Oligonukleotid syntese

Oligonukleotider eller oligoer er korte enkelt- eller dobbeltstrengede segmenter af nukleinsyrer, der er bundet sammen for at danne enkeltkædede biologiske polymerer. De enkelte nukleotidbaser kan betragtes som ækvivalente med de monomerer, der udgør klassiske kemiske polymerer. Et nukleotid består af tre dele: en nitrogenholdig base, et sukkermolekyle med fem carbonatomer (disse to dele er nukleosiden) og en eller flere fosfatgrupper.  Almindelige eksempler omfatter LNA (låste nukleinsyrer), Morpholino, og strukturelt modificerede baser eller rygrad. 

Den komplekse binding af nukleotider danner de biologisk kritiske RNA- og DNA-biomolekyler. I tilfælde af RNA, som er en enkeltstrenget biopolymer, er sukkeret ribose. I DNA indeholder dobbeltstrengsmolekylet sukkeret deoxyribose. Det er de korte sekvenser af deoxyriobonucleinsyrer og ribonukleinsyrer, der er byggestenene i vigtige oligonukleotider. Specifikke bindinger af disse nukleotider skaber de målbiomolekyler, der bruges i biologiske, medicinske, retsmedicinske og kliniske applikationer. 

Oligonukleotider kan dannes enten enzymatisk gennem spaltning af større biomolekyler eller gennem målrettet kemisk syntese, og i sidstnævnte tilfælde er organonukleotidsyntese den kemiske proces, hvorved nukleosidphosphoramiditer – et vigtigt monomert element i oligonukleotider – syntetiseres. Nukleosidphosphoramider (også kendt som nukleosider eller amiditer) er i sig selv derivater af naturlige eller syntetiske nukleosider.

Nukleotider er derfor sammensatte molekyler, der består af et kovalent bundet nukleosid og en fosfatgruppe. Nukleotider er forbundet i en bestemt rækkefølge for at danne det ønskede produkt. Oligonukleotider består således af korte segmenter af nukleinsyrer, der er bundet sammen og danner enkeltkædede biologiske polymerer ("-mers"). Da de fleste oligonukleotider (oligoer) typisk består af op til 20 bundne nukleotider (selvom flere er mulige), kan de betragtes som små biofarmaceutiske molekyler. 

Ligesom andre farmaceutisk relevante små molekyler kræver oligonukleotidsyntese omhyggelig kontrol med hensyn til temperatur, pH, kvalitet af substrater osv. På grund af de typiske metoder, der anvendes til oligonukleotidsyntese, er det vanskeligere at opfylde udbytte-, renheds- og omkostningsmålene, jo længere og mere komplicerede nukleotidsekvensen er. Procesanalytiske teknologier (PAT'er) er nyttige til at nå disse mål.

Oligonukleotidprimere og -prober

Den mest almindelige anvendelse af syntetiske oligonukleotider er som relativt korte prober og primere (op til 30 mer) i en lang række applikationer. Dette involverer syntetisering af en nukleotidsekvens, der er parret eller 'omvendt-komplimenterende' til en større mål-DNA- eller RNA-streng (målsekvens). Som primere bruges oligoer typisk til at igangsætte enzymatiske reaktioner for f.eks. at skabe millioner til milliarder af kopier af en kort eller lang målsekvens. Velkendte eksempler er polymerasekædereaktionen (PCR) eller Sanger-sekventeringsmetoden. Anvendelser af oligoprimere omfatter DNA-sekventering, genekspression, kloning og molekylær diagnostik.

Som prober tjener oligoer til at identificere og binde til en specifik DNA- eller RNA-målsekvens for at bekræfte tilstedeværelsen af denne sekvens i et givet materiale. Anvendelser, der bruger oligoprober, omfatter blotting-procedurer såsom northern blotting (for RNA) eller southern blotting (for DNA), som fluorofor-konjugerede sekvenser i mikroarrays, der detekterer ændringer i genekspression eller bruges til screening for genetiske sygdomme eller til at identificere specifikke patogener (molekylær diagnostik).

Oligo Therapeutics/Genterapi

I terapeutiske applikationer udnytter antisense-oligonukleotider (ASO), generelt 20 til 30-mer-arter, naturlig biologi og letter genhæmning eller genhæmning (ødelæggelse) af uønskede eller overaktive RNA-sekvenser, hvilket igen blokerer ekspression af visse beskadigede eller overaktive proteiner, som kan forårsage eller lette sygdom. Forskningen i oligonukleotidbaserede terapier er intensiveret enormt, og flere lægemidler er blevet godkendt i de senere år.

Fremtidig brug af syntetiske nukleotider: Udforskning af DNA- og RNA-vaccinemodaliteter

Selvom det ikke er et oligonukleotid efter streng definition, repræsenterer DNA- eller RNA-baserede vaccineprodukter, såsom mRNA eller plasmid eller vektorbaserede nukleinsyrer, med mange hundrede eller tusinder af baser i længden, frontlinjen for udviklingen af syntetiske nukleotidteknologier.

I konceptet ville DNA- eller RNA-vacciner dispensere fra alle unødvendige eller skadelige dele af en patogen bakterie eller virus. I stedet ville en sådan nukleinsyrebaseret vaccine indeholde kode for blot nogle få dele af patogenets DNA eller RNA. Disse DNA- eller RNA-strenge instruerer patientens egen krop i at producere individuelle antigener eller fragmenter af patogenet og fremmer derefter et immunrespons på antigenet. Med moderne databehandling og in silico-modellering er disse oligonukleotidvaccinemodaliteter i stand til at blive skabt i løbet af få dage eller uger givet en passende målsekvens at designe imod. Som en platformsteknologi er nukleinsyrebaserede vacciner afhængige af standardsæt af byggesten eller råmaterialer, der muliggør utallige kombinationer næsten efter behag. Som sådan er de også relativt billige og nemme at producere sammenlignet med traditionelle vaccinemodaliteter. Dette er dog stadig et modent paradigme for den biofarmaceutiske industri, og nye udfordringer bliver konstant adresseret, nogle unikke for oligo- og lange nukleinsyreprodukter og nogle delt med andre bioterapeutiske modaliteter.

Oligonukleotidsyntese er den kemiske proces, hvorved nukleotider specifikt er bundet til at danne det ønskede sekventerede produkt. Kontinuerlig fastfasesyntese ved hjælp af en pakket søjle bruges almindeligvis til fremstilling af oligonukleotider. I nogle tilfælde anvendes en batch, gyllereaktion.

Processen med at producere måloligomersekvensen tager et antal cyklusser bestående af specifikke syntetiske trin. I det første trin fjernes en 4,4' dimethoxytrityl-beskyttende gruppe på det fastfaseunderstøttede nukleotid. Dernæst aktiveres en phosphoroamiditmonomer og kobles hurtigt gennem den frie hydroxylgruppe på det fastfasebundne nukleotid for at skabe et dinukleosid, der indeholder et phosphittriesterlink. I det tredje trin oxideres phospittriesteren. I det sidste trin (i den første cyklus) "afdækkes" eventuelle ureagerede understøttede nukleosider via acetylering for at forhindre, at der dannes uønskede biprodukter i den næste cyklus.

Længden af et oligonukleotid er defineret af antallet af nukleotider, der udgør sekvensen. Hvad angår nomenklaturen, er en sekvens, der er 20 nukleotider lang, defineret som en "20-mer". Oligolængden er afgørende for de forskellige applikationer. For eksempel bruges korte oligoer ofte i PCR, hvorimod meget lange sekvenser (200 baser eller mere) bruges i krævende applikationer såsom kloning eller CRISPR-redigering. Syntesen af specialiserede oligoer med lang mer-ekstrakt er udfordrende, og at levere en ren sekvens kræver både effektiv syntesekontrol og oprensningsmetoder. I gennemsnit er de fleste oligoer mindre end 60 meter lange. Da den måde, oligoer syntetiseres på, kræver gentagne reaktionscyklusser, der tilføjer yderligere nukleotider, jo længere den krævede sekvens er, jo større er sandsynligheden for at danne uønskede biprodukter - hvilket kan omfatte deletions- eller trunkeringssekvenser.

Forskellige rensningsmetoder anvendes afhængigt af kvalitet, kvantitet og omkostningsmål. For eksempel har saltfrie oligoer biprodukter fra den kemiske syntese fjernet, men der er stadig sekvensfejl. Disse afsaltede oligoer er nyttige ud fra et omkostnings- og effektivitetsperspektiv til mere rutinemæssige anvendelser, såsom PCR. Til mere krævende applikationer fjerner omvendt fasekromatografi uønskede sekvenser fra et produkt, men ikke så effektivt som gelelektroforese, som leverer et stærkt renset sekvensprodukt, men typisk i begrænsede mængder. Især for kliniske bekymringer er udbytteretention også et altid tilstedeværende problem gennem syntese og downstream-behandling.

Klassisk kemisk syntese i fast fase involverer typisk brugen af polymer eller specialiserede glasperler, der ikke påvirkes af reaktionsbetingelserne. Disse perler kan være indeholdt i kolonner, hvor reaktanter, reagenser og opløsningsmidler strømmer igennem. Formålet med perlerne er at fungere som en platform, hvorpå substratmolekyler er kovalent bundet og derefter påvirket af kemisk reaktion. Beskyttelse og afbeskyttelse af visse funktionelle grupper på substratmolekylet er nøglen til syntesen og til at sikre, at det ønskede produkt opnås. Synteseproduktet fjernes ved kemisk at bryde bindingen mellem det og den underliggende polymerperle.

Fastfasesyntese er effektiv til hurtigt at give renset produkt, da urenheder og ureagerede materialer vaskes væk i de forskellige trin i syntesen. Desuden er hele syntesen modtagelig for computerstyring og automatisering. Fastfasesyntese er den mest almindelige metode, der anvendes til produktion af brugerdefinerede peptider og oligonukleotider. I sidstnævnte tilfælde kræves der adskillige gentagne cyklusser for sekventielt at tilføje nukleotider for at danne målsekvensen.

Fastfaseoligonukleotidsyntese giver mange udfordringer, herunder faldet i udbyttet, når kædelængden øges. Sterisk hindring antages ofte som en mekanisme med dårligt udbytte, hvor en eller flere overfladefaste tråde kan forstyrre hver efterfølgende forlængelse af sin nabo.

For at løse disse og andre udfordringer er der forskellige metoder til væskefaseoligonukleotidsyntese.

Mange grundlæggende trin i væskefasesyntese er analoge med fastfasesyntese. Den væsentligste forskel er, at syntese sker i opløsning eller væskefase (dvs. IKKE fastgjort til nogen overflade). Da denne proces stadig forløber i cyklusser, er der flere ledsagende metoder til fjernelse af ureagerede reagenser, samtidig med at det aflange oligonukleotidprodukt bevares.

Teknikken til at bruge PCR til oligonukleotidsyntese blev etableret i 1985. I 1986 blev den første anvendelse af Taq-polymerase-enzymet   introduceret. Alligevel har industriel oligonukleotidsyntese kæmpet for at vedtage enzymatisk oligonukleotidsyntese af tre hovedårsager:

1. Enzymatisk syntese kræver en skabelon, som det sekvensforlængende DNA-polymeraseenzym kan fungere på. Som sådan kan de novo oligonukleotidsyntese af enzym ikke fungere uden en skabelon. 
   
2. Mange oligoprimere, prober eller ASO-mål, der kan bruges som skabelon, er i sig selv for korte til effektivt at prime og udløse polymerasesyntese.
   
3. Mange kunstige terapeutiske oligoer er kemisk modificeret for at lette forlænget halveringstid og forbedret funktionalitet i humoral cirkulation, modifikationer, der næsten eller helt forbyder deres interaktion med evolutionært afledte polymeraser (dette vedrører for det meste længere oligoarter såsom mRNA).

Forskning og udvikling fortsætter for en konstrueret polymerase , der er i stand til ASO-syntese ved hjælp af kemisk modificerede nukleotidlagre

Den komplekse karakter af oligonukleotidsyntese kunne drage fordel af en højere grad af procesobservation, forståelse af reaktionsmekanismer og afvigelser og handlingsrettede kontroller. Realtidsanalyser med PAT kan minimere eller eliminere behovet for tidskrævende eller langsomme offline-analyser.

• ReactIR og ReactRaman kan bruges til at følge kinetik af oligonukleotidsyntesereaktioner og sammenligninger mellem kørsler.
• Præcis temperatur-, omrørings- og doseringskontrol med EasyMax automatiserede kemiske syntesereaktorer sammen med integration af reaktionstendenser og mekanismer letter dataindsamling og nem styring via iC-software 

Realtidsovervågningsfunktionerne for in-situ FTIR og Raman-spektroskopi til kemi udført under strømningsforhold er veldokumenterede og er anvendelige i vigtige trin i oligonukleotidsyntese.

• Syntese af modificeret phosphoramidit og naturlige nukleotidmonomerer for at sikre struktur og renhed
• Reducer risici forårsaget af synthesizermekaniske problemer eller forkert opløsningstilførsel
• Sporkoblingsreaktion af phosphoroamiditmonomer til den frie hydroxylgruppe på det faste fasebundne nukleotid
• Spor denaturering og udglødning af komplementære oligonukleotider i dobbeltstrengssyntese.
• Bestem kemisk reaktionskinetik i udglødningsprocessen – identificer og spor mellemprodukter eller ukendte
• Korreler ændringer i spektre med nøglepunkter i processen
• Gælder for SPS, batch og konvergent peptidsyntese (SPS + opløsningsfase)

Et velkontrolleret syntesemiljø er afgørende for at sikre reaktionsresultat. Automatiserede reaktorplatforme giver tillid og konsistens på tværs af alle kritiske procesparametre samtidigt.

• Et reproducerbart miljø er grundlæggende for god videnskab
• Forstå virkningen af procesparametre på kritiske kvalitetsegenskaber ved at kombinere data fra sensorer og inline PAT
• Protokol og automatisering mindsker manuelle risici eller uoverensstemmelser
• Gør det lettere at søge og strukturere data
• Stol på årtiers citater og beviser for at skalere op
• Gælder for SPS, batch og konvergent peptidsyntese (SPS + opløsningsfase)