Viral inaktivering i biobehandling

Viral inaktivering er det første af normalt to dedikerede trin, der er designet til at forbedre sikkerheden ved bioterapeutiske produkter. Under inaktivering ødelægges ethvert virus, der er til stede i den samlede og halvoprensede terapeutiske suspension, bevidst eller gøres pludselig ikke-patogent, normalt ved at ændre miljøet omkring virussen for at forårsage irreversibel forstyrrelse og denaturering af virusstrukturen.

Typisk gøres dette ved at ændre miljøet omkring virussen for at forårsage irreversibel forstyrrelse og denaturering af virusstrukturen – f.eks. gennem kemiske, fysiske eller endda energiske metoder. Fjernelse af virus er adskilt og adskilt fra viral inaktivering, da det er en komplementær proces, der yderligere forbedrer virussikkerheden ved at eliminere eller adskille virussen fra proteinet eller proteinerne eller produkterne af interesse.

Mange bioterapeutiske produkter indeholder eller kan blive forurenet med vira under produktion eller forarbejdning. Patogeniciteten og virusmængden eller mængden af virus i disse modaliteter skal elimineres eller fjernes ved hjælp af en inaktiverings- og fjernelsesmetode for at forhindre skade på patienten. Ingen af processerne alene er typisk tilstrækkelige. Der findes flere metoder til viral inaktivering og fjernelse afhængigt af virussens specifikke karakteristika og typen af bioterapeutisk produkt. Mange bioterapeutiske behandlingsarbejdsgange vil bruge en kombination af komplementære metoder til at øge spektret af vira, som kan elimineres tilstrækkeligt.

Inaktivering
Flere metoder til viral inaktivering er mulige. De mest almindelige er:

• Metoder baseret på lav pH – især for bioterapeutiske produkter som monoklonale antistoffer (mAbs)
• Opløsningsmiddel- eller overfladeaktive metoder – normalt for polysaccharider

Mindre hyppigt anvendte virale inaktiveringsmetoder omfatter pasteurisering, tør varme og dampvarme - især for blod- eller serumbaserede produkter.

Fjernelse af virus
Veldokumenterede metoder til fjernelse af virus omfatter udfældning, kromatografi og nanofiltrering.

Valget af metoder, der skal anvendes til inaktivering og fjernelse af vira, afhænger af størrelsen, typen og labiliteten af det bioterapeutiske produkt, der fremstilles, den eller de rensningsmetoder, som producenten ønsker at anvende, og arten og titeren af de pågældende vira. Drug Substance (DS) struktur og funktion er lige vigtige kvalitetsegenskaber sammen med viral sikkerhed og skal evalueres og vedligeholdes hele vejen igennem. Enhver viral inaktiveringsmetode, lav pH eller overfladeaktivt stof, drager fordel af præcis og samtidig kontrol af flere kritiske procesparametre (CPP'er); en evne, der er nødvendig for effektivt at forstå selve processen og effekten på Drug Substance (DS). Kemiske syntesereaktorer muliggør kortlægning af en moderne proces og konsistent drift inden for et defineret parameterrum, samtidig med at de modellerer for metodeoverførsel og opskalering.

Viral inaktivering af bioterapeutiske produkter med lav pH er kendt for at være påvirket af pH, tid, temperatur, proteinindhold og indhold af opløste stoffer eller buffere. Mange vira denatureres irreversibelt og ødelægges effektivt ved pH 5,0-5,5. Afhængigt af omfanget af vira, der er målrettet mod inaktivering og clearance, kan dette interval være tilstrækkeligt. Imidlertid inaktiveres flere indkapslede vira kun effektivt ved pH-område 3,5-4.

Mange mAb-bioterapeutiske produkter kræver særlig bredspektret clearance af flere virustyper, således at et "lavt" pH-mål på 3,5-4 almindeligvis praktiseres (figur A). Langvarig eksponering for dette pH-område kan dog også beskadige eller inaktivere nogle bioterapeutiske produkter, specifikt proteiner eller enzymer såsom blodproteiner, insulin og andre (figur B). Ved langvarig eksponering for pH-stress udsættes proteiner og enzymer for betydelig deamidering, denaturering og aggregering. Immunglobulinopløsninger (inklusive både IgG og IgM mAbs) er typisk mindre modtagelige end andre proteiner eller enzymer ved pH 3,5-5,5 - selvom de forbliver modtagelige i forskellige grader. Efter tilstrækkelig tid ved virale inaktiverende forhold bør den infektiøse virusbyrde minimeres effektivt, men resterende virale partikler, snavs eller andet indhold vil endnu ikke være fysisk fjernet (figur C).

For immunoglobulin mAb-produkter er lav pH den hyppigst anvendte metode til viral inaktivering, da den er relativt enkel, opretholder et lille fodaftryk og typisk kræver lidt indgriben eller yderligere trin for at fjerne, i modsætning til overfladeaktive stoffer eller andre opløsningsmidler. Alligevel varierer de passende og optimale betingelser mellem molekyler såvel som det krævede spektrum af viral clearance. Derfor skal der foretages undersøgelser for hvert molekyle for at karakterisere og validere designrummet eller de operationelle grænser, hvor effektiv viral inaktivering kan finde sted. Disse grænser og resultatet af en viral inaktiveringsproces er typisk defineret af alle, eller i det mindste et udvalg, af de variabler eller kritiske procesparametre (CPP'er), der påvirker resultatet af viral inaktivering og dermed kvaliteten af lægemiddelstoffer (DS). Identifikation og navigering af disse faktorer vil påvirke produktkvalitet og kvantitet positivt.

Traditionelt udføres virale inaktiveringsundersøgelser med lav pH med et bestemt volumen og koncentration af immunglobulinopløsningen i et kar såsom et bægerglas med magnetisk omrøring. Da det meste af undersøgelsesmaterialet vil bruge immunglobulinopløsninger med en start-pH, der er tæt på fysiologiske forhold, vil virale inaktiveringsundersøgelser søge at belyse reagenstilsætningsparametrene. Typisk udføres en manuel titrering ved hjælp af en burette eller pipettering, mens pH-målingen periodisk registreres. Efter afslutningen af en foreskrevet tid og anden parameterhold ved lave pH-forhold, der er tilstrækkelige til at inaktivere målrettet virusindhold, vil lægemiddelstoffet (DS) eller immunglobulinopløsningen blive omvendt titreret fra det lave pH-område til inden for et passende fysiologisk eller let basisk område. Dette tjener som afslutningen af den virale inaktivering ved lav pH-hold. Alligevel er prøveekstraktion påkrævet i løbet af undersøgelsen af lav pH-titrering for viral inaktivering til offline-analyse for at dokumentere forskellige kvalitetsattributter såsom aggregering eller deamidering gennem metoder såsom Size Exchange Chromatography (SEC). Selvom præcision er mulig fra dygtige forskere, er den virale inaktiveringsproces typisk besværlig og lider af de naturlige variationer, unøjagtigheder og udfordringer ved reproducerbarhed af enhver manuel proces.

Mens det primære behov for virale inaktiveringsundersøgelser med lav pH i downstream-biobehandling er at definere omfanget af reagenstilsætning og den tid, der er nødvendig for processen, er karakterisering af proceskinetik og virkningen af sammensætningsprocesparametre også af betydning og i sidste ende et krav for at sikre design af en viral inaktiveringsproces, der er både robust og optimeret. Alligevel er temperaturovervågning og -kontrol ofte en overset og derfor en ukontrolleret parameter under procesudviklingsundersøgelser for viral inaktivering.

Denne forglemmelse kan til dels skyldes brugen af pilotsystemer eller endog kommercielle produktionssystemer, der udfører viral inaktivering i lastrum eller overførselsbeholdere, som kan registrere, men ikke kontrollere temperaturen. Repræsentativitet af skalaen, især repræsentativiteten af blanding, er ofte en anden parameter, der let overses i undersøgelser af viral inaktivering med lav pH, f.eks. dem, der udføres via manuelle platforme, der styres af magnetiske omrøringsplader. Manglende datafangst for noget så simpelt som blanding gør det umuligt at verificere, om de formodede betingelser for undersøgelsen var korrekte og konsistente.

Behandlingen med lav pH i forbindelse med drift af virusinaktiveringsenheden udgør en potentiel risiko for aggregering af produkter i processen under downstream-behandling for et monoklonalt antistof. Præsenteret af Hiren D. Ardeshna fra GlaxoSmithKline, diskuterer denne præsentation et fuldfaktorielt eksperimentelt design til at undersøge effekten af fire procesparametre:

• Slutpunkt med lav pH
• Lav pH-holdetid
• Titrering af lav pH-værdi
• Neutraliseringstitrerings varighed

Opløsningsmiddel- eller rengøringsmiddel-virusinaktiveringsmetoder anvendes almindeligvis mod indkapslede vira. De anvendte reagenser har generelt ubetydelig indvirkning på labiliteten af det terapeutiske protein eller de antistoffer, der er udsat for de udfordringer ved denaturering eller deamidering, der er mulige med nogle metoder med lav pH. Opløsningsmiddel- eller rengøringsmiddelbehandlingsmetoder til viral inaktivering har mange af de samme behov og drivkræfter som metoder med lav pH; primært at definere omfanget af reagenstilsætning (i dette tilfælde et opløsningsmiddel eller rengøringsmiddel) og den tid, der er nødvendig for processen. Som med viral inaktivering med lav pH varierer betingelserne mellem immunglobuliner eller andre typer lægemiddelstoffer (DS). Derfor skal der udføres undersøgelser for hvert molekyle for at karakterisere og validere designrummet eller de operationelle grænser, hvor effektiv opløsningsmiddel- eller rengøringsmiddelvirusinaktivering kan finde sted. Disse grænser og resultatet af en viral inaktiveringsproces er på samme måde defineret af kritiske procesparametre (CPP'er), herunder temperatur, proteinindhold, indhold af opløsningsmiddel eller vaskemiddel, tid ved inaktiveringsforhold samt blanding og effektivitet af homogenisering af opløsningsmiddel eller vaskemiddel. Identifikation og navigering af disse faktorer vil påvirke produktkvalitet og kvantitet positivt.

Mens undersøgelser af viral inaktivering af vaskemidler ikke kræver samme form for reagenstitrering som undersøgelser med lav pH, skal der stadig evalueres et designrum med kritiske variabler. Som med lav pH-værdi karakteriserer virale inaktiveringsundersøgelser ved hjælp af opløsningsmidler eller rengøringsmidler traditionelt processen helt manuelt. Reagensdosering og -kontroller er ligeledes afhængige af nøjagtigheden og præcisionen af højt kvalificerede personer, der samtidig udfører flere kritiske opgaver. Undersøgelser af virusinaktivering af opløsningsmidler eller rengøringsmidler er ligeledes underlagt naturlige variationer, unøjagtigheder og udfordringer med reproducerbarhed.

Virale inaktiveringsmetoder, der er afhængige af opløsningsmidler eller rengøringsmidler, kræver generelt et yderligere overvejelsespunkt, der typisk ikke er relevant for metoder med lav pH. Eventuelle tilsatte opløsningsmidler eller rengøringsmidler skal fjernes fra lægemiddelstoffet (DS) eller immunglobulinopløsningen og verificeres ved en passende analysemetode. Typisk fjernes opløsningsmidler eller rengøringsmidler via enten kromatografi eller bufferudveksling via tangentiel flowfiltrering. Fjernelse af tilsatte opløsningsmidler eller rengøringsmidler er noget analogt med formålet med omvendt pH-titrering fra en lav pH-inaktivering tilbage til inden for et passende fysiologisk eller let basist område. I stor skala vil bufferudveksling eller kromatografiske metoder sandsynligvis forekomme som kontinuerlige eller semi-kontinuerlige enhedsoperationer, når materialet bevæger sig fra en lastbeholder, gennem en kolonne eller en anden passende membran til udveksling af opløsningsmiddel eller buffer. Ved procesudvikling vil opløsningsmidlet eller rengøringsmidlets virale inaktivering sandsynligvis ske adskilt og adskilt fra det følgende rensnings- eller fjernelsestrin. Som sådan kan data- eller informationskontinuitet forværres af denne praksis.

Forskellige vaccineprodukter gennemgår viral inaktivering, herunder toksoid, rekombinant protein, underenhed, polysaccharid og endda nogle få udvalgte viruslignende partikelvacciner. Igen vil valget af en passende viral inaktiveringsmetode tage hensyn til arten af det bioterapeutiske produkt såvel som bredden af vira, der skal fjernes effektivt.

Generelt skal der tages nøje hensyn til alternative metoder eller praksisser, der forhindrer fremmed viral kontaminering for vaccinetyper såsom levende svækkede vira – hvor det bioterapeutiske produkt er en viral partikel. Specifikke metoder for sådanne produkter kan omfatte en eller flere nanofiltrerings- eller kromatografiske processer til effektiv reduktion af fremmed virusbelastning i de respektive råmaterialekilder. Inaktiverede eller destruerede vira kan stadig gennemgå en passende lav pH-værdi eller opløsningsmiddel- eller rengøringsmiddelbaseret viral inaktiveringsproces – da dette stadig kan opretholde den ønskede immunstimulerende effekt, selvom det virale produkt denatureres eller på anden måde forstyrres.

Virale inaktiveringsmetoder for oligonukleotidprodukt - eller molekyletyper anses ikke generelt for nødvendige. Dette skyldes hovedsagelig reagenser, reaktionsbetingelser og forarbejdningsmetoder, som konsekvent er ugunstige for vira. På nuværende tidspunkt renses, koncentreres og formuleres mange sådanne oligonukleotidprodukter under udvikling og produktion primært ved forskellige bufferudvekslinger via tangentiel flowfiltrering eller ved en af de forskellige typer kromatografisk separation.

Med behovet for datakontinuitet og elektroniske batchregistreringer fungerer kemiske syntesereaktorer som en kraftmultiplikator i virale inaktiveringsprocesser både ved design og udførelse af eksperimenter og ved at lette dataindsamling og integritet. Orthogonal Process Analytical Technology (PAT) bygger bro mellem flere applikationer og arbejdsgange, såsom viral inaktivering med bufferudveksling, og modellerer mere præcist processtrømme for store operationer.

Se en live eDemo fra dit arbejde eller hjemmekontor efter din tidsplan.

• Tryk på Afspil og gå væk; iC-software reagerer dynamisk på forholdene i reaktoren. Udfør konsekvent operationer inden for grænserne af den virale inaktiveringsprotokol.
• Optag data fra flere sensorer, herunder pH, ledningsevne, oxidativt redoxpotentiale (ORP) og opløst ilt.
• Integrer perifere enheder som pumper eller vægte til gravimetrisk masseoverførsel.

In-situ FTIR og Raman-spektroskopi sporer kritiske bioproceskomponenter gennem opstrøms-, nedstrøms-, konjugations- og formuleringsenhedsoperationerne.

Glukose og nøglemetabolitter kan overvåges i opstrømsapplikationer, mens protein- eller vaccinekoncentration, stabilisatorer, hjælpestoffer og urenheder i downstream-processer alle kan overvåges og kontrolleres i realtid uden den forsinkelse eller de omkostninger, der er forbundet med offline-analyse.

Dette muliggør hurtig bestemmelse af processlutpunkter samt en klar forståelse af virkningen af forskellige procesparametre på produktkvalitet og proceseffektivitet.