Oligonukleotid syntese

Oligonukleotider, eller oligoer, er korte enkelt- eller dobbelttrådede segmenter av nukleinsyrer som er koblet sammen for å danne enkjedede biologiske polymerer. De enkelte nukleotidbasene kan betraktes som ekvivalente med monomerene som utgjør klassiske kjemiske polymerer. Et nukleotid består av tre deler: en nitrogenholdig base, et sukkermolekyl med fem karbonatomer (disse to delene er nukleosiden), og en eller flere fosfatgrupper. Alternativt kan nukleotider bestå av ikke-naturlige eller ikke-kanoniske baser. Vanlige eksempler inkluderer LNA (låste nukleinsyrer), morfoline og strukturelt modifiserte baser eller ryggrad. 

Den komplekse koblingen av nukleotider danner de biologisk kritiske RNA- og DNA-biomolekylene. Når det gjelder RNA, som er en enstrenget biopolymer, er sukkeret ribose. I DNA inneholder det dobbeltstrengede molekylet sukkeret deoksyribose. Det er de korte sekvensene av deoksyrionukleinsyrer og ribonukleinsyrer som er byggesteinene til viktige oligonukleotider. Spesifikke koblinger av disse nukleotidene skaper målbiomolekylene som brukes i biologiske, medisinske, rettsmedisinske og kliniske applikasjoner. 

Oligonukleotider kan dannes enten enzymatisk gjennom spaltning av større biomolekyler eller gjennom målrettet kjemisk syntese. I sistnevnte tilfelle er organonukleotidsyntese den kjemiske prosessen der nukleosidfosforamiditter – et sentralt monomere element i oligonukleotider – syntetiseres. Nukleosidfosforamiditter (også kjent som nukleosider eller amiditter) er i seg selv derivater av naturlige eller syntetiske nukleosider.

Nukleotider er derfor sammensatte molekyler som består av et kovalent bundet nukleosid og en fosfatgruppe. Nukleotider er koblet i en bestemt sekvens for å danne ønsket produkt. Dermed består oligonukleotider av korte segmenter av nukleinsyrer som er bundet sammen og danner enkjedede biologiske polymerer ("-mers"). Siden de fleste oligonukleotider (oligoer) vanligvis består av opptil 20 koblede nukleotider (selv om flere er mulige), kan de betraktes som små biofarmasøytiske molekyler. 

På samme måte som andre farmasøytisk relevante små molekyler, krever oligonukleotidsyntese nøye kontroll med hensyn til temperatur, pH, kvalitet på substrater, etc. På grunn av de typiske metodene som brukes i oligonukleotidsyntese, jo lengre og mer komplisert nukleotidsekvensen er, desto vanskeligere er det å oppfylle avkastnings-, renhets- og kostnadsmål. Prosessanalytiske teknologier (PAT) er nyttige for å nå disse målene.

Oligonukleotidprimere og prober

Den vanligste bruken av syntetiske oligonukleotider er som relativt korte prober og primere (opptil 30 mer) i en lang rekke applikasjoner. Dette innebærer å syntetisere en nukleotidsekvens som er paret eller "omvendt-komplimenterende" til en større mål-DNA eller RNA-streng (målsekvens). Som primere brukes oligoer vanligvis til å sette i gang enzymatiske reaksjoner for for eksempel å lage millioner til milliarder av kopier av en kort eller lang målsekvens. Kjente eksempler er polymerasekjedereaksjonen (PCR) eller Sanger-sekvenseringsmetoden. Bruksområder for oligoprimere inkluderer DNA-sekvensering, genuttrykk, kloning og molekylær diagnostikk.

Som prober tjener oligoer til å identifisere og binde seg til en spesifikk DNA- eller RNA-målsekvens for å bekrefte tilstedeværelsen av denne sekvensen i et gitt materiale. Applikasjoner som bruker oligoprober inkluderer blotting-prosedyrer som northern blotting (for RNA) eller southern blotting (for DNA), som fluoroforkonjugerte sekvenser i mikromatriser som oppdager endringer i genuttrykk eller brukes i screening for genetiske sykdommer eller for å identifisere spesifikke patogener (molekylær diagnostikk).

Oligo Therapeutics/Genterapi

I terapeutiske applikasjoner utnytter antisense-oligonukleotider (ASO), vanligvis 20 til 30-mer arter, naturlig biologi og letter genhemming eller gendeaktivering (ødeleggelse) av uønskede eller overaktive RNA-sekvenser, dette blokkerer igjen ekspresjon av visse skadede eller overaktive proteiner som kan forårsake eller lette sykdom. Forskningen på oligonukleotidbaserte terapier har intensivert enormt, og flere legemidler har blitt godkjent de siste årene.

Fremtidig bruk av syntetiske nukleotider: Utforsking av DNA- og RNA-vaksinemodaliteter

Selv om det ikke er et oligonukleotid etter streng definisjon, representerer DNA- eller RNA-baserte vaksineprodukter, som mRNA eller plasmid eller vektorbaserte nukleinsyrer, med mange hundre eller tusenvis av baser i lengde, frontlinjene for utviklende syntetiske nukleotidteknologier.

I konseptet ville DNA- eller RNA-vaksiner dispensere med alle unødvendige eller skadelige deler av en patogen bakterie eller virus. I stedet vil en slik nukleinsyrebasert vaksine inneholde kode for bare noen få deler av patogenets DNA eller RNA. Disse DNA- eller RNA-trådene instruerer pasientens egen kropp til å produsere individuelle antigener eller fragmenter av patogenet, og fremmer deretter en immunrespons mot antigenet. Med moderne databehandling og in silico-modellering er disse oligonukleotidvaksinemodalitetene i stand til å lages i løpet av dager eller uker gitt en passende målsekvens å designe mot. Som en plattformteknologi er nukleinsyrebaserte vaksiner avhengige av standardsett med byggesteiner eller råvarer som muliggjør utallige kombinasjoner nesten etter eget ønske. Som sådan er de også relativt billige og enkle å produsere sammenlignet med tradisjonelle vaksinemodaliteter. Dette er imidlertid fortsatt et modent paradigme for den biofarmasøytiske industrien, og nye utfordringer blir stadig adressert, noen unike for oligo- og langnukleinsyreprodukter og noen delt med andre bioterapeutiske modaliteter.

Oligonukleotidsyntese er den kjemiske prosessen der nukleotider er spesifikt koblet for å danne det ønskede sekvenserte produktet. Kontinuerlig fastfasesyntese ved bruk av en søyle med pakket seng brukes ofte til å produsere oligonukleotider. I noen tilfeller brukes en batch, slurryreaksjon.

Prosessen med å produsere måloligomersekvensen tar en rekke sykluser som består av spesifikke syntetiske trinn. I det første trinnet fjernes en 4,4' dimetoksitritylbeskyttende gruppe på det faste fasestøttede nukleotidet Deretter aktiveres en fosforamidittmonomer og kobles raskt gjennom den frie hydroksylgruppen på det faste fasebundne nukleotidet for å lage et dinukleosid som inneholder en fosfitttriesterkobling. I det tredje trinnet oksideres fosfitttriesteren. I det siste trinnet (i den første syklusen) blir eventuelle ureagerte støttede nukleosider "dekket" via acetylering for å forhindre at uønskede biprodukter dannes i neste syklus.

Lengden på et oligonukleotid er definert av antall nukleotider som utgjør sekvensen. Når det gjelder nomenklatur, er en sekvens som er 20 nukleotider lang definert som en "20-mer". Oligolengden er avgjørende for de forskjellige bruksområdene. For eksempel brukes korte mer-oligoer ofte i PCR, mens svært lange sekvenser (200 baser eller mer) brukes i krevende applikasjoner som kloning eller CRISPR-redigering. Syntesen av spesialiserte oligoer med lang merer er utfordrende, og å levere en ren sekvens krever både effektiv syntesekontroll og rensemetoder. I gjennomsnitt er de fleste oligoer mindre enn 60 mer lange. Siden måten oligoer syntetiseres på krever repeterende reaksjonssykluser som legger til ytterligere nukleotider, jo lengre sekvens som kreves, jo større er sannsynligheten for å danne uønskede biprodukter – som kan inkludere slettings- eller trunkeringssekvenser.

Ulike rensemetoder brukes avhengig av kvalitet, kvantitet og kostnadsmål. For eksempel har saltfrie oligoer biprodukter fra den kjemiske syntesen fjernet, men sekvensfeil gjenstår. Disse avsaltede oligoene er nyttige fra et kostnads- og effektperspektiv for mer rutinemessige applikasjoner, for eksempel PCR. For mer krevende applikasjoner fjerner reversfasekromatografi uønskede sekvenser fra et produkt, men ikke like effektivt som gelelektroforese, som leverer et høyt renset sekvensprodukt, men vanligvis i begrensede mengder. Spesielt for kliniske bekymringer er avlingsretensjon en alltid tilstedeværende bekymring gjennom syntese og nedstrømsbehandling også.

Klassisk kjemisk syntese i fast fase involverer vanligvis bruk av polymer eller spesialiserte glassperler som ikke påvirkes av reaksjonsforholdene. Disse perlene kan være inneholdt i kolonner der reaktanter, reagenser og løsemidler strømmer gjennom. Hensikten med perlene er å fungere som en plattform der substratmolekyler er kovalent bundet, og deretter påvirket av kjemisk reaksjon. Beskyttelse og debeskyttelse av visse funksjonelle grupper på substratmolekylet er nøkkelen til syntesen og for å sikre at ønsket produkt oppnås. Synteseproduktet fjernes ved kjemisk å bryte bindingen mellom det og den underliggende polymerperlen.

Fastfasesyntese er effektiv til raskt å gi renset produkt, siden urenheter og ureagerte materialer vaskes bort i de forskjellige trinnene i syntesen. Videre er hele syntesen mottagelig for datakontroll og automatisering. Fastfasesyntese er den vanligste metoden som brukes for tilpasset peptid- og oligonukleotidproduksjon. I sistnevnte tilfelle kreves det mange repeterende sykluser for sekvensielt å legge til nukleotider for å danne målsekvensen.

Fastfase-oligonukleotidsyntese byr på mange utfordringer, inkludert reduksjon av utbytte når kjedelengden øker. Sterisk hindring antas ofte som en mekanisme for dårlig utbytte der en eller flere overflatefaste tråder kan forstyrre hver påfølgende forlengelse av naboen.

For å møte disse og andre utfordringer finnes det ulike metoder for væskefaseoligonukleotidsyntese.

Mange grunnleggende trinn i væskefasesyntese er analoge med fastfasesyntese. Hovedforskjellen er at syntese skjer i løsning eller væskefase (dvs. IKKE festet til noen overflate). Ettersom denne prosessen fortsatt fortsetter i sykluser, er det flere ledsagende metoder for fjerning av ureagerte reagenser samtidig som det langstrakte oligonukleotidproduktet beholdes.

Teknikken for å bruke PCR for oligonukleotidsyntese ble etablert i 1985. I 1986 ble den første bruken av Taq-polymeraseenzymet   introdusert. Likevel har industriell oligonukleotidsyntese slitt med å ta i bruk enzymatisk oligonukleotidsyntese av tre hovedårsaker:

1. Enzymatisk syntese krever en mal som det sekvensforlengende DNA-polymeraseenzymet kan operere på. Som sådan kan de novo oligonukleotidsyntese av enzym ikke fungere uten en mal. 
   
2. Mange oligoprimere, prober eller ASO-mål som kan brukes som mal er i seg selv for korte til å effektivt prime og utløse polymerasesyntese.
   
3. Mange kunstige terapeutiske oligoer er kjemisk modifisert for å lette forlenget halveringstid og forbedret funksjonalitet i humoral sirkulasjon, modifikasjoner som nesten eller helt forbyr deres interaksjon med evolusjonært avledede polymeraser (dette gjelder for det meste lengre oligoarter som mRNA).

Forskning og utvikling fortsetter for en konstruert polymerase som er i stand til ASO-syntese ved bruk av kjemisk modifiserte nukleotidlagre

Den komplekse naturen til oligonukleotidsyntese kan dra nytte av en høyere grad av prosessobservasjon, forståelse av reaksjonsmekanismer og avvik, og handlingsrettede kontroller. Sanntidsanalyser med PAT kan minimere eller eliminere behovet for tidkrevende eller trege offline-analyser.

• ReactIR og ReactRaman kan brukes til å følge kinetikken til oligonukleotidsyntesereaksjoner og sammenligninger mellom kjøringer.
• Presis temperatur-, omrørings- og doseringskontroll med EasyMax automatiserte kjemiske syntesereaktorer sammen med integrering av reaksjonstrender og mekanismer forenkler datafangst og enkel administrasjon gjennom iC-programvare 

Sanntidsovervåkingsmulighetene til in-situ FTIR og Raman-spektroskopi for kjemi utført under strømningsforhold er godt utprøvd, og er anvendelige i viktige trinn i oligonukleotidsyntese.

• Syntese av modifisert fosforamiditt og naturlige nukleotidmonomerer for å sikre struktur og renhet
• Reduser risiko forårsaket av synthesizermekaniske problemer eller feil løsningsmating
• Sporkoblingsreaksjon av fosforamidittmonomer til den frie hydroksylgruppen på det faste fasebundne nukleotiden
• Spor denaturering og gløding av komplementære oligonukleotider i dobbelttrådsyntese.
• Bestem kjemisk reaksjonskinetikk i glødeprosessen – identifiser og spor mellomprodukter eller ukjente
• Korrelere endringer i spektra med nøkkelpunkter i prosessen
• Gjelder for SPS, batch og konvergent peptidsyntese (SPS + løsningsfase)

Et godt kontrollert syntesemiljø er avgjørende for å sikre reaksjonsresultat. Automatiserte reaktorplattformer gir trygghet og konsistens på tvers av alle kritiske prosessparametere samtidig.

• Et reproduserbart miljø er grunnleggende for god vitenskap
• Forstå virkningen av prosessparametere på kritiske kvalitetsattributter ved å kombinere data fra sensorer og inline PAT
• Protokoll og automatisering reduserer manuelle risikoer eller inkonsekvenser
• Tilrettelegge for søkbare og strukturerte data
• Stol på flere tiår med sitering og bevis for oppskalering
• Gjelder for SPS, batch og konvergent peptidsyntese (SPS + løsningsfase)