Krystalizace proteinů

Krystalizace proteinů je proces a metoda vytváření strukturovaných, uspořádaných mřížek pro složité makromolekuly. Proteiny jsou jako pevné látky obvykle amorfní a náchylné k denaturaci, zatímco proteiny existující v krystalických mřížkách odolávají denaturaci a jsou stabilnější. Proteiny mohou krystalizovat, pokud jsou umístěny ve vhodném, příznivém prostředí. Krystalizace proteinů je považována za umění i vědu kvůli vysoce složitým interakcím proměnných, které ovlivňují proces krystalizace proteinů.

Nejčastějším důvodem pro vytváření proteinových krystalů je podpora výzkumu strukturní biologie, obvykle pomocí rentgenové difrakční krystalografie. Výzkumníci mohou vizualizovat oblasti ve struktuře, které umožňují interakci s jinými molekulami, tím, že porozumí 3D strukturám proteinů (například aby lépe pochopili, jak enzymy, substráty a ligandy interagují). Dále je krystalizace účinným způsobem vytváření čistých proteinů, které neobsahují kontaminaci jinými proteiny ani cizí biologickou hmotou, což nabízí alternativní způsob čištění a separace k preparativní chromatografii. 

Krystalizace probíhá prostřednictvím série vzájemně závislých mechanismů, které jsou každý jedinečně ovlivněny volbou procesních parametrů: nukleace, růst, olejování, aglomerace, rozpad, osivo a přechod polymorfů.

Tyto mechanismy často probíhají současně, což činí efektivní návrh krystalizace výzvou. Při absenci mechanistického porozumění se vědci spoléhají na metodu pokus-omyl při úpravě procesních parametrů a optimalizaci výtěžku, čistoty a velikosti krystalů. Pochopením toho, které mechanismy probíhají během krystalizace, mohou vědci nasadit strategie k dosažení krystalického produktu s požadovanými vlastnostmi.

Proteiny jsou stále důležitější jako terapeutické léčivé přípravky. Výroba proteinů s potřebnou stabilitou však představuje klíčové výzvy, včetně variability produktu, ztráty struktury, která by snížila účinnost, a tvorby potenciálně nebezpečných vedlejších produktů. Krystalizace proteinů je metoda výroby čistých, stabilních pevných forem a řady injekčních a infuzních terapeutik, která jsou spojena s proteinovými krystaly. V minulosti byla krystalizace proteinů laboratorní činností podporující rentgenovou krystalografii, ale vzhledem k exponenciálnímu růstu proteinových terapeutik je škálování krystalizace proteinů na výrobní úrovně stále důležitější a představuje oblast intenzivního zaměření.

Škálování krystalizace proteinů je v zásadě analogické krystalizaci malých molekul, pokud jde o požadavky na optimalizaci kritických procesních parametrů (CPP) v laboratorním měřítku k dosažení kritických kvalitativních atributů (CQA) krystalizované léčivé látky v komerčním měřítku. Holistická platforma pro vývoj a škálování procesu krystalizace proteinů obvykle zahrnuje:

• In-situ charakterizaci částicového systému
• Spektroskopické monitorování a charakterizaci polymorfů
• Optimalizaci postupu a zpětnovazební kontrolní strategie prostřednictvím integrovaných modulů a senzorů

Existují hlavní farmaceutické aplikace spojené s krystalizací proteinů: lékařská chemie prostřednictvím strukturní biologie, vývoj proteinových léčiv, škálování, separace a čištění, formulace a dodávání léčiv.

• Lékařská chemie prostřednictvím strukturní biologie. Pokroky v technikách krystalizace proteinů a zlepšená rentgenová krystalografie vedly k určení desítek tisíc 3D struktur proteinů. Pochopení interakcí léků s receptory do velkých detailů je možné určením struktury těchto složitých makromolekul a vizualizací vazebných míst. Tyto informace umožňují hlubší molekulární porozumění proteinovým inhibitorům, alosterickým aktivátorům, kofaktorům a dokonce katalytickým místům enzymů nebo „aktivním místům“ – což vede k lepším léčivům s vyšší účinností. Klasickým příkladem významu pochopení struktury protein-inhibitor pomocí krystalografie jsou velké pokroky ve vývoji HIV proteáz.
• Vývoj, škálování, separace a čištění proteinových terapeutik. Kromě růstu jednotlivých proteinových krystalů pro rentgenovou krystalografii farmaceutický průmysl zvýšil úsilí ve vývoji proteinových krystalových terapeutik. Cílem těchto aplikací je vyvinout a škálovat na velké množství čistých, stabilních proteinových krystalů, které mají správnou velikost částic a dobře kontrolované rozložení velikosti částic. Ve srovnání s preparativní chromatografií má krystalizace proteinů potenciál být nákladově efektivní alternativou pro separaci a čištění makromolekul a izolaci chirálních molekul. Nástroje pro škálování krystalizace proteinů jsou analogické těm používaným pro škálování chemických reakcí s potřebou pochopení CPP a jejich vlivu na CQA.
• Formulace a dodávání léčiv. Proteinová terapeutika se podávají jako roztoky a mohou být aplikována injekčně nebo infuzí. Protože je potřeba dodat vysoké množství proteinů, jsou infuzní proteinové roztoky ředěny, aby se zabránilo problémům s viskozitou a agregací. To je méně pohodlné pro pacienta a nemocnici kvůli času potřebnému k infuzi celé léčby, ale může také přispět k fenoménu nižší compliance pacientů u jakékoli formy parenterální aplikace. Použití krystalické formy proteinů v suspenzi je velmi zajímavé, protože tyto formulace mají méně problémů s viskozitou a mohou být podávány ve vyšších koncentracích. Dalším klíčovým bodem je, že velikost proteinových krystalů musí být pečlivě kontrolována, aby suspenze mohla snadno projít injekční nebo infuzní jehlou. Rovněž je důležité, aby žádné zbytkové krystaly, které se nerozpustí během rekonstituce, nepřekročily kritické velikosti částic, které by mohly způsobit nežádoucí vedlejší účinky kvůli hromadění v kapilárách cévního systému, obecně minimalizujíc významné množství částic >15 µm. 

1. Vyberte vhodné rozpouštědlo. Mezi běžná kritéria patří, kolik látky lze rozpustit (rozpustnost), jak praktické je s rozpouštědlem pracovat (bezpečnost) a jak rozpouštědlo ovlivní stabilitu a stavy volné energie peptidu nebo proteinu.
2. Dosáhněte přesycení. Zahřejte rozpustnou peptidovou/proteinovou léčivou látku v rozpouštědle nebo pufru na maximální povolenou toleranci (obvykle omezenou denaturací). Roztok se stane přesyceným.
3. Krystalizujte produkt řízením CPP. Snižte rozpustnost ochlazením, přidáním anti-rozpouštědla, odpařováním nebo reakcí. Jakmile se rozpustnost sníží, dosáhne se bodu, kdy se začnou tvořit jádra krystalů a poté porostou. Měly by růst vysoce čisté krystaly produktu, i když motivy s vysokou volnou energií mohou tvořit alternativní nebo nekrystalické struktury; zabránit tomu vyžaduje pečlivou kontrolu CPP, pokud je to vůbec praktické.
4. Nechte systém dosáhnout rovnováhy. Toto se provádí za účelem maximalizace výtěžku pevného léčivého produktu.
5. Filtrovat a vysušit purifikovaný produkt.

Existuje několik metod používaných k růstu proteinových krystalů; mezi nejběžnější patří difúze par a mikrobatch. První metoda má dvě varianty, nazývané visící kapka a sedící kapka, a obě fungují zásadně stejným způsobem. V uzavřeném systému se kapka roztoku obsahující protein, pufr a precipitát vyrovnává s rezervoárem obsahujícím vyšší koncentrace rozpuštěných látek stejného roztoku, ale bez proteinu. Voda z kapky obsahující protein se odpařuje a je přitahována k roztoku s vyšší koncentrací v rezervoáru. Jak koncentrace rozpuštěných látek v kapce roste, protein začíná krystalizovat. V mikrobatch metodě jsou proteiny a další činidla zavedeny a udržovány pod tenkou vrstvou minerálního oleje, která eliminuje difúzi vody. Mikrobatch je v podstatě malý reaktor obsahující všechny potřebné složky ve správných, stabilních koncentracích pro umožnění krystalizace.

Protože nalezení správné sady činidel, parametrů a podmínek potřebných k krystalizaci proteinu je často empirické, nejpraktičtějším způsobem úspěšné krystalizace proteinů je použití různých experimentálních podmínek založených na předchozích zkušenostech. Nejjednodušší způsob je použití komerčně dostupných sad pro screening proteinových krystalů, které obsahují předpřipravené roztoky s pufry, precipitáty atd. obsažené v multi-jamkových deskách. Metoda visící kapky s difúzí par se používá k růstu krystalů s těmito sadami. Když je potřeba rozsáhlý screening, jsou k dispozici systémy s vysokou propustností, které automatizují mikrobatch metodu, čímž šetří čas a úsilí a zároveň minimalizují množství potřebného purifikovaného proteinu. Pro rozsáhlé krystalizace proteinů potřebné pro farmaceutické nebo průmyslové aplikace tvoří informace získané ve screeningových experimentech základ pro aplikaci ve větších automatizovaných reaktorových systémech charakterizovaných in-situ, real-time PAT. 

Na podporu vývoje procesů a výroby je jedním z nejdůležitějších počátečních kroků pro úspěšnou krystalizaci proteinů zajistit dostatečnou zásobu vysoce purifikovaného a dobře charakterizovaného proteinu. Kromě toho, že protein je čistý (tj. bez kontaminantů, jako jsou nečistoty z fermentačních matric), by měl být protein homogenní a stabilní (nebo stabilizovaný) v roztoku s:

• Minimální agregací (Obrázek A)
• Správnou sekundární, terciární a kvartérní strukturou (Obrázek B)
• Jakýmikoli konjugovanými nebo rekombinantními modifikacemi (Obrázek C)

Kromě toho musí být všechna činidla a rozpouštědla používaná v procesu krystalizace proteinů bez kontaminantů, protože ty mohou mít významný vliv na nukleaci.

Podobně jako u krystalizace malých molekul, proteiny krystalizují z přesycených roztoků. U malých molekul, které tvoří robustní krystalové mřížky, je manipulace s teplotou hlavním způsobem dosažení přesycení; toto je také užitečné pro proteiny. Nicméně je povolen omezený teplotní rozsah, protože proteinové krystaly obvykle obsahují rozpouštědlo jako součást krystalové struktury, jsou často citlivé na teplotu a náchylné k denaturaci a agregaci.

Malé molekuly mají výrazně méně stupňů stereoskopické volnosti a proto krystalizují mnohem snadněji. Velké molekulární peptidy mají mnohem více vnitřních kyselých, zásaditých, polárních, nepolárních interakcí a odpudivých sil, které brání uspořádané krystalizaci, což je jev zesílený u ještě větších proteinů. Většina peptidů kompatibilních s krystalizací také obsahuje významný počet disulfidových vazeb, které jsou klíčové pro zafixování strukturálních motivů. Míra intramolekulární neuspořádanosti nebo možné variace ve struktuře je důležitým atributem určujícím, zda se peptid nebo protein vůbec může krystalizovat místo precipitace. I když má molekula předpoklady příznivé pro krystalizaci, existuje řada ovlivňujících parametrů procesu, které ovlivňují komerční životaschopnost procesu a je třeba je charakterizovat.

Kromě teploty existuje řada dalších faktorů, které ovlivňují/pomáhají krystalizaci proteinů přesycením, včetně úpravy pH a iontové síly roztoku, přidávání solí a precipitátů, jako je PEG, k pomoci snížit rozpustnost proteinů, typu přítomného ligandu atd. Klíčem je přesycení roztoku v prostředí, které nenarušuje normální charakter proteinu. To zdůrazňuje důležitost nalezení sady proměnných a podmínek, které vedou ke krystalům se správnou morfologií, čistotou a přijatelnými rychlostmi růstu.

Krystalizace proteinů probíhá prostřednictvím řady vzájemně závislých mechanismů:

1. Nukleace
2. Růst
3. Oddělení oleje při krystalizaci
4. Aglomerace
5. Rozpad
6. Očkování
7. Chemie polymorfismu

Tyto mechanismy, které jsou často skryté před vědci, hrají dominantní roli při definování výsledku krystalizačního procesu.

Vývoj a škálování krystalizací pro proteinové terapeutika vyžaduje hluboké pochopení proměnných a podmínek, které ovlivňují krystalizační proces. Stejně jako u jiných krystalizací, dosažení požadované krystalové formy, tvaru, velikosti částic a distribuce velikosti vyžaduje pečlivou kontrolu pro zajištění konzistentní kvality produktu. Jakákoli variace v kritických kvalitativních a výkonnostních parametrech (CQA) suspenzí proteinových krystalů přímo ovlivní terapeutickou účinnost. Protože proteinové krystaly jsou velmi citlivé na své růstové prostředí a mohou být snadno poškozeny nadměrnou teplotou, ztrátou rozpouštědla a dalšími vnějšími stresy nebo dokonce procesem odběru vzorků, je žádoucí měřit kritické parametry procesu (CPP) a kvalitu produktu in situ, tj. bez vyjmutí krystalů z jejich roztokového prostředí.

• Automatizované chemické reaktory EasyMax a OptiMax umožňují přesnou kontrolu, nastavení a zaznamenávání parametrů, včetně teploty, pH, vodivosti, rychlosti míchání a dávkování pufrů a excipientů, které jsou kriticky důležité pro úspěšný vývoj a škálování proteinových krystalizací
• In-situ analytické nástroje, které pomáhají při monitorování, řešení problémů a korekci odchylek procesu, jsou také užitečné
  • In-situ Ramanova spektroskopie a FTIR spektroskopie sledují koncentrace reaktantů, monitorují růst krystalové struktury a také měří koncentraci přesycených roztoků
  • Technologie ParticleTrack (s FBRM) monitoruje v reálném čase měnící se velikost krystalů a distribuci velikosti jako klíčové segmenty probíhajícího krystalizačního procesu
  • EasyViewer umožňuje vizualizaci a analýzu obrazu krystalizačního procesu během jeho průběhu

Když jsou automatizované laboratorní reaktory používány v kombinaci s analyzátory in situ v reálném čase, lze identifikovat vliv parametrů procesu na krystalizační mechanismy, jako je agregace, růst, aglomerace, rozpad a změna tvaru. Přesná kontrola krystalizačního procesu v kombinaci s kontinuálním monitorováním tvorby krystalů in situ umožňuje optimalizaci a škálování založené na faktech a datech.

Automatizovaný laboratorní reaktor EasyMax je kompletní pracovní stanice pro optimalizaci parametrů při krystalizaci proteinů, která podporuje vývoj a návrh škálování a jeho provedení. Tento plně automatizovaný systém umožňuje přesnou kontrolu parametrů procesu.

• Řízení CPP včetně rychlosti dávkování, teploty, míchání, pH a vodivosti
• Snadná integrace s analytikou in situ pro krystalizaci včetně ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) a EasyViewer (analýza obrazu in situ)
• Software iC umožňuje automatizované provádění a řízení všech experimentů a periferních zařízení, stejně jako plné zachycení dat a vedení záznamů

ReactIR využívá střední infračervenou spektroskopii k měření fáze roztoku ve studiích krystalizace. Měření ReactIR nejsou ovlivněna suspendovanými pevnými látkami, bublinami ani jinou částicovou hmotou.

• Sledujte jednotlivé krystalizační soluty in situ a v reálném čase.
• Měřte koncentrace roztoků na podporu studie přesycení
• Poskytujte akční datovou analytiku pro rozhodování a řízení v reálném čase

ReactRaman využívá Ramanovu spektroskopii k molekulární analýze částic v roztoku

• Sledujte růst krystalů, strukturu a morfologii nedestruktivně, in situ a v reálném čase
• Určete vliv parametrů a optimalizujte podmínky a proměnné krystalizace k dosažení kvalitativních cílů

ParticleTrack využívá technologii Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) a je optický přístroj založený na sondě, který se vkládá přímo do nádoby pro sledování změn velikosti a počtu částic v reálném čase. ParticleTrack používá měření rozdělení délek chord k získání rozdělení velikosti krystalů (CSD).

• Proteinové krystaly jsou kontinuálně monitorovány při změně experimentálních podmínek
• Sledujte růst v dávkách nebo kontinuální růst během krystalizace v reálném čase bez nutnosti odebírání vzorků
• Charakterizujte podmínky ovlivňující nukleaci, agregaci, polymorfismus a další atributy systému

EasyViewer je přístroj založený na sondě, který se vkládá přímo do nádoby a zachycuje snímky částicových systémů. EasyViewer provádí analýzu obrazu a měří počet částic, rozdělení velikosti a morfologii z časově rozlišených inline snímků procesu, což umožňuje sledování populací v čase.

• Proteinové krystaly jsou kontinuálně monitorovány při změně experimentálních podmínek
• Sledujte růst v dávkách nebo kontinuální růst během krystalizace v reálném čase bez nutnosti odebírání vzorků
• Vizualizujte parametry krystalizace, které ovlivňují nukleaci, agregaci, polymorfismus a další atributy systému v reálném čase

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Autoři hlásili úspěch při vývoji efektivního přístupu k monitorování krystalizace biofarmaceutik v reálném čase. Tento postup využívá ParticleTrack k měření CLD pro řadu biofarmaceutických molekul za statických i dynamických podmínek a poté aplikuje matematické modelování pro převod CLD na CSD. Zkoumané biomolekuly mají různé krystalové formy, které závisí na experimentálních podmínkách krystalizace. Lysozym může vytvářet tetragonální a jehlicovité krystaly, rHu inzulin tvoří rhombohedrální krystaly a B12 tvoří polyhedrální krystaly.

Autoři vyvinuli modely pro určení CSD pro krystaly s nízkým poměrem stran tetragonální, rhombohedrální, polyhedrální a krystaly s vysokým poměrem stran jehlicovitého tvaru. Autoři použili tři různé modely pro určení rozdělení velikosti krystalů:

• Model vyvinutý jinou výzkumnou skupinou, který předpokládal, že krystaly lze reprezentovat jako koule (ekvivalentní průměr koule, SED), byl účinný pro krystaly s nízkým poměrem stran
• Pro krystaly s vysokým poměrem stran autoři této studie vyvinuli model založený na šířce
• Nakonec vyvinuli model založený na délce, který vyžadoval specifikaci poměru stran

Výsledky modelů vyvinutých pro výpočet CSD z měření FBRM byly následně porovnány s měřeními CSD získanými analýzou obrazu.

Sledování neprůhledné suspenze krystalů představuje výzvy, zejména když výrobní specifikace vyžadují úzké rozdělení velikosti částic (PSD). U injektabilních formulací proteinových krystalů může PSD výrazně ovlivnit viskozitu a zároveň sloužit jako včasné varování před agregací nebo jinými degradačními událostmi, které mohou potenciálně ohrozit formulaci. In-situ monitorování bylo použito ve studii krystalizace v dávkách při škálování k charakterizaci tvorby a růstu krystalů lidského růstového hormonu (hGH). Analýza v reálném čase odhalila odchylku od obvyklého profilu PSD způsobenou rozdíly v míchání mezi nádobami. Toto bylo potvrzeno následnou offline analýzou obrazu (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Kontinuální krystalizační procesy ve farmaceutické výrobě: přehled. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Odhad parametrů stochastické primární nukleační kinetiky pomocí stochastických integrálů využívajících měření odrazem zaostřeného paprsku. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitorování krystalizace biofarmaceutik v reálném čase: distribuce chordové délky k distribuci velikosti krystalů lyzozymu, rHu inzulinu a vitamínu B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulace krystalizace lyzozymu a supramolekulární samoorganizace v roztoku pomocí iontových kapalin. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modelování a řízení tvaru krystalů v kontinuální krystalizaci bílkovin. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Zvýšení rychlosti produkce krystalů a snížení polydisperzity v kontinuální krystalizaci bílkovin. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Proteinové krystaly pro dodávání biofarmaceutik. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301