo dekarboxylázovými reakcemi jsou ve farmaceutické biokatalýze běžné reakce pro přidání nebo odstranění_CO2, stejně jako C-N lyázy, které lze použít k výrobě aminokyselin včetně substituovaných kyselin asparagových a alaninů.

5. Izomerázy umožňují přeskupení atomů v molekule. Izomerázy, jako jsou racemasy, invertují stereochemii na cílovém chirálním uhlíku a cis-trans izomerázy katalyzují izomerizaci cis-trans izomerů v alkenech nebo cykloalkanech. Přeměna glukózy na fruktózu prostřednictvím glukózové izomerázy představuje hlavní průmyslovou enzymatickou biotransformaci.

6. Ligázy vytvářejí nové chemické vazby spojením dvou molekul za vzniku větší molekuly. Jednou z nejdůležitějších aplikací je použití DNA ligázy při tvorbě rekombinantních molekul DNA a jsou doplňkem endo- nebo exonukleáz.

Výroba enzymových katalyzátorů. Obecně platí, že přírodní nebo rekombinantní enzymy pro biokatalýzu jsou nejprve syntetizovány fermentací, nejčastěji s využitím bakterií, ale příležitostně jsou odvozeny z kvasinkových kultur. Ačkoli enzymy mohou být produkovány ve složitějších savčích buněčných kulturách, bakterie a kvasinky obvykle obsahují dostatečné a přirozeně se vyskytující molekulární dráhy k dosažení skládacích a mírných posttranslačních modifikací potřebných pro rekombinantní biokatalytické enzymy. Enzymy produkované takovými fermentacemi jsou obvykle získávány lýzou nebo jiným narušením buněčných struktur za účelem uvolnění rekombinantních enzymů a jsou dále čištěny v procesu podobném jiným biologickým léčiva. Fermentace, sklizeň a následné zpracování představují své vlastní výzvy, které jsou řešeny využitím procesní analytické technologie (PAT).

Stabilizace a imobilizace. Imobilizace enzymů se používá k dosažení stabilnějších, aktivnějších a opakovaně použitelných enzymů. Obecně platí, že zesítěné enzymové agregáty (CLEA) mohou být vytvořeny s několika různými pevnými substráty, jako je oxid křemičitý, pryskyřice nebo polymery, jako je PEG, a dokonce i s dalšími komplexy, jako jsou lipidové nanočástice (LNP). Pro některé aplikace průtokové chemie mohou být CLEA také vytvořeny na površích a senzorech, jako jsou ty, které se používají při povrchově vylepšených měřeních pro analytické a katalytické účely. Podobná řešení pro formulaci vakcín a adjuvantní procesy řeší problémy související syntézy komponent, adsorpcí, konjugací nebo jiných asociací, stejně jako stabilitu a složení produktu.

Zachycení a izolace produktu. Po biokatalýze se CLEA oddělí od produktu a zbytkových reaktantů a poté mohou být recyklovány nebo jinak zadrženy. Produkty s malými molekulami pak mohou být izolovány filtrací nebo chromatografií, ačkoli mnoho procesů nadále upřednostňuje metody krystalizace. Produkty pro biokatalýzu velkých molekul by obecně pokračovaly v tradičních pracovních postupech následného zpracování.

Pochopení praktického poločasu rozpadu a stability jakéhokoli volného, na substrát vázaného nebo povrchově imobilizovaného enzymu může být rozhodující pro návrh správných biokatalytických protokolů. Mezi důležité informace patří:

• Rozpouštědla—Mnoho přírodních enzymů se snaží vyrovnat s reakcemi organických rozpouštědel. Neustále se vyvíjející profil uměle vytvořených nebo rekombinantních enzymů zlepšuje kompatibilitu s podmínkami organických rozpouštědel. Rekombinantní enzymy jsou nyní schopny katalyzovat reakce v prostředí organických rozpouštědel, například což umožňuje použití modifikovaných fosforamidiů při syntéze oligonukleotidů.
• pH—Enzymy obecně fungují nejlépe v úzkých rozmezích pH a tolerují kolísání pH <0,5 jednotek pH. Regulace pH je tedy často kritickým parametrem, který je třeba vzít v úvahu u mnoha biokatalytických reakcí, a může být obtížné nebo zdlouhavé ji ovládat ručně. 
• Teplota—Přírodní enzymy a jejich rekombinantní protějšky fungují efektivně při specifických teplotách s poměrně úzkými rozsahy. Teplotní odchylky mohou způsobit změny v kinetice reakce, výtěžnosti produktu nebo jiných kritických výsledcích procesu.
• Rozpuštěný kyslík -Tento kritický procesní parametr, zvláště důležitý pro okysličovací a redukční reakce, je obvykle řízen dávkováním kyslíku nebo inertního plynu rozstřikem nebo nadměrným prostorem. Optimalizace množství a hmotnostního přenosu rozpuštěného kyslíku (včetně charakteristik bublin) do reakční směsi je rozhodující pro zajištění toho, aby enzymy oxidoreduktázy mohly pracovat s maximální účinností.
• Míchání, dynamika tekutin a plyny—Správné míchací zařízení může výrazně ovlivnit životní cyklus biokatalytických enzymů, zejména při dlouhodobém trvání, průtokové chemii nebo perfuzních bězích. Škálování biokatalytických reakcí může být suboptimální, pokud míchání není dostatečně charakterizováno. Míchání je také rozhodující pro správnou distribuci plynu a přenos hmoty.
• Reakční stechiometrie—Správný poměr činidel k enzymům je kritický a lze jej určit studiemi Design of Experiments (DoE), automatizovanými chemickými reaktory a podporovanými PAT integrovaným do vývoje procesu.

Vývoj a škálování biokatalytických reakcí je závislé na povaze konkrétních použitých biokatalyzátorů, substrátech, kofaktorech a použitých reakčních podmínkách. Stejně jako v chemické katalýze lze této složité, vzájemně závislé matici proměnných nejlépe porozumět pečlivým řízením reakčních proměnných v kombinaci s informacemi z analytických měření v reálném čase. Velká část vývoje procesů, škálování a omezení hustoty dat pro moderní procesy je však spojena s pokračující manuální orientací biokatalytických reakcí, které mají značné časové a zdrojové náklady. Manuální obsluha předpokládá přítomnost personálu u bioreaktoru pro téměř neustálou údržbu, seřizování a odběr vzorků, aby byla splněna rostoucí regulační a institucionální poptávka po charakterizaci procesu a přenosu technologií.

Bezobslužný provoz biokatalýzy je možný prostřednictvím platforem pro automatizaci laboratoře , které reagují na dynamické reakční podmínky kontinuálně měřené prostřednictvím integrovaných senzorů a procesních analytických technologií (PAT). Platformy automatizovaných reaktorů pro syntézu umožňují rychlejší experimenty s minimalizací lidských chyb nebo zásahů. Ve spojení s modulárním automatizovaným vzorkováním reaktoru pro offline chromatografickou analýzu lze všechny kritické procesní parametry (CPP) překrývat a trendovat. Data z řízení parametrů a procesní analytiky se automaticky zaznamenávají v reálném čase a strukturují se pro správu a archivaci dat. Snížená experimentální variabilita a zvýšená reprodukovatelnost v různých měřítcích reaktorů dále zefektivňují škálování založené na důkazech.

• Automatizované reaktory EasyMax a OptiMax hrají důležitou roli při zajišťování toho, že vliv klíčových proměnných biotransformací, jako je teplota, pH, rychlost míchání a dávkování, je přesně řízen, efektivně modelován a zaznamenáván.
• In-situ spektroskopické technologie ReactIR a ReactRaman jsou užitečné pro sledování a měření klíčových reakčních částic v reálném čase. ReactIR sleduje klíčové analyty v roztoku bez interference suspendovaných částic, jako jsou celé buňky.
• ParticleTrack s technologií FBRM měří velikost a distribuci částic v heterogenních suspenzích. Aplikace EasyViewer pořizuje snímky částic na místě a v reálném čase provádí analýzu zákalu, tvaru, velikosti, morfologie, počtu a distribuce systému.
• EasySampler umožňuje plně automatizované a bezobslužné vzorkování chemických reakcí, včetně kalení a ředění vzorků v rámci přípravy pro offline analýzu.
• Software pro vývoj a škálování procesů Scale-up Suite umožňuje rychlý vývoj, optimální procesy a robustní škálování.

Automatizovaný reaktor EasyMax je kompletní pracovní stanice pro optimalizaci parametrů v biokatalýze pro podporu vývoje, škálování a realizace. Tento plně automatizovaný systém umožňuje přesnou kontrolu nad parametry procesu.

• Spravujte CPP, včetně identifikace zdrojového materiálu, rychlosti dávkování, teploty, míchání, nadpraží, rozstřikování, měření pH a titrace
• Snadno se integruje s analýzou in-situ pro biokatalýzu, včetně ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (analýza obrazu in-situ) a EasySampler (automatizovaný odběr vzorků reaktoru na místě)
• Provádět experimenty bez dozoru; Provádění inteligentního automatického vzorkování, když je vyžadována offline analýza
• Software iC umožňuje automatizované provádění a řízení všech experimentů a periferních zařízení, stejně jako kompletní sběr dat a vedení záznamů

ReactIR využívá FTIR spektroskopii k měření vodných a organicky rozpustných složek v biokatalytických studiích. Měření ReactIR nejsou ovlivněna nerozpuštěnými látkami, bublinami ani jinou hmotou částic.

ReactRaman používá Ramanovu spektroskopii k molekulární analýze částic a reakční analýze.

• Monitoruje více atributů kvality produktu na místě a v reálném čase v nádobě nebo v proudícím procesním proudu
• Eliminuje zpoždění spojená s drapákovými vzorky
• Kvantifikuje dopad kroků zpracování na výtěžnost produktu a efektivitu procesu
• Poskytuje využitelnou analýzu dat pro rozhodování a kontrolu v reálném čase
• Podporuje regulační pokyny ICH prostřednictvím experimentování a digitalizace bohatých na data
• Pomáhá při rozšiřování od výzkumu a vývoje až po výrobu
• Měří koncentrace analytu již od 500 ppm v objemech od několika mililitrů do tisíců litrů

ParticleTrack využívá technologii měření odrazivosti zaostřeného paprsku (FBRM) a je to přístroj založený na optické sondě, který se vkládá přímo do nádoby a sleduje měnící se velikost částic a jejich počet v reálném čase. Aplikace ParticleTrack používá měření distribuce délky tětivy (CLD) k získání distribuce velikosti částic (PSD).

• Částice a struktury částic jsou nepřetržitě monitorovány podle toho, jak se mění experimentální podmínky nebo parametry
• Charakterizujte syntézu částic na pevné fázi, imobilizaci enzymů, štěpení a související morfologie procesů
• Sledujte dávkový nebo kontinuální růst biokatalytických produktů během biokatalýzy v reálném čase bez nutnosti odběru vzorku
• Charakterizovat podmínky částicového systému, které ovlivňují nukleaci, srážení, polymorfismus a další atributy systému

EasyViewer je analyzátor  velikosti částic založený na sondě, který se vkládá přímo do nádoby a pořizuje snímky částicového systému. EasyViewer provádí analýzu obrazu a měří počet částic, distribuci velikosti a morfologii z časově rozlišených vložených snímků procesu, což umožňuje sledovat trendy populací v průběhu času.

• Částice a struktury částic jsou nepřetržitě monitorovány podle toho, jak se mění experimentální podmínky nebo parametry
• Charakterizujte syntézu částic na pevné fázi, imobilizaci enzymů, štěpení a související morfologie procesů
• Změřte přenos hmoty (K_La) pomocí charakterizace bublin
• Sledujte dávkový nebo kontinuální růst biokatalytických produktů během krystalizace v reálném čase bez nutnosti odběru vzorku
• Charakterizovat podmínky částicového systému, které ovlivňují nukleaci, srážení, polymorfismus a další atributy systému

Design of Experiment (DoE) je statisticky užitečný prostředek pro minimalizaci počtu experimentů potřebných k prozkoumání vlivu proměnných na reakční výkonnost v laboratoři. Přesto je rozšíření procesů enzymové katalýzy na produkci plné problémů. Mnoho biokatalytických studií například nebere v úvahu proměnné, jako jsou rozpouštědla, pH, teplota a míchání ve velkém měřítku. Modelování Dynochem umožňuje zohlednit důležité fyzikální a tepelné vlastnosti při škálování. Když se kinetické informace používají s modelováním Dynochem, lze určit vhodné koncové body odběru vzorků pro biokatalytické procesy, což šetří čas a zdroje. Modelování Dynochem tedy zlepšuje vývoj kritických parametrů procesu a efektivního prostoru pro návrh procesu.