Inaktivace virů v oblasti biozpracování

Inaktivace virů je prvním ze dvou kroků, které je obvykle potřeba provést ke zvýšení bezpečnosti bioterapeutických přípravků. Během inaktivace je jakýkoli virus přítomný ve směsné a částečně purifikované terapeutické suspenzi úmyslně zničen nebo náhle učiněn nepatogenním. Obvykle je příčinou tohoto procesu změna prostředí v okolí viru, která způsobí nevratné narušení a denaturaci virové struktury.

Obvykle je příčinou tohoto procesu změna prostředí v okolí viru, která způsobí nevratné narušení a denaturaci virové struktury – např. prostřednictvím chemických, fyzikálních nebo dokonce energetických metod. Odstranění viru se provádí samostatně a od inaktivace viru se liší. Jedná se totiž o doplňkový proces, který nadále zvyšuje virovou bezpečnost, a to na základě eliminace viru nebo jeho oddělením od požadovaných proteinů nebo prostředků.

Mnoho bioterapeutických přípravků obsahuje viry nebo jimi může být během výroby či zpracování kontaminováno. Aby nedošlo k poškození pacienta, patogenicitu a virovou nálož nebo množství viru je třeba v těchto modalitách eliminovat či zlikvidovat na základě procesů inaktivace a odstranění. Ani jedna z uvedených metod sama o sobě obvykle nestačí. V závislosti na specifických charakteristikách viru a typu bioterapeutického přípravku je k dispozici několik metod inaktivace a odstranění virů. Mnoho pracovních postupů bioterapeutického zpracování bude využívat kombinaci doplňkových metod ke zvýšení spektra virů, které lze dostatečně eliminovat.

Inaktivace
Je možné použít více metod inaktivace virů. Nejběžnější jsou následující metody:

• Metody založené na nízké hodnotě pH – zejména u bioterapeutických přípravků, jako jsou monoklonální protilátky (mAb)
• Metody založené na rozpouštědlech nebo povrchově aktivních látkách – obvykle u polysacharidů

Mezi méně často používané metody inaktivace virů patří pasterizace, použití horkého vzduchu a páry – zejména u přípravků na bázi krve nebo séra.

Odstranění virů
Dobře zdokumentované metody odstraňování virů zahrnují precipitaci, chromatografii a nanofiltraci.

Výběr metod, které mají být použity pro inaktivaci a odstranění virů, závisí na rozměrech, typu a nestálosti připravovaného bioterapeutického přípravku, metodách purifikace, které si výrobce přeje použít, a povaze a titru obávaných virů. Struktura a funkce léčivé látky (DS) jsou stejně důležité atributy kvality jako virová bezpečnost a musí být po celou dobu posuzovány a udržovány. Přesná a simultánní kontrola více kritických parametrů procesu (CPP) představuje přínosy aplikovatelné pro všechny metody inaktivace viru, včetně metod na bázi nízkého pH nebo povrchově aktivní látky. Jedná se o možnost, která je vyžadována k efektivnímu pochopení samotného procesu a účinku na léčivou látku (DS). Reaktory pro chemickou syntézu umožňují mapování moderního procesu a konzistentní provoz v rámci prostoru definovaných parametrů, jakož i modelování pro přenos metod a jejich zavedení do výroby.

Je známo, že na virovou inaktivaci bioterapeutických přípravků metodou nízkého pH má vliv hodnota pH, čas, teplota, obsah proteinů a obsah rozpuštěných nebo pufrových látek. Mnoho virů je nevratně denaturováno a účinně zničeno při hodnotách pH 5,0–5,5. V závislosti na okruhu virů, které mají být inaktivovány a zlikvidovány, může být tento rozsah dostatečný. Několik obalených virů je však efektivně inaktivováno pouze při hodnotách pH v rozsahu 3,5–4.

Mnoho bioterapeutických přípravků mAb vyžaduje obzvláště široké spektrum likvidace více typů virů, takže se běžně používá „nízké“ cílové pH v rozsahu 3,5–4 (obrázek A). Dlouhodobé vystavení tomuto rozsahu pH však může také poškodit nebo inaktivovat některé bioterapeutické přípravky, konkrétně proteiny nebo enzymy, jako jsou krevní proteiny, inzulín a další (obrázek B). Při dlouhodobém vystavení stresu způsobeného hodnotou pH jsou proteiny a enzymy podrobeny významné deamidaci, denaturaci a agregaci. Roztoky imunoglobulinu (včetně IgG i IgM mAb) jsou při hodnotách pH v rozsahu 3,5–5,5 obvykle méně citlivé než jiné proteiny nebo enzymy, ačkoliv zůstávají citlivé na různé stupně. Po uplynutí dostatečné doby za podmínek inaktivace viru by měla být infekční virová nálož efektivně minimalizována. Zbytkové virové částice, nečistoty nebo jiný obsah však ještě nebudou fyzicky odstraněny (obrázek C).

U imunoglobulinových přípravků mAb je nízké pH nejčastěji používanou metodou virové inaktivace, protože je relativně jednoduchá, udržuje malou stopu a kromě malého zásahu za účelem odstranění virů obvykle nevyžaduje žádné další kroky, na rozdíl od metod založených na povrchově aktivních látkách nebo jiných rozpouštědlech. Přesto se vhodné a optimální podmínky mezi molekulami liší, včetně požadovaného spektra virové likvidace. Proto musí být pro každou molekulu provedeny studie za účelem charakterizace a validace rozsahu hodnot parametru nebo provozní meze, ve kterých může probíhat efektivní virová inaktivace. Tyto meze a výsledek procesu inaktivace virů obvykle definují všechny proměnné hodnoty či kritické parametry procesu (CPP) nebo alespoň jejich výběr. Zmíněné parametry ovlivňují výsledek inaktivace virů, a tedy kvalitu léčivé látky (DS). Identifikace a řízení těchto faktorů pozitivně ovlivní kvalitu a množství přípravku.

Studie inaktivace virů s využitím metody nízkého pH se tradičně provádějí při nastaveném objemu a koncentraci roztoku imunoglobulinu v nádobě, jako je kádinka, za magnetického míchání. Jelikož bude většina studijního materiálu používat roztoky imunoglobulinu s počáteční hodnotou pH, která se blíží fyziologickým podmínkám, budou se studie inaktivace virů snažit objasnit parametry přidání činidla. Manuální titrace se obvykle provádí pomocí byrety nebo pipetováním, přičemž se čas od času zaznamenává měření pH. Po uplynutí předepsané doby a při udržení dalších parametrů na nízkých hodnotách pH dostatečných k inaktivaci cílového obsahu viru bude léčivá látka (DS) nebo roztok imunoglobulinu reverzně titrován z rozsahu nízkých hodnot pH na rozsah vhodných fyziologických nebo mírně zásaditých hodnot. Tento proces slouží k dokončení virové inaktivace udržením nízkých hodnot pH. V průběhu studie titrace nízkého pH pro inaktivaci virů je přesto nutná extrakce vzorků pro offline analýzu za účelem dokumentace různých atributů kvality, jako je agregace nebo deamidace, s využitím metod jako např. vylučovací chromatografie (SEC). Ačkoli je přesnost ze strany zkušených vědců možná, proces inaktivace viru je obvykle pracný a doprovází jej přirozené variace, nepřesnosti a problémy spojené s reprodukovatelností jakéhokoli manuálního procesu.

Zatímco hlavní potřebou studií inaktivace virů s využitím metody nízkého pH v oblasti zpracování v dalších fázích je definovat rozsah přidání činidla a potřebnou dobu k provedení procesu, důležitá je také charakteristika kinetiky procesu, dopad parametrů procesu míchání a nakonec požadavek zajistit robustní a optimalizovaný návrh procesu inaktivace virů. Přesto je sledování a kontrola teploty během studií vývoje procesu pro inaktivaci virů často přehlíženým, a tedy nekontrolovaným parametrem.

Toto přehlížení může být částečně způsobeno použitím pilotních nebo dokonce komerčních výrobních váhových systémů, kde se inaktivace virů metodou udržení nízkého pH provádí v nádobách pro přenos, které mohou sice zaznamenávat teplotu, nemohou ji ale regulovat. Reprezentativnost váhy, zejména reprezentativnost míchání, je ve studiích inaktivace virů s využitím metody nízkého pH, jako jsou např. studie, které se provádějí prostřednictvím manuálních platforem ovládaných magnetickými míchacími destičkami, často dalším snadno přehlížitelným parametrem. Na základě skutečnosti, že nejsou zaznamenávána data u tak jednoduchého procesu, jako je míchání, není možné ověřit, zda byly předpokládané podmínky studie správné a konzistentní. 

Provoz jednotky působení nízké hodnoty pH pro inaktivaci virů představuje při zpracování v dalších fázích pro monoklonální protilátku potenciální riziko v důsledku agregace přípravku během procesu. Tato prezentace, kterou připravila Hiren D. Ardeshna ze společnosti GlaxoSmithKline, pojednává o úplném faktoriálním designu experimentu zkoumajícím efekt čtyř parametrů procesu:

• Cílová hodnota nízkého pH
• Doba udržení nízkých hodnot pH
• Doba trvání titrace nízkého pH
• Doba trvání neutralizační titrace

Proti obaleným virům se běžně používají metody inaktivace viru na základě rozpouštědla nebo čisticího prostředku. Používaná činidla mají obecně zanedbatelný dopad na nestálost terapeutického proteinu nebo protilátek, které jsou vystaveny problémům denaturace nebo deamidace, jež mohou v případě některých metod nízkého pH nastat. Metody působení rozpouštědel nebo čisticích prostředků za účelem inaktivace virů mají mnoho stejných potřeb a podnětů jako metody nízkého pH. V zásadě jde o to definovat rozsah přidání činidla (v tomto případě rozpouštědla nebo čisticího prostředku) a potřebnou dobu k provedení procesu. Stejně jako při inaktivaci virů s využitím nízkého pH se podmínky mezi imunoglobuliny nebo jinými typy léčivých látek liší. Proto musí být pro každou molekulu provedeny studie za účelem charakterizace a validace rozsahu hodnot parametru nebo provozní meze, ve kterých může probíhat efektivní virová inaktivace s využitím rozpouštědla nebo čisticího prostředku. Tyto meze a výsledky procesu inaktivace virů podobně definují kritické parametry procesu (CPP), včetně teploty, obsahu proteinů, obsahu rozpouštědla nebo čisticího prostředku, doby vystavení podmínkám inaktivace, jakož i míchání a efektivity homogenizace rozpouštědla nebo čisticího prostředku. Identifikace a řízení těchto faktorů pozitivně ovlivní kvalitu a množství přípravku.

Zatímco studie virové inaktivace s využitím čisticího prostředku nevyžadují stejný způsob titrace činidel jako studie metody nízkého pH, je stále třeba posoudit rozsah hodnot parametru kritických proměnných. Stejně jako je tomu u metod nízkého pH, studie inaktivace virů s využitím rozpouštědla nebo čisticích prostředků charakterizují proces obvykle zcela manuálním způsobem. Dávkování činidel a kontroly jsou podobně závislé na přesnosti vysoce kvalifikovaných osob, které současně provádí více kritických úloh. Studie inaktivace virů s využitím rozpouštědla nebo čisticího prostředku jsou rovněž předmětem přirozených variací, nepřesností a problémů spojených s reprodukovatelností.

Metody inaktivace virů založené na rozpouštědlech nebo čisticích prostředcích obecně vyžadují zvážení dalšího hlediska, které se obvykle netýká metod nízkého pH. Veškerá přidaná rozpouštědla nebo čisticí prostředky musí být z roztoku léčivé látky nebo imunoglobulinu odstraněny a ověřeny vhodnou analytickou metodou. Obvykle se rozpouštědla nebo čisticí prostředky odstraňují prostřednictvím chromatografie nebo výměny tlumicích látek za použití filtrace s příčným tokem. Účel odstranění přidaných rozpouštědel nebo čisticích prostředků je podobný jako v případě reverzní pH titrace z inaktivační nízké hodnoty pH zpět do vhodného fyziologického nebo mírně zásaditého rozsahu. Jelikož probíhá přesun materiálu ze zadržovací nádoby přes kolonu nebo jinou vhodnou membránu pro výměnu rozpouštědla či pufrových látek, výměna pufrových látek nebo chromatografické metody mají na váze charakter kontinuálních nebo částečně kontinuálních operací. Při vývoji procesu je pravděpodobné, že k virové inaktivaci prostřednictvím rozpouštědla nebo čisticího prostředku dojde vzhledem k následujícímu kroku purifikace nebo odstranění samostatně a odděleně. Z tohoto důvodu může tato praxe zahrnovat kontinuitu dat nebo informací.

Inaktivaci virů podstupují různé vakcínové přípravky, včetně modifikovaných toxinů, rekombinantních proteinů, podjednotek, polysacharidů a dokonce i několika vybraných vakcín na bázi částic podobných viru. Při výběru vhodné metody inaktivace virů bude opět zvážena povaha bioterapeutického přípravku i rozsah virů, které je třeba efektivně zlikvidovat.

Obecně je třeba přísně zvážit alternativní metody nebo postupy, které zabraňují vnější virové kontaminaci, u typů vakcín fungujících na bázi živých atenuovaných virů, kde je bioterapeutickým přípravkem virová částice. Specifické metodiky pro takové přípravky mohou zahrnovat jeden nebo více nanofiltračních či chromatografických procesů za účelem efektivního snížení vnější virové nálože v příslušných zdrojích surovin. Inaktivované nebo zničené viry mohou stále procházet vhodným procesem inaktivace virů na základě nízkého pH, rozpouštědla nebo čisticího prostředku. Může tak být i nadále zachován požadovaný imunostimulační účinek, ačkoliv je virový produkt denaturován nebo jinak narušen.

Metody virové inaktivace u oligonukleotidového přípravku nebo typů molekul nejsou široce považovány za nutné. To je způsobeno hlavně povahou činidel, reakčních podmínek a metod zpracování, které jsou pro viry trvale nepříznivé. V současné době je mnoho takových oligonukleotidových přípravků ve vývoji a výrobě primárně purifikováno, koncentrováno a recepturováno prostřednictvím výměn různých pufrových látek za použití filtrace s příčným tokem nebo jednoho z různých typů chromatografické separace.

Při potřebě kontinuity dat a elektronických záznamů o šaržích fungují reaktory pro chemickou syntézu jako multiplikátor sil během procesů inaktivace virů, a to jak při návrhu, tak při provádění experimentů a při usnadňování záznamu a integrity dat. Ortogonální procesní analytická technologie (PAT) přemosťuje více aplikací a pracovních postupů, jako je virová inaktivace s výměnou pufrových látek, a přesněji modeluje procesní toky velkých operací.

Podívejte se na virtuální prezentaci z práce nebo domácí kanceláře podle svého časového plánu.

• Stiskněte tlačítko Přehrát a odejděte. Software iC dynamicky reaguje na podmínky v reaktoru. Důsledné provádění operací v mezích protokolu o inaktivaci viru.
• Záznam dat z více senzorů, včetně pH, vodivosti, oxidačně redukčního potenciálu (ORP) a rozpuštěného kyslíku.
• Integrace periferních jednotek, jako jsou pumpy nebo váhy, pro gravimetrický převod hmoty.

FTIR in situ a Ramanova spektroskopie sledují kritické složky biologických procesů během předcházejících operací, operací v dalších fázích, konjugace a recepturování.

Glukózu a klíčové metabolity lze sledovat v aplikacích pro předcházející procesy, zatímco při zpracování v dalších fázích lze sledovat a kontrolovat koncentraci proteinů nebo vakcín, stabilizátory, pomocné látky a nečistoty v reálném čase, aniž by docházelo ke zpoždění nebo vytvoření nákladů souvisejících s offline analýzou.

To umožňuje rychlé stanovení cílových hodnot procesu a jasné pochopení dopadu různých parametrů procesu na kvalitu přípravku a efektivitu procesu.