Protein kristallisering

Proteinkristallisering är handlingen och metoden att skapa strukturerade, ordnade gitter för komplexa makromolekyler. Proteiner är vanligtvis amorfa som fasta ämnen och benägna att denatureras, medan proteiner som existerar i kristallina gitter motstår denaturering och har större stabilitet. Proteiner kan kristallisera om de placeras i lämpliga, gynnsamma miljöer. Proteinkristallisering ses lika mycket som en konst som en vetenskap, på grund av de mycket komplexa interaktionerna mellan variabler som påverkar proteinkristalliseringsprocessen.

Den vanligaste anledningen till att skapa proteinkristaller är att stödja strukturella biologiska undersökningar, vanligtvis via röntgendiffraktionskristallografi. Forskare kan visualisera områden i strukturen som tillåter interaktion med andra molekyler genom att förstå proteiners tredimensionella strukturer (till exempel för att bättre förstå hur enzymer, substrat och ligander interagerar). Dessutom är kristallisering ett effektivt sätt att skapa rena proteiner som är fria från kontaminering av andra proteiner eller främmande biologiskt material, vilket erbjuder ett alternativt sätt för rening och separation jämfört med preparativ kromatografi. 

Kristallisering fortskrider genom en serie ömsesidigt beroende mekanismer som var och en påverkas unikt av valet av processparametrar: nukleation, tillväxt, oljebildning, agglomerering, brott, sådd och polymorf övergång.

Dessa mekanismer sker ofta samtidigt, vilket gör effektiv kristallisering design till en utmaning. I avsaknad av mekanistisk förståelse förlitar sig forskare på trial-and-error för att justera processparametrar och optimera avkastning, renhet och kristallstorlek. Genom att förstå vilka mekanismer som sker under kristalliseringen kan forskare använda strategier för att leverera en kristallprodukt med önskade egenskaper.

Proteiner blir allt viktigare som terapeutiska läkemedel. Att producera proteiner med nödvändig stabilitet innebär dock viktiga utmaningar, inklusive produktvariation, förlust av struktur som skulle minska effektiviteten och bildning av potentiellt farliga biprodukter. Proteinkristallisering är en metod för att producera rena, stabila fasta dosformer och ett antal injicerade och infunderade terapeutika som är förknippade med proteinkristaller. Tidigare har proteinkristallisering varit en laboratorieaktivitet för att stödja röntgenkristallografi, men på grund av den exponentiella tillväxten av proteinbaserade terapeutika blir uppskalning av proteinkristallisering till produktionsnivåer allt viktigare och ett område med intensivt fokus.

Uppskalning av proteinkristallisering är i grunden analogt med kristallisering av små molekyler i dess krav på att optimera kritiska processparametrar (CPPs) i labbskala för att uppnå kritiska kvalitetsattribut (CQAs) av ett kristalliserat läkemedelssubstans i kommersiell skala. En holistisk plattform för utveckling och uppskalning av proteinkristalliseringsprocesser omfattar vanligtvis:

• In-situ partikel systemkarakterisering
• Spektroskopisk övervakning och polymorf karakterisering
• Optimering av procedur och återkopplingsstyrningsstrategier genom integrerade moduler och sensorer

Det finns stora farmaceutiska tillämpningar kopplade till proteinkristallisering: medicinsk kemi via strukturell biologi, utveckling av proteindroger, uppskalning, separation och rening, formulering och läkemedelsleverans.

• Medicinsk kemi via strukturell biologi. Framsteg inom proteinkristalliseringstekniker och förbättrad röntgenkristallografi har lett till bestämning av tiotusentals tredimensionella proteinstrukturer. Det är möjligt att förstå läkemedels-receptorinteraktioner i detalj genom att bestämma strukturen av dessa komplexa makromolekyler och visualisera bindningsställen. Denna information möjliggör en djupare molekylär förståelse av proteinhämmare, allosteriska aktivatorer, kofaktorer och till och med enzymatiska katalytiska platser eller "aktiva platser" – vilket resulterar i bättre läkemedel med förbättrad effektivitet. Ett klassiskt exempel på vikten av att förstå protein-hämmarstruktur via kristallografi visas av de stora framstegen i utvecklingen av HIV-proteaser.
• Utveckling, uppskalning, separation och rening för proteinbaserade terapeutika. Förutom att odla enskilda proteinkristaller för röntgenkristallografi har läkemedelsindustrin ökat sina insatser för utveckling av protein kristallbaserade terapeutika. Målet med dessa tillämpningar är att utveckla och skala upp till stora mängder rena, stabila proteinkristaller som har rätt partikelstorlek och välkontrollerad partikelstorleksfördelning. Jämfört med preparativ kromatografi har proteinkristallisering potential att vara ett kostnadseffektivt alternativ för separation och rening av makromolekyler och för isolering av kirala molekyler. Verktygen för uppskalning av proteinkristalliseringar är analoga med de som används för uppskalning av kemiska reaktioner med behov av förståelse för CPPs och deras effekt på CQAs.
• Formulering och läkemedelsleverans. Proteinterapeutika administreras som lösningar och kan ges via injektion eller infusion. Eftersom stora mängder protein behöver levereras, späds de infunderade proteinerna ut för att undvika viskositets- och aggregeringsproblem. Detta är mindre bekvämt för patienten och sjukhuset på grund av den tid som krävs för att infundera hela behandlingen, men kan också bidra till fenomenet lägre patientföljsamhet vid någon form av parenteral administrering. Användning av proteinkristallernas kristallina form i suspension är av stort intresse, eftersom dessa formuleringar har färre viskositetsproblem och kan levereras i högre koncentrationer. En annan viktig punkt är att storleken på proteinkristaller måste kontrolleras noggrant för att säkerställa att suspensionen lätt kan passera genom en injektions- eller infusionsnål. Även viktigt är att eventuella kvarvarande kristaller som inte löser sig vid rekonstitution inte får överstiga kritiska partikelstorlekar som kan orsaka negativa biverkningar på grund av kapillär ackumulering i kärlsystemet, vilket generellt minimerar betydande partikelmängder >15 µm. 

1. Välj ett lämpligt lösningsmedel. Vanliga överväganden inkluderar hur mycket löst ämne som kan lösas (löslighet), hur praktiskt lösningsmedlet är att hantera (säkerhet) och hur lösningsmedlet påverkar stabilitet och fria energitillstånd för peptiden eller proteinet.
2. Uppnå översaturering. Värm det lösliga peptid-/proteindrogämnet i lösningsmedel eller buffert till en maximal tillåten tolerans (vanligtvis begränsad av denaturering). Lösningen blir då översaturerad.
3. Kristallisera produkten genom att kontrollera CPP. Minska lösligheten genom kylning, tillsats av anti-lösningsmedel, avdunstning eller reaktion. När lösligheten minskar nås en punkt där kristaller kommer att nukleera och sedan växa. Mycket rena produktkristaller bör växa, även om motiv med hög fri energi kan bilda alternativa eller icke-kristallina strukturer; för att förhindra detta krävs noggrann kontroll av CPP om det ens är praktiskt möjligt.
4. Låt systemet nå jämvikt. Detta görs för att maximera avkastningen av fast läkemedelsprodukt.
5. Filtrera och torka den renade produkten.

Det finns flera metoder som används för att odla proteinkristaller; bland de vanligaste är ångdiffusion och mikrobatch. Den förstnämnda metoden har två varianter, beskrivna som hängande droppe och sittande droppe, och båda fungerar i grunden på samma sätt. I ett slutet system jämviktar en droppe lösning som innehåller protein, buffert och fällningsmedel med ett reservoar som innehåller högre koncentrationer av samma lösning, men utan protein. Vatten från droppen som innehåller proteinet avdunstar och attraheras till den högre koncentrationslösningen i reservoaren. När koncentrationen av lösta ämnen i droppen ökar, börjar proteinet kristallisera. I mikrobatch-metoden tillsätts proteiner och andra reagenser och hålls under ett tunt lager mineralolja som eliminerar diffusion av vatten. Mikrobatchen är i princip en liten reaktor som innehåller alla nödvändiga ingredienser i rätt, stabila koncentrationer för att möjliggöra kristallisering.

Eftersom det ofta är empiriskt att hitta rätt uppsättning reagenser, parametrar och villkor för att kristallisera ett protein, är det mest praktiska sättet för framgångsrik protein-kristallisering att använda ett varierande spektrum av experimentella förhållanden baserade på tidigare erfarenheter. Det enklaste sättet att göra detta är att använda kommersiellt tillgängliga protein-kristalliseringskit som innehåller förpackade lösningar med buffertar, fällningsmedel etc. i multi-brunnsplattor. Den hängande droppens ångdiffusionsmetod används för att odla kristaller med dessa kit. När storskalig screening krävs finns högkapacitetsystem som automatiserar mikrobatch-metoden, vilket sparar tid och möda samtidigt som mängden renat protein som krävs minimeras. För storskaliga protein-kristalliseringar som krävs för farmaceutiska eller industriella tillämpningar utgör informationen från screeningsförsök grunden för tillämpning i större automatiserade reaktorsystem med in-situ, realtids PAT.

Som stöd för processutveckling och tillverkning är ett av de viktigaste initiala stegen för att framgångsrikt kristallisera proteiner att säkerställa att en tillräcklig tillgång på högrenat och välkarakteriserat protein finns tillgängligt. Förutom att proteinet är rent (dvs. fritt från föroreningar, såsom orenheter från fermenteringsmatriser) bör proteinet vara homogent och stabilt (eller stabiliserat) i lösning med:

• Minimal aggregering (Figur A)
• Korrekt sekundär, tertiär och kvartär struktur (Figur B)
• Eventuella konjugat- eller rekombinanta modifieringar (Figur C)

Dessutom måste alla reagenser och lösningsmedel som används i protein-kristalliseringsprocessen vara fria från föroreningar, eftersom dessa kan ha betydande påverkan på nukleation.

På samma sätt som för kristallisering av små molekyler kristalliserar proteiner från översaturerade lösningar. För små molekyler som bildar robusta kristallgitter är temperaturmanipulation ett primärt sätt att uppnå översaturering; detta är också användbart för proteiner. Dock är ett reducerat temperaturområde tillåtet eftersom proteinkristaller vanligtvis har lösningsmedel som en del av kristallstrukturen, ofta är temperaturkänsliga och benägna att denaturera och aggregera.

Små molekyler har betydligt färre stereoskopiska frihetsgrader och kristalliserar därför mycket lättare. Stora molekylpeptider har många fler interna sura, basiska, polära, opolära interaktioner och repulsiva krafter som motverkar ordnad kristallisering, ett fenomen som förvärras för ännu större proteiner. De flesta kristallisationskompatibla peptider innehåller också ett betydande antal disulfidbindningar som är avgörande för att immobilisera strukturella motiv. Omfattningen av intramolekylär oordning eller möjlig variation i struktur är en viktig egenskap som avgör om en peptid eller ett protein någonsin kan kristallisera istället för att fälla ut. Även om molekylen är predisponerad med egenskaper som är gynnsamma för kristallisering, finns ett antal påverkande processparametrar som påverkar processens kommersiella livskraft och som behöver karakteriseras.

Utöver temperatur finns flera andra faktorer som påverkar/hjälper protein-kristallisering via översaturering, inklusive pH-justering och jonstyrka i en lösning, tillsats av salter och fällningsmedel såsom PEG för att minska proteinets löslighet, typ av ligand som är närvarande etc. Nyckeln är att översaturera lösningen inom en miljö som inte stör proteinets normala karaktär. Detta understryker vikten av att hitta en uppsättning variabler och villkor som resulterar i kristaller med korrekt morfologi, renhet och acceptabla tillväxthastigheter.

Proteinkristallisering sker genom en serie ömsesidigt beroende mekanismer:

1. Nukleation
2. Tillväxt
3. Oiling Out vid kristallisering
4. Agglomeration
5. Brott
6. Sådd
7. Polymorfismkemi

Dessa mekanismer, som ofta är dolda för forskare, spelar en dominerande roll i att definiera resultatet av en kristalliseringsprocess.

Utveckling och uppskalning av kristalliseringar för proteinbaserade terapeutika kräver en djup förståelse för de variabler och förhållanden som påverkar kristalliseringsprocessen. Som i andra kristalliseringar krävs noggrann kontroll för att uppnå önskad kristallform, form, partikelstorlek och storleksfördelning för att säkerställa konsekvent produktkvalitet. Varje variation i CQAs för protein-kristallsuspensioner påverkar direkt den terapeutiska effekten. Eftersom proteinkristaller är mycket känsliga för sin tillväxtmiljö och lätt kan skadas av överdriven temperatur, förlust av lösningsmedel och andra yttre påfrestningar eller till och med provtagningsprocessen, är det önskvärt att mäta CPPs och produktkvalitet in situ, dvs utan att ta bort kristallerna från deras lösningsmiljö.

• EasyMax och Optimax automatiserade kemiska reaktorer möjliggör exakt kontroll, justering och registrering av parametrar, inklusive temperatur, pH, konduktivitet, omrörningshastighet och dosering av buffertar och hjälpämnen, vilka är kritiskt viktiga för framgångsrik utveckling och uppskalning av proteinkristalliseringar
• In-situ analytiska teknologiverktyg som hjälper till att övervaka, felsöka och korrigera processavvikelser är också användbara
  • In-situ Raman-spektroskopi och FTIR-spektroskopi spårar reagenskoncentrationer, övervakar kristallstrukturens tillväxt och mäter även koncentrationen av översaturerade lösningar
  • ParticleTrack (med FBRM) teknologi övervakar förändringar i kristallstorlek och storleksfördelning i realtid när viktiga segment av kristalliseringsprocessen fortskrider
  • EasyViewer möjliggör visualisering och bildanalys av kristalliseringsprocessen medan den pågår

När automatiserade laboratoriereaktorer används tillsammans med realtids in-situ-analysatorer kan effekten av processparametrar på kristalliseringsmekanismer såsom aggregering, tillväxt, agglomeration, brott och formförändring identifieras. Exakt kontroll över kristalliseringsprocessen i kombination med kontinuerlig, in-situ-övervakning av kristallbildningsförloppet möjliggör optimering och uppskalning baserad på fakta och datadriven.

EasyMax automatiserad laboratoriereaktor är en komplett arbetsstation för parameteroptimering vid proteinkristallisering för att stödja utveckling och uppskalningsdesign och genomförande. Detta fullt automatiserade system möjliggör exakt kontroll över processparametrar.

• Hantera CPPs inklusive doseringshastigheter, temperatur, omrörning, pH och konduktivitet
• Integreras enkelt med in-situ-analys för kristallisering inklusive ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) och EasyViewer (in-situ bildanalys)
• iC-programvara möjliggör automatiserad genomförande och kontroll av alla experiment och kringutrustning samt fullständig datainsamling och dokumentation

ReactIR använder mid-infraröd spektroskopi för att mäta lösningsfasen i kristalliseringsstudier. ReactIR-mätningar påverkas inte av suspenderade fasta ämnen, bubblor eller annan partikelmassa.

• Spåra individuella kristalliseringslösta ämnen in situ och i realtid.
• Mät lösningskoncentrationer till stöd för översaturationsstudier
• Tillhandahåll handlingsbara dataanalyser för realtidsbeslutsfattande och kontroll

ReactRaman använder Raman-spektroskopi för att ge molekylär analys av partiklar i lösning

• Spåra kristalltillväxt, struktur och morfologi icke-förstörande, in situ och i realtid
• Bestäm parameterpåverkan och optimera kristalliseringsförhållanden och variabler för att uppnå kvalitetsmål

ParticleTrack använder Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)-teknologi och är ett optiskt, probbaserat instrument som förs direkt in i en behållare för att spåra förändringar i partikelstorlek och antal i realtid. ParticleTrack använder mätningar av kordlängdsfördelning för att erhålla kristallstorleksfördelning (CSD).

• Proteinkristaller övervakas kontinuerligt när experimentella förhållanden varieras
• Följ batch- eller kontinuerlig tillväxt under kristallisering i realtid utan att prov behöver tas ut
• Karakterisera förhållanden som påverkar nukleation, aggregering, polymorfism och andra systemegenskaper

EasyViewer är ett probbaserat instrument som förs direkt in i en behållare för att fånga bilder av partikelsystem. EasyViewer utför bildanalys och mäter partikelantal, storleksfördelning och morfologi från tidsupplösta, inline-bilder av processen vilket möjliggör att populationer kan följas över tid.

• Proteinkristaller övervakas kontinuerligt när experimentella förhållanden varieras
• Följ batch- eller kontinuerlig tillväxt under kristallisering i realtid utan att prov behöver tas ut
• Visualisera kristallisationsparametrar som påverkar nukleation, aggregering, polymorfism och andra systemegenskaper i realtid

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Författarna rapporterade framgång i att utveckla en effektiv metod för realtidsövervakning av biofarmaceutiska kristalliseringar. Denna procedur använder ParticleTrack för att mäta CLD för en serie biofarmaceutiska molekyler under både statiska och dynamiska förhållanden, och tillämpar sedan matematisk modellering för att omvandla CLD till CSD. De biomolekyler som undersöktes har olika kristallformer, vilka är beroende av de experimentella förhållandena för kristalliseringen. Lysozym kan producera tetragonala och nålformade kristaller, rHu insulin bildar romboedriska kristaller och B12 bildar polyedriska kristaller.

Författarna utvecklade modeller för att bestämma CSD för de tetragonala kristallerna med låg aspektkvot, romboedriska, polyedriska kristaller och nålkristaller med hög aspektkvot. Författarna använde tre olika modeller för att bestämma kristallstorleksfördelningen:

• En modell utvecklad av en annan forskargrupp som antog att kristaller kunde representeras som sfärer (sfäriskt ekvivalent diameter, SED) var effektiv för kristaller med låg aspektkvot
• För kristaller med hög aspektkvot utvecklade författarna i denna studie en modell som är baserad på bredd
• Slutligen utvecklade de en modell som är längdbaserad och kräver att aspektkvoten specificeras

Resultaten från modellerna som utvecklades för att beräkna CSD från FBRM-mätningarna jämfördes sedan med CSD-mätningar erhållna genom bildanalys.

Att försöka övervaka en ogenomskinlig kristallsuspension innebär utmaningar, särskilt när tillverkningsspecifikationer kräver en smal partikelstorleksfördelning (PSD). För injicerbara proteinkristallformuleringar kan PSD starkt påverka viskositeten samt fungera som en tidig varning för aggregering eller andra nedbrytningshändelser som potentiellt kan äventyra formuleringen. In-situ-övervakning användes i en uppskalningsstudie av batchkristallisering för att karakterisera bildning och tillväxt av humant tillväxthormon (hGH)-kristaller. Realtidsanalys upptäckte en avvikelse från den vanliga PSD-profilen orsakad av skillnader i omrörning mellan behållarna. Detta bekräftades av efterföljande offline bildanalys (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Kontinuerliga kristallisationsprocesser inom läkemedelstillverkning: En översikt. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameteruppskattning av den stokastiska primära nukleationskinetiken med hjälp av stokastiska integraler och fokuserade strålningsreflektansmätningar. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Realtidsövervakning av biofarmaceutisk kristallisering: Från kordellängdsfördelning till kristallstorleksfördelning för lysozym, rHu insulin och vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulering av kristallisering i lysozym och supramolekylär självarrangemang i lösning med hjälp av jonvätskor. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modellering och kontroll av kristallform i kontinuerlig proteinkristallisering. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Förbättring av kristalltillverkningshastigheten och minskning av polydispersitet i kontinuerlig proteinkristallisering. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Proteinkristaller för leverans av biofarmaceutiska produkter. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301