タンパク質の結晶化とは、複雑な高分子の構造化された秩序ある格子を作り出す行為および方法です。タンパク質は通常、固体としてはアモルファスで変性しやすいですが、結晶格子内に存在するタンパク質は変性に強く、より安定しています。適切で好ましい環境に置かれると、タンパク質は結晶化することができます。タンパク質の結晶化は、結晶化プロセスに影響を与える変数の非常に複雑な相互作用のため、科学であると同時に芸術とも見なされています。
タンパク質結晶を作成する最も一般的な理由は、通常、X線回折結晶学を通じた構造生物学の研究を支援するためです。研究者はタンパク質の3次元構造を理解することで、酵素、基質、リガンドがどのように相互作用するかをよりよく理解するために、他の分子と相互作用を許す枠組みの領域を視覚化できます。さらに、 結晶化は、他のタンパク質や余分な生物学的物質による汚染がない純粋なタンパク質を作成する効果的な手段であり、調製クロマトグラフィーに代わる精製および分離の方法を提供します。
結晶化は、プロセスパラメータの選択によりそれぞれ独特に影響を受ける一連の相互依存するメカニズム（核生成、成長、油分離、凝集、破砕、シーディング、多形転移）を通じて進行します。
これらのメカニズムはしばしば同時に発生し、効果的な結晶化設計を困難にします。メカニズムの理解がない場合、科学者は試行錯誤に頼ってプロセスパラメータを調整し、収率、純度、結晶サイズを最適化します。結晶化中にどのメカニズムが発生するかを理解することで、科学者は望ましい特性を持つ結晶製品を提供するための戦略を展開できます。
タンパク質は治療薬としてますます重要になっています。しかし、必要な安定性を持つタンパク質を生産することは、製品の変動、効果を低減する構造の喪失、潜在的に有害な副生成物の形成などの重要な課題を伴います。タンパク質の結晶化は、純粋で安定した固形剤形態を生産する方法であり、タンパク質結晶に関連する注射および点滴治療薬も多数あります。過去にはタンパク質結晶化はX線結晶学を支援するための実験室での活動でしたが、タンパク質ベースの治療薬の指数関数的な成長により、タンパク質結晶化の生産レベルへのスケールアップがますます重要であり、集中的な注目分野となっています。
タンパク質結晶化のスケールアップは、商業規模での結晶化された医薬品物質の重要品質特性（CQA）を達成するために、実験室規模で重要プロセスパラメータ（CPP）を最適化する必要性において、小分子の結晶化と基本的に類似しています。タンパク質結晶化プロセスの開発とスケールアップのための包括的なプラットフォームは通常、以下を含みます：
タンパク質結晶化に関連する主要な医薬品用途は、構造生物学による医薬化学、タンパク質医薬品の開発、スケールアップ、分離および精製、製剤および薬物送達です。
タンパク質結晶を成長させるためにいくつかの方法が用いられますが、最も一般的なのは蒸気拡散法とマイクロバッチ法です。前者にはハンギングドロップ法とシッティングドロップ法の2つの変法があり、基本的には同じ原理で動作します。密閉系において、タンパク質、バッファー、沈殿剤を含む溶液の滴が、タンパク質を含まないが溶質濃度の高いリザーバーと平衡状態になります。タンパク質を含む滴の水分が蒸発し、濃度の高いリザーバーの溶液に引き寄せられます。滴中の溶質濃度が増加すると、タンパク質が結晶化し始めます。マイクロバッチ法では、タンパク質や他の試薬が鉱油の薄い層の下に導入され、水の拡散を防ぎます。マイクロバッチは、結晶化が起こるために必要な成分を正確かつ安定した濃度で含む小さなリアクターのようなものです。
タンパク質を結晶化するために必要な試薬、パラメータ、条件の正しい組み合わせを見つけることは多くの場合経験的であるため、成功するタンパク質結晶化の最も実用的な手段は、過去の経験に基づいたさまざまな実験条件を使用することです。これを最も簡単に行う方法は、市販のタンパク質結晶スクリーニングキットを使用することで、これにはバッファー、沈殿剤などが含まれた複数ウェルプレートの事前調製溶液が含まれています。これらのキットではハンギングドロップ蒸気拡散法が適用されます。大規模なスクリーニングが必要な場合、マイクロバッチ法を自動化するハイスループットシステムが利用可能で、時間と手間を節約し、同時に必要な精製タンパク質の量を最小限に抑えます。製薬や工業用途で必要な大規模なタンパク質結晶化では、スクリーニング実験で得られた情報が、現場でのリアルタイムPATを特徴とする大規模自動リアクターシステムへの応用の基礎となります。
プロセス開発および製造を支援するために、タンパク質を成功裏に結晶化するための最も重要な初期ステップの1つは、高純度で十分に特性評価されたタンパク質の十分な供給を確保することです。タンパク質が純粋であること（発酵マトリックスからの不純物などの汚染物質がないこと）に加え、タンパク質は均一で安定している（または安定化されている）必要があります：
さらに、タンパク質結晶化プロセスで使用されるすべての試薬および溶媒は汚染物質がないことが必要であり、これらは核生成に重大な影響を与える可能性があります。
小分子の結晶化と同様に、タンパク質は過飽和溶液から結晶化します。堅牢な結晶格子を形成する小分子では、温度操作が過飽和を達成する主な手段であり、これはタンパク質にも有効です。しかし、タンパク質結晶は通常、結晶構造の一部として溶媒を含み、温度に敏感で変性や凝集しやすいため、許容される温度範囲は狭くなります。
小分子は立体的自由度が著しく少なく、その結果として結晶化がはるかに容易です。大きな分子のペプチドは、内部に多くの酸性、塩基性、極性、非極性相互作用や反発力を持ち、秩序ある結晶化を妨げます。この現象はさらに大きなタンパク質で悪化します。結晶化に適したペプチドの多くは、構造モチーフを固定するために重要な多くのジスルフィド結合を含んでいます。分子内の無秩序の程度や構造の変動可能性は、ペプチドやタンパク質が沈殿するのではなく結晶化するかどうかを決定する重要な属性です。分子が結晶化に適した属性を持っていても、プロセスの商業的実現可能性に影響を与える多くのプロセスパラメータがあり、それらを特性評価する必要があります。
温度以外にも、pH調整や溶液のイオン強度、塩やPEGのような沈殿剤の添加、存在するリガンドの種類など、過飽和を介してタンパク質結晶化に影響を与え助ける多くの要因があります。重要なのは、タンパク質の通常の特性を乱さない環境内で溶液を過飽和にすることです。これは、正しい形態、純度、許容可能な成長速度を持つ結晶を得るための変数と条件の組み合わせを見つけることの重要性を示しています。
タンパク質の結晶化は、相互に依存する一連のメカニズムを経て進行します：
これらのメカニズムは、科学者にはしばしば見えにくいものですが、結晶化プロセスの結果を決定づける上で支配的な役割を果たします。
タンパク質ベースの治療薬の結晶化の開発およびスケールアップには、結晶化プロセスに影響を与える変数と条件を深く理解することが必要です。他の結晶化と同様に、望ましい結晶形態、形状、粒子サイズ、およびサイズ分布を達成するには、製品品質の一貫性を確保するために慎重な制御が求められます。タンパク質結晶懸濁液のCQAの変動は、治療効果に直接影響します。タンパク質結晶は成長環境に非常に敏感であり、過度の温度、溶媒の喪失、その他の外部ストレス、さらにはサンプリングの過程で容易に損傷する可能性があるため、CPPおよび製品品質をインシチュで、すなわち結晶を溶液環境から取り出さずに測定することが望ましいです。
自動化されたラボリアクターをリアルタイムのインシチュ分析装置と組み合わせて使用することで、凝集、成長、凝集体形成、破砕、形状変化などの結晶化メカニズムに対するプロセスパラメータの影響を特定できます。結晶形成の進行を連続的にインシチュで監視しながら結晶化プロセスを正確に制御することで、最適化およびスケールアップを事実に基づきデータ駆動型で行うことが可能になります。
EasyMax自動化ラボリアクターは、タンパク質結晶化におけるパラメータ最適化のための完全なワークステーションであり、開発およびスケールアップの設計と実行をサポートします。この完全自動化システムは、プロセスパラメータの正確な制御を可能にします。
ReactIRは、中赤外分光法を用いて結晶化研究における溶液相を測定します。ReactIRの測定は、懸濁固体、気泡、その他の粒子状物質の影響を受けません。
ReactRamanは、ラマン分光法を用いて溶液中の粒子の分子分析を提供します
ParticleTrackはFocused Beam Reflectance Measurement (FBRM)技術を使用した光学的なプローブベースの装置で、容器内に直接挿入して粒子サイズと数の変化をリアルタイムで追跡します。ParticleTrackはChord Length Distribution測定を用いてCrystal Size Distribution（CSD）を取得します。
EasyViewerはプローブベースの装置で、容器内に直接挿入して粒子系の画像を取得します。EasyViewerは画像解析を行い、プロセスの時間分解インライン画像から粒子数、サイズ分布、形態を測定し、集団の変化を時間経過で追跡可能にします。
Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.
著者らはバイオ医薬品の結晶化をリアルタイムで効率的に監視する手法の開発に成功したと報告しています。この手法はParticleTrackを用いて静的および動的条件下で一連のバイオ医薬品分子のCLDを測定し、数学的モデリングを適用してCLDをCSDに変換します。調査対象の生体分子は結晶形状が異なり、結晶化の実験条件に依存します。リゾチームは四角錐形および針状結晶を生成し、rHuインスリンは菱面体結晶を形成し、B12は多面体結晶を形成します。
著者らは低アスペクト比の四角錐形、菱面体、多面体結晶および高アスペクト比の針状結晶のCSDを決定するモデルを開発しました。結晶サイズ分布を決定するために3つの異なるモデルを使用しました：
FBRM測定からCSDを計算するために開発されたモデルの結果は、画像解析によるCSD測定と比較されました。
不透明な結晶スラリーを監視することは、特に製造仕様が狭い粒子サイズ分布（PSD）を要求する場合に課題となります。注射用タンパク質結晶製剤において、PSDは粘度に大きく影響し、凝集やその他の劣化事象の早期警告としても役立ち、製剤の品質を損なう可能性があります。スケールアップバッチ結晶化研究では、in-situ監視を用いてヒト成長ホルモン（hGH）結晶の形成と成長を特性評価しました。リアルタイム分析により、容器間の混合の違いによって通常のPSDプロファイルからの逸脱が検出されました。これは後のオフライン画像解析（IA）によって確認されました。