Proteinkrystallisering

Proteinkrystallisering er handlingen og metoden til at skabe strukturerede, ordnede gitterstrukturer for komplekse makromolekyler. Proteiner er typisk amorfe som faste stoffer og tilbøjelige til denaturering, mens proteiner, der eksisterer i krystallinske gitterstrukturer, modstår denaturering og har større stabilitet. Proteiner kan krystallisere, hvis de placeres i egnede, gunstige miljøer. Proteinkrystallisering betragtes lige så meget som en kunst som en videnskab på grund af de meget komplekse interaktioner mellem variabler, der påvirker proteinkrystalliseringens proces.

Den mest almindelige grund til at skabe proteinkrystaller er at understøtte strukturel biologisk forskning, typisk via røntgendiffraktionskrystallografi. Forskere kan visualisere områder i strukturen, der tillader interaktion med andre molekyler ved at forstå proteiners tredimensionelle strukturer (for eksempel for bedre at forstå, hvordan enzymer, substrater og ligander interagerer). Desuden er krystallisering en effektiv metode til at skabe rene proteiner, der er fri for forurening fra andre proteiner eller fremmed biologisk materiale, og dermed tilbyder en alternativ metode til oprensning og separation i forhold til præparativ kromatografi. 

Krystallisering forløber gennem en række indbyrdes afhængige mekanismer, som hver især påvirkes unikt af valget af procesparametre: nukleation, vækst, olieudskillelse, agglomeration, brud, såning og polymorf overgang.

Ofte forekommer disse mekanismer samtidig, hvilket gør effektiv krystallisationsdesign til en udfordring. I mangel af mekanistisk forståelse er forskere afhængige af forsøg og fejl for at justere procesparametre og optimere udbytte, renhed og krystalstørrelse. Ved at forstå, hvilke mekanismer der forekommer under krystallisering, kan forskere anvende strategier til at levere et krystalprodukt med de ønskede egenskaber.

Proteiner bliver i stigende grad vigtige som terapeutiske lægemidler. Dog indebærer produktion af proteiner med nødvendig stabilitet væsentlige udfordringer, herunder produktvariation, tab af struktur, der ville reducere effektiviteten, og dannelse af potentielt farlige biprodukter. Proteinkrystallisering er en metode til at producere rene, stabile faste doseringsformer samt en række injicerede og infunderede terapeutika, der er forbundet med proteinkrystaller. Tidligere har proteinkrystallisering været en laboratorieaktivitet til støtte for røntgenkrystallografi, men på grund af den eksponentielle vækst i proteinbaserede terapeutika bliver opskalering af proteinkrystallisering til produktionsniveauer stadig vigtigere og et område med intensivt fokus.

Opskalering af proteinkrystallisering er grundlæggende analog med småmolekylekrystallisering i kravene om at optimere Kritiske Procesparametre (CPP'er) på laboratorieniveau for at opnå Kritiske Kvalitetsattributter (CQA'er) af et krystalliseret lægemiddelstof på kommercielle skalaer. En holistisk platform for udvikling og opskalering af proteinkrystallisering omfatter typisk:

• In-situ partikelsystemkarakterisering
• Spektroskopisk overvågning og polymorf karakterisering
• Optimering af procedure- og feedbackkontrolstrategier gennem integrerede moduler og sensorer

Der er store farmaceutiske anvendelser forbundet med proteinkrystallisering: medicinsk kemi via strukturel biologi, udvikling af proteinlægemidler, opskalering, separation og oprensning, formulering og lægemiddellevering.

• Medicinsk kemi via strukturel biologi. Fremskridt inden for proteinkrystalliseringsteknikker og forbedret røntgenkrystallografi har ført til bestemmelse af titusindvis af tredimensionelle proteinstrukturer. Det er muligt at forstå lægemiddel-receptorinteraktioner i stor detalje ved at bestemme strukturen af disse komplekse makromolekyler og visualisere bindingssteder. Denne information muliggør en dybere molekylær forståelse af proteinhæmmere, allosteriske aktivatorer, cofaktorer og endda enzymatiske katalytiske steder eller 'aktive steder' – hvilket resulterer i bedre lægemidler med forbedret effektivitet. Et klassisk eksempel på vigtigheden af at forstå protein-hæmmerstruktur via krystallografi demonstreres af de store fremskridt i udviklingen af HIV-proteaser.
• Udvikling, opskalering, separation og oprensning for proteinbaserede terapeutika. Udover at dyrke enkeltstående proteinkrystaller til røntgenkrystallografi har medicinalindustrien øget indsatsen i udviklingen af proteinkrystalbaserede terapeutika. Målet med disse anvendelser er at udvikle og opskalere til store mængder rene, stabile proteinkrystaller, som har den rette partikelstørrelse og velkontrolleret partikelstørrelsesfordeling. I forhold til præparativ kromatografi har proteinkrystallisering potentialet til at være en omkostningseffektiv alternativ metode til separation og oprensning af makromolekyler og til isolering af kirale molekyler. Værktøjerne til opskalering af proteinkrystalliseringer er analoge med dem, der bruges til opskalering af kemiske reaktioner med behov for forståelse af CPP'er og deres effekt på CQA'er.
• Formulering og lægemiddellevering. Protein-terapeutika administreres som opløsninger og kan leveres via injektion eller infusion. Fordi store mængder protein skal leveres, fortyndes de infunderede proteinopløsninger for at undgå viskositets- og aggregeringsproblemer. Dette er mindre bekvemt for patienten og hospitalet på grund af den tid, det tager at infundere hele behandlingen, men kan også bidrage til fænomenet med lavere patientoverholdelse ved enhver form for parenteral administration. Brug af den krystallinske form af proteiner i suspension er af stor interesse, da disse formuleringer har færre viskositetsproblemer og kan leveres ved højere koncentrationer. Et andet vigtigt punkt er, at størrelsen af proteinkrystaller skal kontrolleres nøje for at sikre, at suspensionen let kan passere gennem en injektions- eller infusionsnål. Også vigtigt er, at eventuelle resterende krystaller, som ikke opløses under rekonstituering, heller ikke må overstige kritiske partikelstørrelser, der kan forårsage bivirkninger på grund af kapillærakkumulering i blodkarrene, hvilket generelt minimerer betydelige partikelmængder >15 µm. 

1. Vælg et passende opløsningsmiddel. Almindelige overvejelser inkluderer, hvor meget opløst stof der kan opløses (opløselighed), hvor praktisk opløsningsmidlet er at håndtere (sikkerhed), og hvordan opløsningsmidlet vil påvirke stabiliteten og fri energi-tilstandene for peptidet eller proteinet.
2. Opnå oversaturation. Opvarm det opløselige peptid/protein lægemiddelstof i opløsningsmiddel eller buffer til en maksimal tilladt tolerance (normalt begrænset af denaturering). Opløsningen vil blive oversat.
3. Krystalliser produktet ved at kontrollere CPP'er. Reducer opløseligheden ved afkøling, tilsætning af anti-opløsningsmiddel, fordampning eller reaktion. Når opløseligheden reduceres, nås et punkt, hvor krystaller vil nukleere og derefter vokse. Højrenhed produktkrystaller bør vokse, selvom motiver med høj fri energi kan danne alternative eller ikke-krystallinske strukturer; at forhindre dette kræver omhyggelig CPP-kontrol, hvis det overhovedet er praktisk.
4. Lad systemet nå ligevægt. Dette gøres for at maksimere udbyttet af fast lægemiddelprodukt.
5. Filtrer og tør det rensede produkt.

Der findes flere metoder, der anvendes til at dyrke protein krystaller; blandt de mest almindelige er dampdiffusion og mikrobatch. Den førstnævnte metode har to variationer, beskrevet som hængende dråbe og siddende dråbe, og begge fungerer grundlæggende på samme måde. I et forseglet system ligevægtssætter en dråbe af opløsning, der indeholder protein, buffer og præcipitant, med et reservoir, der indeholder højere koncentrationer af samme opløsning, men uden protein. Vand fra dråben med proteinet fordamper og tiltrækkes af den højere koncentrationsopløsning i reservoiret. Når koncentrationen af opløste stoffer i dråben stiger, begynder proteinet at krystallisere. I mikrobatch-metoden introduceres proteiner og andre reagenser og holdes under et tyndt lag mineralolie, der eliminerer vanddiffusion. Mikrobatch er dybest set en lille reaktor, der indeholder alle nødvendige ingredienser i de korrekte, stabile koncentrationer for at tillade krystallisering.

Da det ofte er empirisk at finde det korrekte sæt reagenser, parametre og betingelser, der er nødvendige for at krystallisere et protein, er den mest praktiske metode til succesfuld proteinkrystallisering at bruge et varieret udvalg af eksperimentelle betingelser baseret på tidligere erfaring. Den nemmeste måde at gøre dette på er ved at bruge kommercielt tilgængelige proteinkrystal screeningskits, der indeholder forpaknede opløsninger med buffere, præcipitater osv. indeholdt i multi-brøndplader. Hængende dråbe dampdiffusionsmetoden anvendes til at dyrke krystaller med disse kits. Når der kræves storskala screening, findes der højkapacitets systemer, der automatiserer mikrobatch-metoden, hvilket sparer tid og besvær samtidig med at mængden af renset protein, der kræves, minimeres. For storskala proteinkrystalliseringer, der kræves til farmaceutiske eller industrielle anvendelser, danner de oplysninger, der opnås i screeningsforsøg, grundlaget for anvendelse i større automatiserede reaktorsystemer karakteriseret ved in-situ, realtids PAT. 

Som støtte til procesudvikling og produktion er et af de vigtigste indledende trin til succesfuld krystallisering af proteiner at sikre, at der er tilstrækkelig forsyning af højt renset og velkarakteriseret protein til rådighed. Ud over at proteinet skal være rent (dvs. fri for forurenende stoffer, såsom urenheder fra fermenteringsmatricer), bør proteinet være homogent og stabilt (eller stabiliseret) i opløsning med:

• Minimal aggregering (Figur A)
• Korrekt sekundær, tertiær og kvartær struktur (Figur B)
• Eventuelle konjugat- eller rekombinante modifikationer (Figur C)

Derudover skal alle reagenser og opløsningsmidler, der anvendes i proteinkrystalliseringsprocessen, være fri for forurenende stoffer, da disse kan have betydelig indflydelse på nukleation.

Ligesom ved krystallisering af små molekyler krystalliserer proteiner fra oversaturerede opløsninger. For små molekyler, der danner robuste krystallinske gitter, er temperaturmanipulation en primær metode til at opnå oversaturation; dette er også nyttigt for proteiner. Dog er et reduceret temperaturområde tilladt, da protein krystaller typisk har opløsningsmiddel som en del af krystalstrukturen, ofte er temperaturfølsomme og tilbøjelige til denaturering og aggregering.

Små molekyler har betydeligt færre grader af stereoskopisk frihed og krystalliserer derfor meget lettere. Store molekyle peptider har mange flere interne sure, basiske, polære, upolære interaktioner og frastødende kræfter, der modstår ordnet krystallisering, et fænomen, der forværres for endnu større proteiner. De fleste krystalliseringskompatible peptider indeholder også et betydeligt antal disulfidbindinger, som er afgørende for immobilisering af strukturelle motiver. Omfanget af intramolekylær uorden eller mulig variation i struktur er en vigtig egenskab, der bestemmer, om et peptid eller protein overhovedet kan krystallisere frem for at præcipitere. Selv hvis molekylet er forudbestemt med egenskaber, der er egnede til krystallisering, er der en række påvirkende procesparametre, der påvirker procesens kommercielle levedygtighed og skal karakteriseres.

Ud over temperatur påvirker en række andre faktorer proteinkrystallisering via oversaturation, herunder pH-justering og den ioniske styrke af en opløsning, tilsætning af salte og præcipitater såsom PEG for at hjælpe med at reducere proteinopløselighed, typen af ligand til stede osv. Nøglen er at oversaturere opløsningen inden for et miljø, der ikke forstyrrer proteinets normale karakter. Dette understreger vigtigheden af at finde et sæt variable og betingelser, der resulterer i krystaller med korrekt morfologi, renhed og acceptable vækstrater.

Proteinkrystallisering foregår gennem en række indbyrdes afhængige mekanismer:

1. Nukleation
2. Vækst
3. Oiling Out i Krystallisering
4. Agglomerering
5. Brud
6. Seeding
7. Polymorfisme Kemi

Disse mekanismer, som ofte er skjult for forskere, spiller en dominerende rolle i at definere resultatet af en krystalliseringsproces.

Udvikling og opskalering af krystalliseringer for proteinbaserede terapeutika kræver en dybdegående forståelse af de variable og betingelser, der påvirker krystalliseringsprocessen. Som ved andre krystalliseringer kræver opnåelse af ønsket krystalform, form, partikelstørrelse og størrelsesfordeling omhyggelig kontrol for at opnå ensartet produktkvalitet. Enhver variation i CQAs for proteinkrystalsuspensioner vil direkte påvirke terapeutisk effektivitet. Da protein krystaller er meget følsomme over for deres vækstmiljø og let kan beskadiges af overdreven temperatur, tab af opløsningsmiddel og andre eksterne belastninger eller endda prøvetagningsprocessen, er det ønskeligt at måle CPP'er og produktkvalitet in situ, dvs. uden at fjerne krystallerne fra deres opløsningsmiljø.

• EasyMax og Optimax automatiserede kemiske reaktorer muliggør præcis kontrol, justering og registrering af parametre, herunder temperatur, pH, ledningsevne, omrøringshastighed og dosering af buffere og hjælpestoffer, som er kritisk vigtige for succesfuld udvikling og opskalering af proteinkrystalliseringer
• In-situ analytiske teknologiværktøjer, der hjælper med overvågning, fejlfinding og korrektion af procesafvigelser, er også nyttige
  • In-situ Raman spektroskopi og FTIR spektroskopi sporer reagenskoncentrationer, overvåger krystalstrukturvækst og måler også koncentrationen af overmættede opløsninger
  • ParticleTrack (med FBRM) teknologi overvåger den ændrende krystalstørrelse og størrelsesfordeling i realtid som nøgleelementer i krystalliseringsprocessen
  • EasyViewer muliggør visualisering og billedanalyse af krystalliseringsprocessen, mens den skrider frem

Når automatiserede laboratoriereaktorer anvendes i forbindelse med realtids in-situ analytikere, kan virkningen af procesparametre på krystalliseringsmekanismer såsom aggregering, vækst, agglomerering, brud og formændring identificeres. Præcis kontrol over krystalliseringsprocessen i forbindelse med kontinuerlig, in-situ overvågning af krystalformationsforløbet muliggør optimering og opskalering, der er faktabaseret og datadrevet.

EasyMax automatiseret laboratoriereaktor er en komplet arbejdsstation til parameteroptimering i proteinkrystallisering for at støtte udvikling og opskalering design og udførelse. Dette fuldautomatiske system muliggør præcis kontrol over procesparametre.

• Styr CPP'er inklusive doseringshastigheder, temperatur, omrøring, pH og ledningsevne
• Integreres let med in-situ analytik til krystallisering, herunder ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) og EasyViewer (in-situ billedanalyse)
• iC software muliggør automatiseret udførelse og kontrol af alle eksperimenter og perifert udstyr samt fuld datafangst og journalføring

ReactIR anvender mid-infrarød spektroskopi til at måle opløsningsfasen i krystalliseringsstudier. ReactIR-målinger påvirkes ikke af suspenderede faste stoffer, bobler eller anden partikelmasse.

• Følg individuelle krystalliseringsopløste stoffer in situ og i realtid.
• Mål opløsningskoncentrationer til støtte for overmættelsesstudier
• Lever handlingsrettede dataanalyser til realtidsbeslutningstagning og kontrol

ReactRaman anvender Raman spektroskopi til at give molekylær analyse af partikler i opløsning

• Følg krystalvækst, struktur og morfologi ikke-destruktivt, in situ og i realtid
• Bestem parametereffekter og optimer krystalliseringsbetingelser og variable for at opnå kvalitetsmål

ParticleTrack anvender Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)-teknologi og er et optisk, probebaseret instrument, der indsættes direkte i et kar for at spore ændringer i partikelstørrelse og antal i realtid. ParticleTrack bruger målinger af Chord Length Distribution til at opnå Crystal Size Distribution (CSD).

• Proteinkrystaller overvåges kontinuerligt, mens eksperimentelle betingelser varieres
• Følg batch- eller kontinuerlig vækst under krystallisering i realtid uden behov for prøveudtagning
• Karakteriser betingelser, der påvirker nukleation, aggregering, polymorfi og andre systemegenskaber

EasyViewer er et probebaseret instrument, der indsættes direkte i et kar for at tage billeder af partikelsystemer. EasyViewer udfører billedanalyse og måler partikelantal, størrelsesfordeling og morfologi ud fra tidsopløste, inline billeder af processen, hvilket gør det muligt at følge populationer over tid.

• Proteinkrystaller overvåges kontinuerligt, mens eksperimentelle betingelser varieres
• Følg batch- eller kontinuerlig vækst under krystallisering i realtid uden behov for prøveudtagning
• Visualiser krystalliseringsparametre, der påvirker nukleation, aggregering, polymorfi og andre systemegenskaber i realtid

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Forfatterne rapporterede succes med at udvikle en effektiv metode til realtidsmonitorering af biofarmaceutiske krystalliseringer. Denne procedure bruger ParticleTrack til at måle CLD for en række biofarmaceutiske molekyler under både statiske og dynamiske forhold og anvender derefter matematisk modellering til at omdanne CLD til CSD. De undersøgte biomolekyler har forskellige krystalformer, som afhænger af de eksperimentelle betingelser under krystalliseringen. Lysozym kan danne tetragonale og nåleformede krystaller, rHu insulin danner rhomboedriske krystaller, og B12 danner polyedriske krystaller.

Forfatterne udviklede modeller til at bestemme CSD for de lav-aspekt-ratio tetragonale, rhomboedriske, polyedriske krystaller og højaspekt-ratio nålekrystaller. Forfatterne brugte tre forskellige modeller til bestemmelse af krystalstørrelsesfordelingen:

• En model udviklet af en anden forskergruppe, som antog, at krystaller kunne repræsenteres som kugler (spherical equivalent diameter, SED), var effektiv for krystaller med lav aspekt-ratio
• For krystaller med høj aspekt-ratio udviklede forfatterne i denne undersøgelse en model baseret på bredden
• Endelig udviklede de en model baseret på længden, som krævede, at aspekt-ratioen blev specificeret

Resultaterne fra modellerne udviklet til beregning af CSD ud fra FBRM-målingerne blev derefter sammenlignet med CSD-målinger opnået ved billedanalyse.

Forsøg på at overvåge en uigennemsigtig, krystallinsk slurry udgør udfordringer, især når produktionsspecifikationer kræver en snæver partikelstørrelsesfordeling (PSD). For injicerbare proteinkrystalformuleringer kan PSD i høj grad påvirke viskositeten samt fungere som en tidlig advarsel for aggregering eller andre nedbrydningsevents, der potentielt kan kompromittere formuleringen. In-situ overvågning blev brugt i en opskalering batch-krystallisering for at karakterisere dannelse og vækst af humane væksthormon (hGH) krystaller. Realtidsanalyse opdagede en afvigelse fra den sædvanlige PSD-profil forårsaget af forskelle i omrøring mellem karene. Dette blev bekræftet ved efterfølgende offline billedanalyse (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Kontinuerlige krystalliseringsprocesser i farmaceutisk produktion: En gennemgang. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameterestimering af den stokastiske primære nukleationskinetik ved stokastiske integraler ved brug af fokuserede stråle-reflektansmålinger. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Realtidsovervågning af biofarmaceutisk krystallisering: Fra kordelængdefordeling til krystalstørrelsesfordeling for lysozym, rHu insulin og vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulation af krystallisering i lysozym og supramolekylær selvorganisering i opløsning ved brug af ioniske væsker. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modellering og kontrol af krystalform i kontinuerlig protein krystallisering. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Forbedring af krystalproduktionshastigheden og reduktion af polydispersitet i kontinuerlig protein krystallisering. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Proteinkrystaller til levering af biofarmaceutika. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301