Downstream-forarbejdning inden for biofarmaceutisk industri

Downstream-behandling (DSP) er rækken af enhedsoperationer efter afslutningen af cellevækst og -ekspansion og den afsluttede produktion eller syntese af lægemiddelstoffer eller andre komponenter. Downstream-forarbejdning har til formål at isolere, rense og koncentrere det tidligere syntetiserede lægemiddelstof (DS) eller et andet produkt fra bulkdyrkningsmatrixen.Historisk set er der blevet investeret i at forbedre udbyttet og titeren opstrøms, hvilket gør udviklingen af biologiske lægemidler mere økonomisk. I tidligere år blev downstream-processer ikke behandlet på samme niveau og kræver nu yderligere optimering.

Biofarmaceutisk downstream-behandling refererer til genvinding og oprensning af et lægemiddelstof fra naturlige kilder, såsom dyre- eller bakterieceller. Biofarmaceutisk DSP er anvendelig i monoklonale antistoffer (mAb) eller proteinprocesser og fremstilling af oligonukleotider, polysaccharider, forskellige vacciner, biokonjugater, genterapier og celleterapiprodukter.

Downstream-behandling kan omfatte indledende formuleringsaktiviteter, hvilket betyder overgangen fra DS til lægemiddelprodukt (DP). Vigtige overvejelser omfatter styring og måling af produktkvalitetsattributter, flere procesparametre, kilder og mængder af urenheder, affaldsstrømme og biologiske farer.

DSP-aktiviteter udføres på procesudviklings-, pilot- og produktionsvægte i laboratorieskala og hjælpes af procesanalytisk teknologi (PAT) og MSAT-teams (Manufacturing Science and Technology), der fokuserer på procesoptimering, opskalering og fejlfinding. Sammenlignelig downstream-behandling på opdagelsesbiologiske skalaer eller tidlige stadier af high-throughput målscreening er ikke så almindelig, selvom den kan udføres på samme måde. i princippet.

Denne vejledning diskuterer, hvordan forskere bruger procesanalytisk teknologi (PAT) til at transformere daglige arbejdsgange og forbedre downstream-processer betydeligt. Emnerne omfatter:

• Overvågning af proteinkoncentration
• Optimering af bufferudvekslingsproces
• Vaccineadjuverens sammensætning, distribution og morfologi
• Automatisering af viral inaktivering
• Udvikling af biokonjugeringsproces

• Forbehandling: 
  Overfladeaktiv lysering, organisk faseabsorption: Produktadskillelse med lyse forfølger normalt et grundlæggende mål: effektivt at forstyrre de sekvestrerende strukturer, der indeholder lægemiddelstoffet eller produktet, og skabe fysisk adskillelse mellem snavs, urenheder og lægemiddelstoffet. Syre- eller overfladeaktivt lys bruges næsten udelukkende sammen med bakterie- eller gærkulturer. På samme måde er organisk faseabsorption og indfangning af et produkt mest almindelig blandt bakterielt ekspression og produktionssystemer og bruges lejlighedsvis til gærsystemer.
  Flokkulering og udfældning: Disse er metoder til manipulation af aktivt partikelsystem for at nå målet om adskillelse.Flokkulering  anvendes generelt som en metode til forberedelse før filtrering eller centrifugering. Anvendelse af flokkulering sikrer en høj masseflux over filtreringsenheder samt effektiv og omkostningseffektiv adskillelse af cellemateriale fra supernatant. Yderligere metoder til fjernelse af flokkuleringsmiddel og verifikationsprotokoller kan være påkrævet. Udfældning er en aktiv partikelmanipulation, der udløses af skiftende parametre, såsom opløsningsmiddel og ionstyrke for at mindske opløseligheden.
• Centrifugering: Bredt vedtaget som en metode til adskillelse i bioprocesser, er centrifugering en almindelig og vigtig teknik, der bruges til vilkårligt at adskille partikelaffald baseret på masse eller molekylvægt som en funktion af skålhastighed, fyldning og udledningshastigheder. Almindelige industrielle centrifuger fjerner betydelige mængder (op til 99 %) partikelmasse for partikelstørrelser så små som 5 μm og nogle gange så små som 1 μm for meget optimerede processer. På trods af denne effektivitet kan centrifuger stadig sende problematiske mængder af mikropartikler, og især nanopartikler, til downstream-operationer, der vil kræve yderligere behandling. Med bioprocesser, der almindeligvis opnår høj til meget høj total biomasse (mikro- og nanopartikler) og variable endelige levedygtige celletætheder, kan faste centrifugeringskapaciteter også begrænse procesgennemstrømningen og anses ikke generelt for at være praktiske til kontinuerlig biobehandling.
  
• Dybdefiltrering, hule fibre: Afhængigt af produktets og processens art omfatter høstmetoder typisk dybdefiltrering (fig. 1-1) eller hulfiberfiltre (fig. 1-2). Ved dybdefiltrering pumpes en partikelholdig blanding gennem en membran eller en anden grænseflade for at adskille snavs fra produktet i flydende suspension. Hulfiberfiltre bruges i kontinuerlige biobehandlingsoperationer til at fjerne det supernatant-udtrykte lægemiddelstof (DS), mens de midlertidigt fanger en del af biomassen i den hule fiber, før de skylles tilbage med modstrømsmedier. Akustisk felt-flow-adskillelse er en anden ny teknik, der i øjeblikket hovedsageligt findes i udviklingsmiljøer. Med forskellige drifts- og konfigurationsformer kan resultaterne:
  • Moduler ingen celle- eller partikeladskillelse (fig. 1-3a)
  • Vælg celle- eller partikeladskillelse fra fødestrømmene til en ny indfangningsstrøm med omledning eller adskillelse af en anden partikelpopulation (fig. 1-3b)
  • Flytning af et helt partikelsystem til en ny strøm og/eller omfordeling af væsker, eventuelt i recirkulation (Fig. 1-3c)
  • Interagere hydrodynamisk, hvor en moduleret blanding af både partikelselektion og væskeudveksling kan forekomme (fig. 1-3d)

Inline-partikelstørrelsesanalysatorer, såsom ParticleTrack™ med FBRM-teknologi®, måler partikelakkumulering og størrelsesfordeling af cellebouillonfoder, der går ind i eller undslipper filtre og kan give kapacitetskorrelation eller feedbackkontrol for at minimere procesafbrydelser. EasyViewer™ med Image2Chords™ udfører billedanalyse og udtrækker partikelakkumulering, størrelsesfordeling og morfologi fra tidsopløste inline-billeder af processen. Placeret over eller under filtre kan EasyViewer give kapacitetskorrelation eller feedbackkontrol, men er mest værdifuld, når den anvendes til årsagsanalyse, karakterisering og morfologi.

Metoden og strategien for indfangning ændrer sig lidt afhængigt af målmolekylets art. Antistoffer fanges af affinitetsharpikser såsom Protein A og Protein G samt nogle andre selektivt konstruerede metoder. Ikke-antistofproteiner og oligonukleotider fanges ofte ved ionbyttekromatografi (IEX). Produkter som polysaccharider og komplekse glykanstrukturer fanges ofte ved hydrofob interaktionskromatografi (HIC) eller omvendt fasekromatografi (RPC).

De vigtigste målemål under kromatografi omfatter maksimering af produktets bindingskapacitet til kolonnen, målt som massen af det produkt, der er lagt på kolonnen (kolonnebelastning), minus massen af det produkt, der slipper ud af søjleudløbet (kendt som "gennembrud"). UV er den mest almindelige metode til produktmåling, der bruges i vid udstrækning til protein- og DNA-måling. Alternative metoder til produkt- og ikke-produktmålinger er også mulige. Inline FTIR-spektroskopi kan bruges til kvantificering og diskrimination af komponenter såsom overfladeaktive stoffer, almindelige sukker- eller aminosyrebuffere, lipider, konjugerede produkter og endda produkter med variable konformationsstrukturer, såsom fragment-, monomer- eller aggregerede former af mAbs. FTIR bruges oftest ud over UV, når UV alene ikke er i stand til at måle vigtige ikke-protein/ikke-nukleinsyrekomponenter.

• Affinitetskromatografi (Protein A/G) er en førstegangskromatografisk metode (typisk kaldet Protein A eller ProA), der adskiller og koncentrerer produktet af interesse (typisk en mAb) fra andre opløselige materialer ved reversibelt at binde eller fastholde målproteinet til søjlen via specifikke bindingsinteraktioner (billede a), mens de andre komponenter "eluererer" gennem kolonnen (billede b). En selektiv eluering følger en række vasketrin og frigiver derefter målmolekylet (billede c). 
  
  

• Ionbyttekromatografi (IEX) adskiller og koncentrerer produktet af interesse (proteiner, oligonukleotider og andre) fra andre opløselige materialer ved reversibelt at binde eller fastholde målmolekylet til søjlen baseret på styrken af den elektrostatiske interaktion med fastfasematerialet (fig. 2d), mens de andre komponenter "eluererer" gennem søjlen. IEX bruges regelmæssigt som en ekstra eller alternativ oprensningsmetode og er derfor ikke begrænset til at fange applikationer.

Prøveudtagningshastigheden og detektionsgrænsen (LoD) med in-situ FTIR-spektrometre såsom ReactIR™ er fordelagtige til primær indfangningskromatografi, der registrerer flere målepunkter inden for hurtigt eluerende toppe eller fraktioner, mens der kvantitativt differentieres mellem flere komponenter. Inline FTIR-spektroskopi gør det muligt for brugere at overvåge variable feed-input samt harpikskvalitet og levetidsydelse, identificere og fingeraftrykseluere komponenter og eliminere forsinkelser i modtagelse af analytiske resultater for at træffe datadrevne beslutninger i realtid.

Ultrafiltrering (UF) bruges ofte i downstream-biobehandling til at koncentrere en fortyndet produktstrøm. Ultrafiltrering adskiller molekyler i en opløsning baseret på membranens porestørrelse eller molekylvægtsafskæring. Diafiltrering (DF) bruges oftest til at udskifte produktet til en ønsket buffer (f.eks. fra en elueringsbuffer til en endelig formuleringsbuffer).

Ultrafiltrering og diafiltrering (tilsammen kendt som bufferudveksling) bruger typisk Tangential Flow Filtration (TFF), hvor foder strømmer parallelt med membranoverfladen i stedet for vinkelret på overfladen (fig. 3). Bufferudveksling er fortsat en meget manuel operation, der sjældent optimeres. Produktkoncentrationen analyseres generelt ved en form for UV-spektroskopi, enten enkeltstående, som en detektor til HPLC eller som en variabel vejlængdemetode.

Der opstår flere udfordringer i processen med bufferudveksling:

• Nøjagtig sporing af udvekslingsvolumener
• Sikker procesforudsigelse fra ikke-repræsentative grabprøver
• Forsinkede eller flaskehalsede svartider for offlinemålinger
• Kumulativt produkttab ved ekstraktiv prøveudtagning
• Udbredelse af fejl i prøveforberedelse til offline UV- og HPLC-målinger

In-situ infrarød og Raman-spektroskopi gør det muligt at analysere flere komponenter samtidigt med større præcision og dynamisk rækkevidde og uden de forsinkelser, der er forbundet med offline-analyse. In-situ FTIR-spektroskopi med ReactIR kan give mange fordele under bufferudveksling:

• Kvantificer flere hjælpestoffer og lægemiddelstoffer (DS) arter samtidigt i realtid
• Kontrollér bufferforbruget
• Overvåg membraneffekter
• Brug direkte in-situ koncentration i stedet for diavolume-tilnærmelser
• Øg koncentrationsnøjagtigheden fra +/- 5 % til +/- 2 %
• Eliminer analytiske forsinkelser

Automatiserede reaktorer som EasyMax™ acceler procesudviklingen med op til 80 % gennem indsamling af eksperimentelle data, nøjagtig kontrol af alle kritiske procesparametre (CPP'er) og integration af biofysiske sensorer, herunder pH, ledningsevne, redox og opløst ilt (DO).

Der er flere metoder, der anvendes i rækkefølge, der bruges til at øge renheden af lægemiddelstoffet (DS). Begyndende med tidlige afklarings- og ekstraktionstrin, efterfulgt af en passende metode til indfangning og første bulkisolering, derefter efterfulgt af mellemliggende og derefter afsluttende oprensningsfaser, hvoraf sidstnævnte omfatter poleringskromatografi, nano/steril filtrering, krystallisation og viral clearance (fig. 4).

Ved at eliminere forsinkelser forbundet med offline-analyse forbedrer in-situ FTIR-målinger poleringskromatografitrin ved at give øjeblikkelig feedback for at kvantificere og specificere fraktionskomponenter, herunder buffere, lægemiddelstoffer og urenheder under mellemliggende rensningstrin. Dette resulterer i forbedrede fraktionsskæringer, aggregerede eller fragmentdiskriminationer og total koncentration i realtid.

For viral clearance er enhver virus, der er til stede i den samlede og halvoprensede terapeutiske suspension, bevidst beskadiget eller pludselig misdannet til en ikke-patogen form, normalt ved at ændre miljøet omkring virussen. Styring og forfining af disse kritiske procesparametre (CPP) muliggøres af automatiserede reaktorplatforme med integrerede biofysiske sensorer. Inline procesanalytisk teknologi (PAT) er nyttig til karakterisering af urenheder i senere stadier af rensningen, da koncentrationerne generelt er højere, og det er lettere at skelne produkter i en halvoprenset matrix. 

Biokonjugerede molekyler er designet til at have en øget effektivitet muliggjort af den kombinerede funktion af to eller flere forskellige terapeutiske typer molekyler. Biokonjugeret kemi kræver detaljeret proceskarakterisering og optimering. Konventionelle værktøjer som f.eks. mikrocentrifugerør, bægre, kogeplader, magnetiske rørestænger og overførselspipetter er ikke længere i stand til at opfylde reproducerbarhedskravene omkring pH, temperatur, dosering, blanding og andre parametre.

Biokonjugationskemi er afhængig af en række velkontrollerede trin i rækkefølge, som kan omfatte funktionel gruppereduktion, aktivering, API-linker-konjugation til det primære biologiske og et hvilket som helst antal vaske-, opløsningsmiddel- eller bufferudvekslingstrin hele vejen igennem (fig. 5). Biofarmaceutiske forskere anvender teknologi, der allerede anvendes i vid udstrækning i forskning og udvikling af små molekyler, såsom EasyMax automatiserede syntesereaktorer. EasyMax giver en sammenhængende arkitektur, så relevante procesparametre, herunder pH, ledningsevne, redox, temperatur, omrøring, dosering osv., kontrolleres præcist, og eksperimentelle data registreres nøjagtigt. Automatisering af biokonjugationskemi giver dataintegration, proceshændelseskorrelation, eksperimentel integritet og Design of Experiment (DoE) opskaleringsparametre. 

EasyMax muliggør hurtig vurdering og fin CPP-kontrol af DoE-rum, herunder blandingsforhold, temperaturkontrol, doseringsstrategier og hastigheder. Eliminer eksperimentel variabilitet forbundet med offline, manuelle metoder og dårlige kritiske procesparameterkontroller. In-situ FTIR og Raman-spektroskopi kan give detaljerede mekanistiske oplysninger i realtid, hvilket eliminerer offline forsinkelser og prøvetagningsunøjagtigheder.

Målet med formuleringen er at overføre produktmolekylet fra et miljø, opløsningsmiddel eller anden fysisk tilstand, der bruges til at syntetisere produktet, til en form, der er acceptabel til klinisk administration på mennesker (fig. 6). Produktmolekylet er formuleret efter, hvordan det endelige produkt skal bruges via inhalation, injektion eller oral dosering. Produktets og de tilhørende hjælpestoffers langsigtede stabilitet vurderes for at sikre, at den målte dosis og de kritiske kvalitetsegenskaber (CQA'er) er inden for specifikationerne efter forarbejdning, opbevaring og forsendelse. Ud over sterilitet er det vigtigt at sikre fjernelse af urenheder og endotoksiner og forhindre nedbrydning af lægemiddelprodukter (DP) for at opretholde sikkerhed og effektivitet under fremstilling og langtidsopbevaring af et proteinterapeutisk middel.

Formulerede lægemiddelprodukter omfatter proteiner (specifikt mAb), polysaccharider, nanopartikelsystemer, organiske stoffer, oligonukleotider, genterapier og mange typer vacciner. Visse vacciner vil blive formuleret med en adjuvans, typisk en aluminiumbaseret partikel eller en organisk emulsion.Især vaccineformulering og adjuversyntese er arbejdsgange, der er godt positioneret til at drage fordel af automatiserede parallelle reaktorarbejdsstationer, digitalisering af arbejdsgange og ortogonal procesanalytisk teknologi (PAT)  integration. Med realtids-PAT opnås langt mere viden om processen i stedet for kun at analysere start- og slutpunkterne.

Parallelle reaktorsystemer som EasyMax styrer alle kritiske procesparametre og integrerer inline PAT-værktøjer som ReactIR, ReactRaman™, ParticleTrack, EasyViewer og andre biofysiske sensorer. Disse teknologier bruges ofte i formulering til at karakterisere lægemiddelstof- og lægemiddelproduktstabilitet, slutkoncentration, adjuverende syntese, polymerisationer, indkapsling, adsorptioner og andre partikelhændelser.

Hvis du har spørgsmål eller brug for hjælp til din tekniske applikation, står vores team af tekniske applikationskonsulenter klar til at guide dig i den rigtige retning.