Pufry jsou vodné systémy, které odolávají změnám pH při přidání malého množství kyseliny nebo zásady a skládají se ze slabé kyseliny a její konjugované báze. Pufr udržuje pH roztoku konstantní tím, že absorbuje protony, které se uvolňují během reakcí, nebo uvolňováním protonů, když jsou spotřebovány reakcemi. Objev, že částečně neutralizované roztoky slabých kyselin nebo zásad jsou odolné vůči změnám pH, když se přidají malá množství silných kyselin nebo zásad, vedl ke konceptu "pufru".

Konjugovaná báze je kyselina, která ztratila proton.
HA  ↔  H⁺ + A^-
Kyselý  ↔  proton + konjugovaná báze

Konjugovaná kyselina je báze, která získala proton.
A + H⁺  ↔  H⁺A
Báze + protonová  ↔  konjugovaná kyselina

Je nastolena rovnováha mezi disociovanou a nedisociovanou formou.
Například slabá kyselina octová se ve vodě částečně disociuje a vytváří acetátový iont:
CH₃COOH  ↔  H⁺ + CH₃COO^-
Nedisociovaná kyselina octová, vodíkové ionty a disociovaný iont existují v roztoku v rovnováze.

Octan sodný se také disociuje ve vodě za vzniku stejného acetátového iontu:
CH₃COONa  ↔  Na⁺ + CH₃COO^-
Nedisociovaný octan sodný a ionty sodíku a acetátu existují v roztoku v rovnováze.

Vodný roztok směsi kyseliny octové a octanu sodného proto může absorbovat ionty H⁺ z přidání kyseliny sloučením vodíkových iontů s acetátovou bází za vzniku kyseliny octové. Kromě toho, když jsou ionty OH^- zavedeny do roztoku přidáním alkálie, spojují se s molekulami kyseliny (H⁺) za vzniku vody. Tímto způsobem, když se systém pokouší obnovit rovnováhu, roztok odolává změnám hodnoty pH. 

Co se stane po přidání kyseliny do pufru?

Když se k rovnovážné směsi slabé kyseliny a její konjugované báze přidá nějaká silná kyselina (více H+), rovnováha se posune doleva, v souladu s Le Chatelierovým principem.

Co se stane po přidání báze do vyrovnávací paměti?

Podobně, pokud se do směsi přidá silná zásada, koncentrace vodíkových iontů se sníží o méně, než se očekává pro množství přidané báze. Je to proto, že reakce se posouvá doprava, aby se přizpůsobila ztrátě H⁺ v reakci s bází.

Pufrovací roztoky sestávající ze slabé kyseliny a její konjugované báze jsou známé jako kyselé pufry a mají pH < 7. Pufr vyrobený z kyseliny octové (slabá kyselina) a octanu sodného (konjugovaná báze) je kyselý pufr a má pH kolem 4,75.
Pufrovací roztoky sestávající ze slabé báze a její konjugované kyseliny jsou známé jako alkalické pufry a mají pH > 7. Příkladem alkalického pufru je vodný roztok hydroxidu amonného (slabá zásada) a chloridu amonného (konjugovaná kyselina), který má pH 9,25.

Pufrovací roztoky fungují nejlépe, když je jejich pH podobné pH zkoumaného systému nebo roztoku. Při studiu enzymů v lidské biologii je vyžadován systém, který odpovídá pH krve, tj. 7,35 až 7,45, jinak enzymy nebudou správně fungovat. Pokud má pufrovací systém pH mimo požadovaný rozsah, bude to mít také negativní dopad na analýzy.

Je proto nutné umět připravit pufrovací roztoky o specifickém pH a to lze provést různými způsoby:

• Úprava pH
  Krystalická kyselina nebo zásada se nejprve rozpustí v objemu vody, který odpovídá přibližně 60-70 % konečného požadovaného objemu roztoku. pH se testuje a poté upravuje. Pokud se použije krystalická kyselina, pH se upraví pomocí báze, která nebude vytvářet ionty, které by mohly interferovat se zkoumaným systémem. Pokud se použije krystalická zásada, pH se upraví pomocí vhodné kyseliny. Jakmile je dosaženo požadovaného pH, lze objem roztoku doplnit vodou, aby se získal požadovaný objem.
  
  
• Míchání kyselých a zásaditých roztoků
  Při této metodě se roztok kyseliny nebo zásady smíchá s roztokem přidružené soli. Koncentrace zdrojových roztoků musí být stejné jako v požadovaném pufrovacím roztoku. Roztoky lze míchat v různých poměrech, aby se dosáhlo různých hodnot pH v konečném pufrovacím roztoku. Alternativně lze pH sledovat při přidávání jednoho roztoku do druhého.
  
  
• Použití Henderson-Hasselbachovy rovnice
  Henderson-Hasselbachovu rovnici lze použít k odhadu pH pufrovacího roztoku pomocí disociační konstanty, pK_a. Když je slabá kyselina (HA) v roztoku a disociace na vodíkové ionty (H⁺) a její konjugovaná báze (A^-) je v rovnováze, disociační konstanta je mírou síly kyseliny v tomto rovnovážném bodě. Hendersonova-Hasselbachova rovnice je následující: 



Kde: pKa je disociační konstanta slabé kyseliny
[A-] je koncentrace konjugované báze v rovnováze
[HA] je koncentrace kyseliny v rovnováze

V případě, že koncentrace konjugované báze a kyseliny v rovnováze je stejná, pH se rovná disociační konstantě. V tomto okamžiku poskytuje pufrovací roztok maximální schopnost ukládání do vyrovnávací paměti.
Hendersonova-Hasselbachova rovnice se také používá pro stanovení disociační konstanty slabých kyselin přímým měřením pH

Univerzální pufrovací roztoky se skládají z kombinace několika acidobazických párů. To umožňuje univerzálním pufrům udržovat hodnotu pH roztoku v širším rozsahu, a proto je lze použít v mnoha dalších aplikacích.

• Vytvoření SOP přípravy vyrovnávací paměti
  Je dobré zdokumentovat proces přípravy pufru a ujistit se, že všichni dodržují stejný postup, aby byla zajištěna konzistence a reprodukovatelnost. SOP by měl obsahovat podrobnosti o použitých materiálech a přesné kroky, kdy a jak přidat složky a změřit pH. SOP může také obsahovat mnoho z níže uvedených bodů.
  
  
• Noste ochranný oděv
  Je nutné používat vhodné osobní ochranné prostředky (OOP), například ochranné brýle a oděv, zejména při práci se silnými kyselinami nebo zásadami.
  
  
• Kontrola mikrobiální kontaminace (zejména v biologických aplikacích)
  Před použitím jakéhokoli pufru zkontrolujte nádobu, zda není mikrobiálně kontaminována. Pufrovací roztoky s pH blízkým neutrálnímu jsou zvláště náchylné ke kontaminaci. V roztoku můžete vidět určitý zákal nebo nečistoty, které se usadily na dně.
  
  
• Správné používání pH metru
  Váš pH metr by měl být pravidelně kalibrován a udržován, aby bylo zajištěno přesné měření pH. Elektroda by měla být před použitím řádně připravena a mělo by být použito dostatečné množství roztoku, aby bylo zajištěno, že elektrodový spoj je správně ponořen. Před měřením nezapomeňte počkat na stabilní hodnotu pH a poté elektrodu opláchněte destilovanou vodou. Ujistěte se, že používáte pH metr při okolní teplotě nebo používáte elektrodu s integrovanou teplotní sondou.
  
  
• Dávejte pozor na teplotu
  Míra disociace se může lišit s teplotou. Váš pufrovací roztok by proto měl být připraven při stejné teplotě, při které budete provádět analýzy. Také se ujistěte, že teplota, při které elektrodu kalibrujete, je stejná jako teplota, při které měříte.
  
  
• Buďte si vědomi koncentrace
  Běžnou praxí je ředit zásobní pufrovací roztoky na požadovanou koncentraci pro použití v analýzách. Změna koncentrace však může ovlivnit míru disociace. Protože pH je měřítkem vodíkových iontů (H⁺), změna disociace může způsobit změnu pH. Po naředění by mělo být pH před použitím pufru znovu zkontrolováno.