Biokatalyse og enzymkatalyse

Biokatalyse, eller enzymatisk katalyse, bruger biologisk aktive komponenter til at katalysere kemiske transformationer. Biokatalyse faciliterer et spektrum af primært kulstofcentrerede reaktioner i miljøer, der spænder fra cellefrie, fuldt in vitro til fermenteringsmedierede processer i levende cellekultur.

Biokatalyse repræsenterer et nyttigt alternativ til traditionel kemisk katalyse af flere grunde. Enzymatiske biokatalysatorreaktioner:

• Er meget kemo-, regio- og enantiospecifikke
• Har ofte hurtig kinetik
• Fungerer under mildere forhold end kemiske katalysatorer
• Eliminer problemet med affald, toksicitet og omkostninger ved metalkatalysatorer
• Reducer energibehovet forbundet med kemiske reaktioner

Målrettet konstruktion af biokatalysatorer forbedrer stabiliteten i opløsningsmidler ved forhøjede temperaturer, hvilket muliggør bred anvendelse af biokatalyse i den farmaceutiske, kemiske industri, biobrændstof- og fødevareindustri.

Download dette gratis white paper for at få mere at vide om, hvordan PAT og datavidenskab inden for forskning, udvikling og fremstilling af biokatalyseprocesser muliggør hurtig identifikation af ikke-levedygtige synteseruter, kinetiske reaktionsmålinger og screening og kontrol af procesparametre.

Biokatalyse er forbundet med "grøn", bæredygtig og omkostningseffektiv fremstilling af kemiske produkter. I forhold til kemokatalyse tilbyder biokatalysatorer iboende fordele for syntese, herunder:

• Betydelig diversitet af forbindelser, enten fra naturlige eller genetisk modificerede kilder, til at tackle en bred vifte af kemiske omdannelser
• Specificitet af biokatalytiske reaktioner, der mindsker behovet for specifikke klassiske kemiske syntese-/forarbejdningsstrategier, såsom brug af blokerings-/deblokeringsgrupper, enantiomer blandingsseparation og oparbejdning for at fjerne uønskede biprodukter
• Forenkling af infrastruktur- og råvarekrav, da mange biokatalyseprocesser kan udføres i enkeltpot-reaktioner og eliminere reaktionstrin, der kræves af traditionel kemisk katalyse  

Enzymer, der anvendes i biokatalyse, har vigtige og ofte udnyttede evner, som omfatter:

A) Funktionel gruppe eller stedspecifik binding og målgenkendelse af andre biologiske lægemidler eller små molekyler

B) Fremmet association eller forskydning af andre biologiske lægemidler eller små molekyler

C) Strukturelle eller elektrostatiske egenskaber, der letter iontransport

D) Beordret til uordnede strukturelle transformationer og dermed varierede katalytiske aktiviteter

E) Allosteriske eller indirekte modifikationer, som inducerer eller undertrykker enzymaktivitet

Forskning i forbedrede eller modificerede rekombinante biokatalysatorer fortsætter med at udvide deres anvendelighed inden for hård kemi, forbedre reaktionsomfang, enzymrobusthed og genanvendelighed. Naturlige og konstruerede biokatalysatorer er nu tilgængelige til at udføre vigtige kemiske transformationer såsom dannelse af C-C-bindinger, amidbindinger, dannelse af kirale aminer og C-H funktionalisering.

Omfanget af enzymer, der anvendes til biotransformationer, er usædvanligt bredt og dækker stort set alle industrisektorer, herunder fødevarer, farmaceutiske produkter, tekstiler, biobrændstoffer, papir, kemikalier og husholdningsprodukter. Inden for syntese af finkemikalier, lægemidler og beslægtede mellemprodukter er biokatalyse (dvs. enzymatisk katalyse eller enzymmedieret katalyse) hurtigt vokset som en muliggørende teknologi. Enzymer er tilgængelige til forskellige biotransformationer såsom oxidationer, reduktioner, tilføjelser og elimineringer. 

De seks hovedklasser af enzymer og anvendelseseksempler: 

1. Oxidoreduktaser, der katalyserer molekylære oxidationer og reduktioner. Monooxygenase-enzymer med molekylært ilt muliggør dannelse af CO-bindinger, og specifikke enzymer er blevet konstrueret til at muliggøre oxidation af alkoholer, ketoner, aldehyder og aminer. Med hensyn til reduktioner muliggør ketoreduktaser (KREDS) og dehydrogenaser syntese af enantiospecifikke alkoholer. Andre enzymer kan reducere bindinger såsom C=N, omdanne nitriler til aminer. 

2. Transferaser er nyttige til at overføre funktionelle grupper fra et molekyle til et andet. Kinase og fosfataser (tilsætning og fjernelse af fosfater) er især vigtige for molekylære signalkaskader, DNA-replikation, RNA-transkription og andre funktioner. Der er også mange biologisk signifikante transferaser, der tjener funktioner, såsom omdannelse af ketoner eller aldehyder til aminer, og som kan gøre det stereoselektivt.

3. Hydrolaser katalyserer hydrolyse af forskellige substrater. Nukleaser eller proteaser er produktive og essentielle i nukleinsyre- og peptidgenanvendelse. Hydrolaser såsom lipase, protease og acylase fungerer som katalysatorer for Michael 1,4-tilsætninger, der i vid udstrækning bruges til at danne CC- og carbon-heteroatombindinger.

4. Lyaser katalyserer generelt reaktioner gennem dannelse eller eliminering af dobbeltbindinger. Til forskel fra en substitutionsreaktion med hydrolaser er carboxylase- eller decarboxylasereaktioner almindelige i farmaceutisk biokatalyse til tilsætning eller fjernelse af CO₂, ligesom CN-lyaser, der kan bruges til at generere aminosyrer, herunder substituerede asparaginsyrer og alaniner.

5. Isomeraser muliggør omarrangering af atomer i et molekyle. Isomeraser, såsom racemaser, inverterer stereokemi ved det chirale kulstof, og cis-trans-isomeraser katalyserer isomeriseringen af cis-trans-isomerer i alkener eller cycloalkaner. Omdannelsen af glukose til fruktose via glukoseisomerase repræsenterer en stor industriel enzymatisk biotransformation.

6. Ligaser danner nye kemiske bindinger ved at forbinde to molekyler for at danne et større molekyle. En af de vigtigste anvendelser er brugen af DNA-ligase til dannelse af rekombinante DNA-molekyler og er komplementet til endo- eller exonukleaser.

Produktion af enzymkatalysatorer. Generelt syntetiseres naturlige eller rekombinante enzymer til biokatalyse først gennem fermenteringer, oftest ved hjælp af bakterier, men er lejlighedsvis afledt af gærkulturer. Selv om enzymer kan produceres i mere komplekse pattedyrscellekulturer, indeholder bakterier og gær normalt tilstrækkelige og naturligt forekommende molekylære veje til at opnå de foldning og moderate post-translationelle modifikationer, der er nødvendige for rekombinante biokatalytiske enzymer. Enzymer, der produceres ved sådanne fermenteringer, høstes normalt ved lysis eller anden forstyrrelse af cellestrukturerne for at frigive de rekombinante enzymer og renses yderligere i en proces, der ligner andre biologiske enzymer.  Lægemidler. Fermentering, høst og downstream-forarbejdning giver deres egne udfordringer, som løses ved at udnytte Process Analytical Technology (PAT).

Stabilisering og immobilisering. Enzymimmobilisering bruges til at opnå mere stabile, aktive og genanvendelige enzymer. Generelt kan tværbundne enzymaggregater (CLEA'er) dannes med flere forskellige faste substrater såsom silica, harpikser eller polymerer såsom PEG og endda andre komplekser såsom lipid-nanopartikler (LNP'er). For nogle flowkemiske applikationer kan CLEA'er også dannes på overflader og sensorer som dem, der bruges i overfladeforbedrede målinger til analytiske og katalytiske formål. Lignende løsninger til vaccineformulering og adjuvansprocesser adresserer udfordringerne ved relateret komponentsyntese, adsorptioner, konjugationer eller andre associationer samt produktstabilitet og formulering.

Produktfangst og -isolering. Efter biokatalyse adskilles CLEA'er fra produkt og restreaktanter og kan derefter genbruges eller på anden måde tilbageholdes. Små molekyleprodukter kan derefter isoleres gennem filtrationer eller kromatografiprocesser, selvom mange processer fortsat favoriserer krystalliseringsmetoder. Biokatalyseprodukter med store molekyler vil generelt fortsætte med traditionelle downstream-behandlingsarbejdsgange.

Forståelse af den praktiske halveringstid og stabilitet af ethvert frit, substratbundet eller overfladeimmobiliseret enzym kan være afgørende for designet af korrekte biokatalyseprotokoller. Overvejelserne omfatter:

• Opløsningsmidler—Mange naturlige enzymer kæmper for at klare organiske opløsningsmiddelreaktioner. En konstant udviklende profil af konstruerede eller rekombinante enzymer forbedrer kompatibiliteten med organiske opløsningsmiddelforhold. Rekombinante enzymer er nu i stand til at katalysere reaktioner i organiske opløsningsmiddelmiljøer, for eksempel ved at muliggøre brugen af modificerede phosphoramider i oligonukleotidsyntese.
• pH-Enzymer fungerer generelt bedst inden for snævre pH-intervaller og toler pH-variation <0,5 pH-enheder. Således er pH-kontrol ofte en kritisk parameter for overvejelse for mange biokatalytiske reaktioner og kan være vanskelig eller kedelig at kontrollere manuelt. 
• Temperatur-Naturlige enzymer og deres rekombinante modstykker fungerer effektivt ved specifikke temperaturer med ret snævre intervaller. Temperaturafvigelser kan forårsage ændringer i reaktionskinetik, produktudbytte eller andre kritiske procesresultater.
• Opløst ilt -Denne kritiske procesparameter, der er særlig vigtig for iltnings- og reduktionsreaktioner, styres normalt af sparge- eller headspace-dosering af ilt eller inert gas. Optimering af mængden og masseoverførslen af opløst ilt (inklusive bobleegenskaber) til reaktionsblandingen er afgørende for at sikre, at oxidoreduktaseenzymer kan fungere med maksimal effektivitet.
• Blanding, væskedynamik og gasser -Korrekt blandingsapparat kan i høj grad påvirke livscyklussen for biokatalytiske enzymer, især over lange varigheder, flowkemi eller perfusionslignende kørsler. Opskalering af biokatalytiske reaktioner kan være suboptimal, hvis blandingen ikke er tilstrækkeligt karakteriseret. Blanding er også afgørende for korrekt gasfordeling og masseoverførsel.
• Reaktion støkiometri—Korrekte reagenser-til-enzym-forhold er kritiske og kan bestemmes ved Design of Experiments (DoE) undersøgelser, automatiseret af kemiske reaktorer og hjulpet af PAT integreret i procesudvikling.

Udvikling og opskalering af biokatalytiske reaktioner afhænger af arten af de specifikke biokatalysatorer, der anvendes, substrater, co-faktorer og reaktionsbetingelser. Som ved kemisk katalyse forstås denne komplekse, indbyrdes afhængige matrix af variabler bedst ved omhyggelig kontrol af reaktionsvariabler, når den kombineres med information fra analytiske målinger i realtid. Meget af procesudviklingen, opskaleringen og datatæthedsbegrænsningerne for moderne processer er imidlertid knyttet til den fortsatte manuelle orientering af biokatalysereaktioner, som har betydelige tids- og ressourceomkostninger. Manuel betjening indebærer, at personale til stede ved bioreaktoren til næsten konstant pasning, justering og prøveudtagning imødekommer stigende lovgivningsmæssige og institutionelle krav til proceskarakterisering og teknologioverførsel.

Uovervåget drift af biokatalyse er mulig gennem laboratorieautomatiseringsplatforme , der reagerer på dynamiske reaktionsforhold, der kontinuerligt måles gennem integrerede sensorer og procesanalytiske teknologier (PAT). Automatiserede syntesereaktorplatforme letter hurtigere eksperimenter med minimerede menneskelige fejl eller interventioner. Parret med modulær, automatiseret reaktorprøvetagning til offline kromatografisk analyse kan alle kritiske procesparametre (CPP) overlejres og trendes. Parameterkontrol og procesanalytiske data registreres automatisk i realtid og struktureres til datastyring og arkivering. Reduceret eksperimentel variabilitet og øget reproducerbarhed på tværs af forskellige reaktorskalaer strømliner evidensbaseret opskalering yderligere.

• EasyMax og OptiMax automatiserede reaktorer har vigtige roller for at sikre, at effekten af nøglevariabler i biotransformationer, såsom temperatur, pH, blandingshastigheder og dosering, kontrolleres præcist, effektivt modelleres og registreres.
• ReactIR og ReactRaman in-situ spektroskopiske teknologier er nyttige til at spore og måle vigtige reaktionsarter i realtid. ReactIR sporer nøgleanalytter i opløsning uden interferens fra suspenderede partikler såsom hele celler.
• ParticleTrack med FBRM-teknologi måler partikelstørrelse og fordeling i heterogene suspensioner. EasyViewer tager in-situ-billeder af partikler og udfører billedanalyse i realtid på systemets turbiditet, form, størrelse, morfologi, antal og fordelinger.
• EasySampler muliggør fuldautomatisk og uovervåget prøvetagning af kemiske reaktioner, herunder bratkøling og fortynding af prøver som forberedelse til offline analyse.
• Scale-up Suite procesudvikling og opskaleringssoftware muliggør hurtig udvikling, optimale processer og robust opskalering.

EasyMax automatiseret reaktor er en komplet arbejdsstation til parameteroptimering i biokatalyse for at understøtte udvikling, opskalering og udførelse. Dette fuldautomatiske system muliggør præcis kontrol over procesparametre.

• Administrer CPP'er, herunder identifikation af kildemateriale, doseringshastigheder, temperatur, omrøring, headspace, sparging, pH-måling og titrering
• Integreres let med in-situ-analyse til biokatalyse, herunder ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (in-situ billedanalyse) og EasySampler (automatiseret, in-situ reaktorprøvetagning)
• Kør eksperimenter, når du er uden opsyn; Udfør intelligent automatiseret prøveudtagning, når offline-analyse er påkrævet
• iC Software muliggør automatiseret udførelse og kontrol af alle eksperimenter og perifert udstyr samt fuld datafangst og registrering

ReactIR bruger FTIR-spektroskopi til at måle vandige og organisk opløselige komponenter i biokatalyseundersøgelser. ReactIR-målinger påvirkes ikke af suspenderede faste stoffer, bobler eller anden partikelmasse.

ReactRaman bruger Raman-spektroskopi til at give molekylær analyse af partikler og reaktionsanalyse.

• Overvåger flere produktkvalitetsattributter på stedet og i realtid i en beholder eller flydende processtrøm
• Eliminerer forsinkelser i forbindelse med grabprøver
• Kvantificerer virkningen af forarbejdningstrin på produktudbytte og proceseffektivitet
• Giver handlingsrettede dataanalyser til beslutningstagning og kontrol i realtid
• Understøtter ICH-lovgivningsmæssige retningslinjer gennem datarige eksperimenter og digitalisering
• Hjælper med opskalering fra forskning og udvikling til produktion
• Måler analytkoncentrationer så lave som 500 ppm i volumener fra nogle få milliliter til tusindvis af liter

ParticleTrack bruger FBRM-teknologi (Focused Beam Reflectance Measurement ) og er et optisk sondebaseret instrument, der indsættes direkte i et fartøj for at spore skiftende partikelstørrelse og antal i realtid. ParticleTrack bruger målinger af akkordlængdefordeling (CLD) til at opnå partikelstørrelsesfordeling (PSD).

• Partikler og partikelstrukturer overvåges kontinuerligt, efterhånden som forsøgsbetingelser eller parametre varierer
• Karakterisere fastfasepartikelsyntese, enzymimmobilisering, spaltning og relaterede procesmorfologier
• Spor batch- eller kontinuerlig vækst af biokatalyseprodukter under biokatalyse i realtid uden behov for prøvefjernelse
• Karakterisere partikelsystemforhold, der påvirker kimdannelse, udfældninger, polymorfisme og andre systemattributter

EasyViewer er en sondebaseret partikelstørrelsesanalysator , der indsættes direkte i en beholder for at tage billeder af partikelsystemet. EasyViewer udfører billedanalyse og måler partikelantal, størrelsesfordeling og morfologi fra tidsopløste inline-billeder af processen, hvilket gør det muligt at trende populationer over tid.

• Partikler og partikelstrukturer overvåges kontinuerligt, efterhånden som forsøgsbetingelser eller parametre varierer
• Karakterisere fastfasepartikelsyntese, enzymimmobilisering, spaltning og relaterede procesmorfologier
• Måling af masseoverførsel (K_La) gennem boblekarakterisering
• Spor batch eller kontinuerlig vækst af biokatalyseprodukter under krystallisering i realtid uden behov for prøvefjernelse
• Karakterisere partikelsystemforhold, der påvirker kimdannelse, nedbør, polymorfisme og andre systemegenskaber

Design of Experiment (DoE) er et statistisk nyttigt middel til at minimere antallet af eksperimenter, der er nødvendige for at udforske effekten af variabler på reaktionsydelsen i laboratoriet. Alligevel er opskalering af enzymkatalyseprocesser til produktion fyldt med problemer. For eksempel tager mange biokatalyseundersøgelser ikke højde for variabler som opløsningsmidler, pH, temperatur og blanding i opskalering. Dynochem-modellering gør det muligt at tage højde for vigtige fysiske og termiske egenskaber i opskalering. Når kinetisk information bruges med Dynochem-modellering, kan egnede prøvetagningsslutpunkter bestemmes til biokatalyseprocesser, hvilket sparer tid og ressourcer. Dynochem-modellering forbedrer således udviklingen af kritiske procesparametre og effektivt procesdesignrum.