Sintesi di oligonucleotidi

Gli oligonucleotidi possono essere creati mediante un processo enzimatico di clivaggio di biomolecole di dimensioni maggiori oppure tramite sintesi chimica mirata. Nel secondo caso, la sintesi di organonucleotidi è la reazione chimica mediante la quale si sintetizzano fosforoammiditi nucelosidiche (monomeri fondamentali degli oligonucleotidi). Le fosforoammiditi nucleosidiche, note anche in breve come nucleosidi o ammiditi, sono a loro volta prodotti derivati di nucleosidi naturali o di sintesi.

I nucleotidi sono pertanto molecole composte, costituite da un gruppo fosfato e un nucleoside uniti da un legame covalente. I nucleotidi vengono legati in una specifica sequenza per formare il prodotto desiderato. Gli oligonucleotidi sono quindi composti da corti segmenti di acidi nucleici legati tra loro a formare polimeri biologici a catena singola (per questo la lunghezza si misura in "mer"). Poiché la maggior parte degli oligonucleotidi è generalmente formata da un massimo di 20 nucleotidi legati tra loro (anche se è possibile che ve ne siano di più), possiamo immaginarli come molecole biofarmaceutiche di dimensioni ridotte. 

In modo molto simile a quanto accade per la produzione di altre piccole molecole rilevanti dal punto di vista farmaceutico, la sintesi di oligonucleotidi richiede un attento controllo di temperatura, pH, qualità dei substrati e così via. Per via dei metodi tipicamente utilizzati per la sintesi degli oligonucleotidi, più lunga e complicata è la sequenza di nucleotidi, più è difficile raggiungere gli obiettivi previsti in termini di rendimento, purezza e costi. Le tecnologie analitiche di processo (PAT) sono utili per soddisfare questi requisiti.

Gli oligonucleotidi sono brevi segmenti di acidi nucleici a filamento singolo o doppio legati tra loro a formare polimeri biologici a catena singola. Le singole coppie di basi dei nucleotidi sono l'equivalente dei monomeri che costituiscono i polimeri chimici più tipici. Un nucleotide è formato da tre componenti: una base azotata, una molecola di zucchero con 5 atomi di carbonio (questi due elementi costituiscono il nucleoside) e uno o più gruppi fosfato. In alternativa, i nucleotidi possono essere formati da basi non naturali o non canoniche. Alcuni esempi comuni sono LNA (acido nucleico "bloccato"), morfolino e basi o catene principali con struttura modificata. 

Le catene complesse di nucleotidi formano le biomolecole fondamentali per i processi biologici note coi nomi di RNA e DNA. Nel caso dell'RNA, un biopolimero a filamento singolo, lo zucchero presente è il ribosio. Il DNA, molecola a doppio filamento, contiene invece lo zucchero noto come desossiribosio. Sono le brevi sequenze degli acidi desossiribonucleico e ribonucleico che costituiscono i mattoni di base di importanti oligonucleotidi. Specifiche sequenze di questi nucleotidi costituiscono le biomolecole finali che trovano applicazione nei settori clinico, legale, medico e biologico. 

Primer e sonde oligonucleotidici

Gli oligonucleotidi di sintesi vengono comunemente utilizzati soprattutto come sonde e primer relativamente corti (fino a 30 mer) in un ampio ventaglio di applicazioni. Per questo utilizzo occorre sintetizzare una sequenza di nucleotidi associata a un filamento bersaglio di DNA o RNA di dimensioni maggiori (sequenza target), del quale rappresenta il "complementare inverso". Gli oligonucleotidi vengono utilizzati tipicamente come primer per dare inizio a reazioni enzimatiche, per esempio per creare milioni o miliardi di copie di una sequenza target breve o lunga. Alcuni esempi molto noti sono rappresentati dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) o dal metodo di sequenziamento Sanger. I campi di applicazione dei primer di oligonucleotidi comprendono il sequenziamento del DNA, l'espressione genica, la clonazione e la diagnostica molecolare.

Se utilizzati come sonde, gli oligonucleotidi servono a identificare e legare una specifica sequenza target di DNA o RNA per poterne confermare la presenza in un dato materiale. I campi di applicazione delle sonde di oligonucleotidi comprendono le procedure di identificazione/visualizzazione come il Northern blot (per l'RNA) e il Southern blot (per il DNA), l'uso come sequenze marcate con fluorofori in microarray per la rilevazione di modifiche dell'espressione genica o procedure di screening per l'identificazione di malattie genetiche o specifici patogeni (diagnostica molecolare).

Oligonucleotidi terapeutici/terapia genica

Nelle applicazioni terapeutiche, gli oligonucleotidi antisenso (ASO), generalmente da 20-30 mer, sfruttano i naturali meccanismi biologici e agevolano l'inibizione o il silenziamento (distruzione) genici di sequenze di RNA indesiderate o eccessivamente attive, che a loro volta reprimono l'espressione di determinate proteine danneggiate o eccessivamente attive che rischiano di causare una malattia o predisporre a essa. L'attività di ricerca legata alle terapie basate su oligonucleotidi si è notevolmente intensificata e, negli ultimi anni, sono stati approvati diversi farmaci.

Futuri utilizzi dei nucleotidi di sintesi: l'esplorazione dei vaccini basati su DNA e RNA

Nonostante non si tratti di oligonucleotidi in senso stretto, i vaccini basati su DNA o RNA, come quelli con acidi nucleici su vettori, plasmidi o mRNA, le cui sequenze sono lunghe centinaia o migliaia di basi, rappresentano i campi più cruciali che richiedono lo sviluppo di tecnologie per la sintesi di nucleotidi.

A livello teorico, i vaccini basati su DNA o RNA consentono di fare a meno dei tratti dannosi o superflui di agenti patogeni quali batteri e virus. Questi tipi di vaccini basati sugli acidi nucleici conterrebbero infatti il codice relativo a solo alcuni tratti del DNA o dell'RNA del patogeno. Questi filamenti di DNA o RNA insegnano al sistema immunitario del paziente a produrre singoli antigeni o frammenti dell'agente patogeno. Grazie alle moderne tecniche di elaborazione e modellazione in silico, gli elementi utilizzati dai vaccini basati su oligonucleotidi possono essere creati nel giro di pochi giorni o poche settimane avendo a disposizione una sequenza target adeguata su cui basarsi. I vaccini basati sugli acidi nucleici, come tecnologia di base si appoggiano ad alcune serie standard di elementi costitutivi o di materie prime che consentono di effettuare miriadi di combinazioni quasi a proprio piacimento. Per questa ragione sono relativamente convenienti e facili da produrre rispetto ai vaccini basati sui meccanismi tradizionali. Tuttavia, si tratta di un paradigma ancora in via di sviluppo nel settore farmaceutico e i nuovi problemi da affrontare sono all'ordine del giorno. Alcuni di questi riguardano solo i prodotti basati su acidi nucleici lunghi e oligonucleotidi. mentre altri rappresentano difficoltà comuni anche ad altri meccanismi bioterapeutici.

La sintesi di oligonucleotidi è la reazione chimica mediante la quale i nucleotidi si legano in modo specifico per formare un prodotto con la sequenza desiderata. Per produrre gli oligonucleotidi, si utilizza comunemente la sintesi continua in fase solida con una colonna con sfere impaccate. In alcuni casi, si utilizza una reazione slurry in batch.

Il processo di produzione della sequenza oligomerica target richiede un certo numero di cicli composti da specifiche fasi di sintesi. Nella prima fase, si rimuove dal nucleotide fissato al supporto in fase solida un gruppo di protezione 4,4'-dimetossitritile. Viene quindi attivato un monomero fosforoammidite che si accoppia rapidamente al gruppo idrossile libero, presente sul nucleotide fissato al supporto in fase solida, per creare un dinucleoside con un legame fosfito triestere. Nella terza fase, il fosfito triestere viene ossidato. Nella fase finale (del primo ciclo), gli eventuali nucleosidi sul supporto che non hanno reagito vengono "bloccati" (capping) tramite acetilazione per impedire che durante il ciclo successivo si formino sottoprodotti indesiderati.

La lunghezza di un oligonucleotide è definita dal numero di nucleotidi che costituiscono la sequenza. Una sequenza lunga, per esempio, 20 nucleotidi viene definita una "venti mer". La lunghezza degli oligonucleotidi è un parametro di importanza critica per le diverse applicazioni. Per esempio, gli oligonucleotidi lunghi pochi mer vengono comunemente utilizzati per la PCR, mentre le sequenze molto lunghe (200 o più basi) vengono utilizzate in applicazioni più impegnative come la clonazione o l'editing CRISPR. La sintesi di oligonucleotidi specializzati lunghi molti mer è un'operazione difficile e per ottenere una sequenza pura occorrono un controllo della sintesi e metodi di purificazione efficaci. Generalmente, la maggior parte degli oligonucleotidi ha lunghezza inferiore a 60 mer. Poiché la tecnica di sintesi degli oligonucleotidi richiede cicli di reazione ripetuti per aggiungere ulteriori nucleotidi, più lunga è la sequenza da produrre, maggiore è la probabilità che si formino sottoprodotti indesiderati, che possono comprendere sequenze con delezioni o troncamenti.

A seconda degli obiettivi in termini di qualità, quantità e costi, si utilizzano metodi di purificazione diversi. Ad esempio, nel caso degli oligonucleotidi desalinizzati. si rimuovono i sottoprodotti della sintesi chimica, ma gli eventuali errori nella sequenza restano. Grazie al buon rapporto tra costo ed efficacia, gli oligonucleotidi desalinizzati sono utili per moltissime applicazioni di routine, come la PCR.  Per le applicazioni più impegnative, si utilizza la cromatografia a fase inversa per rimuovere da un prodotto le eventuali sequenze indesiderate. Questa tecnica è tuttavia meno efficace dell'elettroforesi su gel, che garantisce un prodotto con un grado di purezza elevato ma tipicamente in quantità limitate. Soprattutto nell'ambito clinico, mantenere un determinato rendimento è un problema sempre rilevante, sia per quanto riguarda la sintesi, sia per le fasi successive della lavorazione.

La normale sintesi chimica in fase solida richiede in genere l'utilizzo di speciali sfere in vetro o polimeriche che non vengono modificate dalle condizioni di reazione. Queste sfere possono essere raccolte all'interno di colonne che vengono attraversate dal flusso di reattanti, reagenti e solventi. Lo scopo di queste sfere è di fare da supporto: le molecole di substrato si legano a esse mediante legami covalenti e vengono quindi modificate dalla reazione chimica. La protezione e la deprotezione di determinati gruppi funzionali presenti sulla molecola di substrato sono fondamentali per effettuare la sintesi e per garantire che il prodotto ottenuto sia quello desiderato. Il prodotto di sintesi viene rimosso rompendo con un'azione chimica il legame che lo fissa alla sfera polimerica sottostante. 

La sintesi in fase solida è efficace per produrre rapidamente un prodotto purificato, poiché le eventuali impurità e il materiale che non ha reagito vengono lavati via durante le diverse fasi della sintesi. Inoltre, l'intera procedura di sintesi si presta a essere controllata mediante computer e automatizzata.  La sintesi in fase solida è il metodo più comunemente utilizzato per produrre oligonucleotidi e peptidi personalizzati. Nel caso degli oligonucleotidi, occorrono diversi cicli ripetuti per aggiungere progressivamente i nucleotidi e formare la sequenza target. 

La sintesi di oligonucleotidi in fase solida presenta numerose difficoltà, tra cui la riduzione del rendimento all'aumentare della lunghezza della catena. Spesso si ipotizza che l'ingombro sterico determini il basso rendimento, mentre la presenza di uno o più filamenti fissati alla superficie può interferire con ciascuno dei progressivi allungamenti del suo vicino. 

Per risolvere questi e altri problemi, esistono diversi metodi di sintesi degli oligonucleotidi in fase liquida. 

Molti dei passaggi basilari della sintesi in fase liquida sono analoghi a quelli della sintesi in fase solida. La differenza principale è che la sintesi avviene in soluzione, ovvero in fase liquida (cioè il materiale NON è fissato a una superficie). Poiché anche questa procedura è costituita da una serie di cicli, esistono alcuni metodi associati per rimuovere i reagenti non coinvolti dalla reazione preservano l'oligonucleotide allungato appena prodotto.

La tecnica della PCR per la sintesi di oligonucleotidi era già affermata nel 1985. Nel 1986, è stato utilizzato per la prima volta l'enzima denominato Taq polimerasi. L'adozione in ambito industriale della tecnica della sintesi enzimatica di oligonucleotidi si è tuttavia rivelata difficoltosa per tre motivi fondamentali:

1. La sintesi enzimatica richiede l'uso di un modello su cui l'enzima DNA polimerasi che allunga la sequenza possa operare. Non è quindi possibile utilizzare l'enzima per effettuare una sintesi di oligonucleotidi ex novo senza un modello. 
   
2. Molti target di primer, sonde o ASO a base di oligonucelotidi che si potrebbero utilizzare come modello sono però troppo corti per avviare e innescare la sintesi da parte della polimerasi.
   
3. Molti oligonucleotidi terapeutici di sintesi vengono modificati chimicamente per facilitare l'estensione dell'emivita e il miglioramento della funzionalità nella circolazione umorale. Tali modifiche impediscono però in modo completo o quasi l'interazione degli oligonucleotidi con le polimerasi derivate dal processo evolutivo;  questo riguarda soprattutto gli oligonucleotidi più lunghi, come l'mRNA.

Le attività di ricerca e sviluppo proseguono con l'obiettivo di creare una polimerasi bioingegnerizzata, in grado di sintetizzare ASO utilizzando soluzioni stock di nucleotidi modificati chimicamente.

La natura complessa della sintesi di oligonucleotidi può trarre profitto da una più accurata osservazione dei processi, dalla comprensione dei meccanismi di reazione e delle eventuali deviazioni, nonché da sistemi di controllo che consentano di intervenire. L'analisi in tempo reale mediante PAT può ridurre al minimo o eliminare l'esigenza di lunghe o lente analisi offline.

• ReactIR e ReactRaman possono essere utilizzati per monitorare la cinetica delle reazioni di sintesi degli oligonucleotidi e per effettuare confronti tra una corsa e l'altra.
• Il controllo accurato di temperatura, agitazione e dosaggio grazie ai reattori di sintesi chimica EasyMax, con l'integrazione di meccanismi e trend della reazione, consente di acquisire dati e di gestire tutto più facilmente tramite il software iC.

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy, and Qunying Dai, "Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides", Organic Process Research and Development (2015), 19, 203-214.

Gli autori sottolineano che, nonostante i protocolli per la sintesi di oligonucleotidi in fase solida siano ben affermati, la chimica necessaria è comunque impegnativa e costosa. I principali rischi individuati per questa tecnica di produzione sono:

• Il collegamento di una soluzione chimica errata a una porta di ingresso dedicata del sintetizzatore
• L'errata preparazione di una soluzione sotto il profilo quantitativo
• Eventuali errori derivanti da fonti meccaniche o altre fonti di natura sconosciuta legate al sintetizzatore

La mancata identificazione di uno di questi rischi o il mancato intervento in presenza di essi rischia di compromettere completamente il processo. Per questo motivo, è stato analizzato l'uso del monitoraggio spettroscopico in tempo reale combinato con la modellazione discriminata, quantitativa e con controllo statistico multivariato dei processi basata sui dati raccolti nel medio infrarosso. È stato riscontrato che ReactIR consente la verifica e il controllo in tempo reale del processo di sintesi e permette di migliorare la sintesi automatica di oligonucleotidi. In particolare, è stato osservato che la sensibilità, la profondità di informazione, l'ampio contesto di applicazione e l'accessibilità di questo approccio sul piano empirico consentono di adottarlo immediatamente per risolvere una vasta gamma di difficoltà fondamentali legate a questi composti, tra cui il problema della verifica in linea della sequenza e della purezza.

Le applicazioni di monitoraggio in tempo reale della spettroscopia Raman e FTIR in situ per le reazioni chimiche effettuate in condizioni di flusso continuo sono ormai comprovate e possono essere utilizzate nelle fasi fondamentali della sintesi di oligonucleotidi.

• Sintesi di nucleotidi monomerici per garantire purezza e struttura corrette
• Mitigazione dei rischi legati a problemi meccanici del sintetizzatore o all'utilizzo di soluzioni non preparate correttamente
• Monitoraggio della reazione di accoppiamento tra monomero fosforoammidite e gruppo idrossile libero presente sul nucleotide fissato al supporto in fase solida
• Monitoraggio delle fasi di denaturazione e annealing (appaiamento) degli oligonucleotidi complementari nelle procedure di sintesi a doppio filamento
• Determinazione della cinetica della reazione chimica nel processo di annealing, identificazione e monitoraggio di intermedi o composti non noti
• Analisi della correlazione tra variazioni negli spettri e momenti fondamentali del processo
• Applicabile a sintesi di peptidi in batch, in fase solida (SPS) e in fase convergente (SPS + in soluzione)

Un ambiente di sintesi ben controllato è essenziale per essere certi del risultato della reazione. Le piattaforme con reattori automatici garantiscono simultaneamente l'accuratezza e la coerenza di tutti i parametri critici di processo.

• Un buon risultato scientifico grazie a condizioni ambientali riproducibili
• Comprensione dell'impatto che i parametri di processo hanno sui parametri di qualità essenziali grazie alla combinazione tra i dati dei sensori e PAT in linea
• Mitigazione dei rischi o delle incoerenze dovute a interventi manuali grazie al protocollo e all'automazione
• Dati più cercabili e strutturati
• Una base costituita da decenni di pubblicazioni e prove scientifiche per lo scale-up
• Applicabile a sintesi di peptidi in batch, in fase solida (SPS) e in fase convergente (SPS + in soluzione)