การตกผลึกโปรตีน

การตกผลึกโปรตีนคือการกระทำและวิธีการสร้างโครงสร้างที่มีระเบียบแบบแผนสำหรับโมเลกุลขนาดใหญ่ที่ซับซ้อน โปรตีนโดยทั่วไปจะเป็นของแข็งที่ไม่มีรูปร่างแน่นอนและมีแนวโน้มที่จะเสื่อมสภาพ ในขณะที่โปรตีนที่อยู่ในโครงสร้างผลึกจะต้านทานการเสื่อมสภาพและมีความเสถียรมากกว่า โปรตีนสามารถตกผลึกได้หากถูกวางในสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมและเอื้ออำนวย การตกผลึกโปรตีนถือเป็นทั้งศิลปะและวิทยาศาสตร์ เนื่องจากมีปัจจัยหลายอย่างที่ซับซ้อนซึ่งมีผลต่อกระบวนการตกผลึกโปรตีน

เหตุผลที่พบบ่อยที่สุดในการสร้างผลึกโปรตีนคือเพื่อสนับสนุนการวิจัยทางชีววิทยาเชิงโครงสร้าง โดยปกติจะใช้วิธีการเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์แบบผลึกวิทยา นักวิจัยสามารถมองเห็นบริเวณในโครงสร้างที่อนุญาตให้มีปฏิสัมพันธ์กับโมเลกุลอื่น ๆ ได้โดยการเข้าใจโครงสร้างสามมิติของโปรตีน (เช่น เพื่อเข้าใจวิธีที่เอนไซม์ ซับสเตรต และลิแกนด์มีปฏิสัมพันธ์กัน) นอกจากนี้ การตกผลึก ยังเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการสร้างโปรตีนบริสุทธิ์ที่ปราศจากการปนเปื้อนจากโปรตีนอื่น ๆ หรือสารชีวภาพที่ไม่พึงประสงค์ จึงเป็นทางเลือกในการทำให้บริสุทธิ์และแยกสารแทนการใช้โครมาโตกราฟีเตรียมตัว

การตกผลึกดำเนินไปผ่านกลไกที่ขึ้นต่อกันหลายขั้นตอนซึ่งแต่ละขั้นตอนได้รับอิทธิพลเฉพาะจากการเลือกพารามิเตอร์กระบวนการ ได้แก่ การสร้างเม็ดผลึก การเจริญเติบโต การเกิดน้ำมัน การรวมตัว การแตกหัก การเพาะเมล็ด และการเปลี่ยนรูปแบบโพลีมอร์ฟิซึม

บ่อยครั้ง กลไกเหล่านี้เกิดขึ้นพร้อมกัน ทำให้การออกแบบการตกผลึกที่มีประสิทธิภาพเป็นเรื่องท้าทาย ในกรณีที่ไม่มีความเข้าใจเชิงกลไก นักวิทยาศาสตร์ต้องอาศัยการลองผิดลองถูกเพื่อปรับพารามิเตอร์กระบวนการและเพิ่มผลผลิต ความบริสุทธิ์ และขนาดผลึก โดยการเข้าใจว่ากลไกใดเกิดขึ้นในระหว่างการตกผลึก นักวิทยาศาสตร์สามารถใช้กลยุทธ์เพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ผลึกที่มีคุณสมบัติตามต้องการ

โปรตีนมีความสำคัญเพิ่มขึ้นในฐานะยารักษาโรค อย่างไรก็ตาม การผลิตโปรตีนที่มีความเสถียรตามที่ต้องการเป็นความท้าทายสำคัญ รวมถึงความแปรปรวนของผลิตภัณฑ์ การสูญเสียโครงสร้างซึ่งจะลดประสิทธิภาพ และการก่อตัวของผลิตภัณฑ์ข้างเคียงที่อาจเป็นอันตราย การตกผลึกโปรตีนเป็นวิธีการผลิตรูปแบบยาของแข็งที่บริสุทธิ์และเสถียร รวมถึงยาฉีดและยาฉีดผ่านเส้นเลือดที่เกี่ยวข้องกับผลึกโปรตีน ในอดีต การตกผลึกโปรตีนเป็นกิจกรรมในห้องปฏิบัติการเพื่อสนับสนุนการถ่ายภาพผลึกด้วยรังสีเอกซ์ แต่เนื่องจากการเติบโตอย่างรวดเร็วของยาที่มีพื้นฐานจากโปรตีน การเพิ่มขนาดการตกผลึกโปรตีนไปสู่ระดับการผลิตจึงมีความสำคัญมากขึ้นและเป็นพื้นที่ที่ได้รับความสนใจอย่างเข้มข้น

การเพิ่มขนาดการตกผลึกโปรตีนมีความคล้ายคลึงกับการตกผลึกโมเลกุลขนาดเล็กในแง่ของความต้องการในการปรับพารามิเตอร์กระบวนการที่สำคัญ (CPPs) ในระดับห้องปฏิบัติการเพื่อให้ได้คุณลักษณะคุณภาพที่สำคัญ (CQAs) ของสารยาในรูปผลึกในระดับการผลิตเชิงพาณิชย์ แพลตฟอร์มแบบองค์รวมสำหรับการพัฒนากระบวนการตกผลึกโปรตีนและการเพิ่มขนาดโดยทั่วไปประกอบด้วย:

• การวิเคราะห์ระบบอนุภาคในสถานที่
• การตรวจสอบด้วยสเปกโตรสโกปีและการวิเคราะห์โพลีมอร์ฟิซึม
• การเพิ่มประสิทธิภาพขั้นตอนและกลยุทธ์การควบคุมป้อนกลับผ่านโมดูลและเซ็นเซอร์ที่รวมกัน

มีการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมเภสัชกรรมที่สำคัญเกี่ยวกับการตกผลึกโปรตีน ได้แก่ เคมีเภสัชกรรมผ่านชีววิทยาเชิงโครงสร้าง การพัฒนายาโปรตีน การเพิ่มขนาด การแยกและทำให้บริสุทธิ์ การเตรียมสูตรและการส่งมอบยา

• เคมีเภสัชกรรมผ่านชีววิทยาเชิงโครงสร้าง ความก้าวหน้าในเทคนิคการตกผลึกโปรตีนและการถ่ายภาพผลึกด้วยรังสีเอกซ์ที่ดีขึ้นได้นำไปสู่การสรุปโครงสร้างโปรตีนสามมิติจำนวนหลายหมื่นโครงสร้าง การเข้าใจปฏิสัมพันธ์ระหว่างยาและตัวรับอย่างละเอียดเป็นไปได้โดยการกำหนดโครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่เหล่านี้และการมองเห็นตำแหน่งการจับ ข้อมูลนี้ช่วยให้เข้าใจในระดับโมเลกุลเกี่ยวกับสารยับยั้งโปรตีน ตัวกระตุ้นอัลโลสเตอริก โคแฟกเตอร์ และแม้แต่ตำแหน่งการทำงานของเอนไซม์หรือ 'ตำแหน่งที่ใช้งาน' – ส่งผลให้ได้ยาที่ดีกว่าด้วยประสิทธิภาพที่สูงขึ้น ตัวอย่างคลาสสิกของความสำคัญในการเข้าใจโครงสร้างโปรตีน-สารยับยั้งผ่านการถ่ายภาพผลึกแสดงให้เห็นโดยความก้าวหน้าอย่างมากในการพัฒนาตัวโปรตีเอสของ HIV
• การพัฒนา การเพิ่มขนาด การแยกและทำให้บริสุทธิ์สำหรับยาที่มีพื้นฐานจากโปรตีน นอกจากการเพาะผลึกโปรตีนเดี่ยวเพื่อการถ่ายภาพผลึกด้วยรังสีเอกซ์แล้ว อุตสาหกรรมเภสัชกรรมยังเพิ่มความพยายามในการพัฒนายาที่มีพื้นฐานจากผลึกโปรตีน เป้าหมายของการประยุกต์ใช้เหล่านี้คือการพัฒนาและเพิ่มขนาดไปสู่ปริมาณมากของผลึกโปรตีนบริสุทธิ์และเสถียรที่มีขนาดอนุภาคที่เหมาะสมและการกระจายขนาดอนุภาคที่ควบคุมได้ดี เมื่อเทียบกับโครมาโตกราฟีเตรียมตัว การตกผลึกโปรตีนมีศักยภาพที่จะเป็นทางเลือกที่มีต้นทุนต่ำกว่าในการแยกและทำให้บริสุทธิ์โมเลกุลขนาดใหญ่และการแยกโมเลกุลคิรัล เครื่องมือสำหรับการเพิ่มขนาดการตกผลึกโปรตีนมีความคล้ายคลึงกับที่ใช้ในการเพิ่มขนาดปฏิกิริยาเคมีโดยต้องเข้าใจ CPPs และผลกระทบต่อ CQAs
• การเตรียมสูตรและการส่งมอบยา  ยาโปรตีนถูกให้ในรูปแบบสารละลายและอาจถูกส่งผ่านการฉีดหรือการให้อินฟิวชัน เนื่องจากต้องให้โปรตีนในปริมาณสูง สารละลายโปรตีนที่ให้อินฟิวชันจึงถูกเจือจางเพื่อลดปัญหาความหนืดและการรวมตัว ซึ่งไม่สะดวกสำหรับผู้ป่วยและโรงพยาบาลเนื่องจากใช้เวลานานในการให้อินฟิวชันตลอดการรักษา แต่ยังอาจส่งผลให้ผู้ป่วยมีความร่วมมือในการรับยารูปแบบฉีดน้อยลง การใช้โปรตีนในรูปผลึกในสารแขวนลอยจึงเป็นที่สนใจอย่างมาก เนื่องจากสูตรเหล่านี้มีปัญหาความหนืดน้อยกว่าและสามารถให้ในความเข้มข้นสูงกว่า อีกประเด็นสำคัญคือขนาดของผลึกโปรตีนต้องถูกควบคุมอย่างระมัดระวังเพื่อให้สารแขวนลอยสามารถผ่านเข็มฉีดหรือให้อินฟิวชันได้ง่าย นอกจากนี้ ผลึกที่เหลือซึ่งไม่ละลายระหว่างการเตรียมใหม่ต้องไม่เกินขนาดอนุภาควิกฤตที่อาจก่อให้เกิดผลข้างเคียงเนื่องจากการสะสมในหลอดเลือด โดยทั่วไปจะลดปริมาณอนุภาคที่มีขนาด>15 ไมโครเมตรให้น้อยที่สุด 

1. เลือกตัวทำละลายที่เหมาะสม ปัจจัยที่พิจารณาทั่วไป ได้แก่ ปริมาณสารละลายที่สามารถละลายได้ (ความละลายได้), ความปลอดภัยและความสะดวกในการจัดการตัวทำละลาย และผลกระทบของตัวทำละลายต่อความเสถียรและสถานะพลังงานอิสระของเปปไทด์หรือโปรตีน
2. บรรลุความอิ่มตัวเกิน ให้ความร้อนกับสารละลายเปปไทด์/โปรตีนที่ละลายได้ในตัวทำละลายหรือน้ำบัฟเฟอร์จนถึงขีดจำกัดที่อนุญาต (โดยปกติจำกัดโดยการเปลี่ยนโครงสร้าง) สารละลายจะกลายเป็นความอิ่มตัวเกิน
3. ตกผลึกผลิตภัณฑ์โดยควบคุม CPPs ลดความละลายได้โดยการทำให้เย็นลง, การเติมสารต้านตัวทำละลาย, การระเหย หรือปฏิกิริยา เมื่อความละลายได้ลดลง จะถึงจุดที่ผลึกจะเริ่มก่อตัวและเติบโต ผลึกผลิตภัณฑ์ที่บริสุทธิ์สูงควรเติบโต แม้ว่ารูปแบบที่มีพลังงานอิสระสูงอาจก่อตัวเป็นโครงสร้างทางเลือกหรือโครงสร้างที่ไม่ใช่ผลึก ซึ่งการป้องกันนี้ต้องการการควบคุม CPP อย่างรอบคอบหากเป็นไปได้จริง
4. ปล่อยให้ระบบเข้าสู่สมดุล ทำเพื่อเพิ่มผลผลิตของผลิตภัณฑ์ยาในรูปของของแข็งให้สูงสุด
5. กรองและทำให้ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์แห้ง

มีหลายวิธีที่ใช้ในการเจริญเติบโตของผลึกโปรตีน; วิธีที่พบบ่อยที่สุดคือการแพร่กระจายไอและไมโครบัทช์ วิธีแรกมีสองรูปแบบ คือ hanging drop และ sitting drop ซึ่งทั้งสองวิธีทำงานในลักษณะเดียวกัน ในระบบปิดหยดสารละลายที่มีโปรตีน น้ำบัฟเฟอร์ และสารตกตะกอนจะเข้าสู่สมดุลกับถังเก็บที่มีความเข้มข้นของสารละลายสูงกว่าแต่ไม่มีโปรตีน น้ำจากหยดที่มีโปรตีนจะระเหยและถูกดึงดูดไปยังสารละลายที่มีความเข้มข้นสูงกว่าในถังเก็บ เมื่อความเข้มข้นของสารละลายในหยดเพิ่มขึ้น โปรตีนจะเริ่มตกผลึก ในวิธีไมโครบัทช์ โปรตีนและสารเคมีอื่น ๆ จะถูกใส่และเก็บไว้ใต้ชั้นบาง ๆ ของน้ำมันแร่ที่ป้องกันการแพร่กระจายน้ำ ไมโครบัทช์เป็นเหมือนเครื่องปฏิกรณ์ขนาดเล็กที่มีส่วนผสมทั้งหมดในความเข้มข้นที่ถูกต้องและเสถียรเพื่อให้เกิดการตกผลึก

เนื่องจากการหาชุดสารเคมี พารามิเตอร์ และเงื่อนไขที่เหมาะสมสำหรับการตกผลึกโปรตีนนั้นมักเป็นการทดลองจริง วิธีที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการตกผลึกโปรตีนที่ประสบความสำเร็จคือการใช้ช่วงของเงื่อนไขทดลองที่หลากหลายซึ่งอิงจากประสบการณ์ก่อนหน้า วิธีที่ง่ายที่สุดคือการใช้ชุดทดสอบการคัดกรองผลึกโปรตีนที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ สารตกตะกอน ฯลฯ บรรจุในแผ่นหลายหลุม วิธี hanging drop vapor diffusion จะถูกใช้ในการเจริญเติบโตของผลึกด้วยชุดนี้ เมื่อจำเป็นต้องคัดกรองในระดับใหญ่ จะมีระบบ throughput สูงที่อัตโนมัติวิธีไมโครบัทช์ ช่วยประหยัดเวลาและลดความน่าเบื่อพร้อมทั้งลดปริมาณโปรตีนบริสุทธิ์ที่ต้องใช้ สำหรับการตกผลึกโปรตีนในระดับใหญ่ที่ใช้ในอุตสาหกรรมยาและอุตสาหกรรม ข้อมูลจากการทดลองคัดกรองจะเป็นพื้นฐานสำหรับการประยุกต์ใช้ในระบบเครื่องปฏิกรณ์อัตโนมัติขนาดใหญ่ที่มีการตรวจสอบ PAT แบบเรียลไทม์ในสถานที่

เพื่อสนับสนุนการพัฒนากระบวนการและการผลิต ขั้นตอนเริ่มต้นที่สำคัญที่สุดในการตกผลึกโปรตีนให้สำเร็จคือการมั่นใจว่ามีโปรตีนบริสุทธิ์สูงและได้รับการวิเคราะห์อย่างดีเพียงพอ นอกจากโปรตีนจะต้องบริสุทธิ์ (เช่น ปราศจากสารปนเปื้อน เช่น สิ่งเจือปนจากเมทริกซ์การหมัก) โปรตีนควรเป็นเนื้อเดียวกันและเสถียร (หรือได้รับการทำให้เสถียร) ในสารละลายโดยมี:

• การรวมตัวกันน้อยที่สุด (รูป A)
• โครงสร้างทุติยภูมิ ตติยภูมิ และควอเทอร์นารีที่ถูกต้อง (รูป B)
• การดัดแปลงใด ๆ ของสารเชื่อมต่อหรือสารพันธุวิศวกรรม (รูป C)

นอกจากนี้ สารเคมีและตัวทำละลายทั้งหมดที่ใช้ในกระบวนการตกผลึกโปรตีนต้องปราศจากสารปนเปื้อน เนื่องจากสิ่งเหล่านี้อาจมีผลกระทบอย่างมากต่อการก่อตัวของนิวเคลียส

คล้ายกับการตกผลึกโมเลกุลขนาดเล็ก โปรตีนจะตกผลึกจากสารละลายที่อิ่มตัวเกิน สำหรับโมเลกุลขนาดเล็กที่ก่อตัวเป็นโครงผลึกที่แข็งแรง การควบคุมอุณหภูมิเป็นวิธีหลักในการบรรลุความอิ่มตัวเกิน ซึ่งมีประโยชน์สำหรับโปรตีนด้วย อย่างไรก็ตาม ช่วงอุณหภูมิที่ลดลงจะได้รับอนุญาตเนื่องจากผลึกโปรตีนมักมีตัวทำละลายเป็นส่วนหนึ่งของโครงสร้างผลึก มักไวต่ออุณหภูมิ และมีแนวโน้มที่จะเปลี่ยนโครงสร้างและรวมตัวกัน

โมเลกุลขนาดเล็กมีอิสระในการจัดวางเชิงสเตอริโอที่น้อยกว่าอย่างมีนัยสำคัญและตกผลึกได้ง่ายกว่า เปปไทด์โมเลกุลใหญ่มีปฏิสัมพันธ์ภายในมากขึ้น เช่น กรด เบส ขั้ว และไม่ขั้ว รวมถึงแรงผลักดันที่ต่อต้านการตกผลึกที่เป็นระเบียบ ปรากฏการณ์นี้จะรุนแรงขึ้นสำหรับโปรตีนที่ใหญ่กว่า เปปไทด์ที่เข้ากันได้กับการตกผลึกส่วนใหญ่ยังมีพันธะไดซัลไฟด์จำนวนมากซึ่งสำคัญต่อการตรึงรูปแบบโครงสร้าง ความไม่เป็นระเบียบภายในโมเลกุลหรือความแปรปรวนในโครงสร้างเป็นคุณสมบัติสำคัญที่กำหนดว่าเปปไทด์หรือโปรตีนจะตกผลึกได้หรือจะตกตะกอนแทน แม้โมเลกุลจะมีคุณสมบัติที่เหมาะสมกับการตกผลึก แต่ยังมีพารามิเตอร์กระบวนการหลายอย่างที่มีผลต่อความเป็นไปได้ทางการค้าและต้องได้รับการวิเคราะห์

นอกจากอุณหภูมิ ยังมีปัจจัยอื่น ๆ ที่ส่งผลและช่วยในการตกผลึกโปรตีนผ่านความอิ่มตัวเกิน เช่น การปรับค่า pH และความเข้มข้นของไอออนในสารละลาย การเติมเกลือและสารตกตะกอน เช่น PEG เพื่อช่วยลดความละลายของโปรตีน ชนิดของลิแกนด์ที่มีอยู่ เป็นต้น สิ่งสำคัญคือการทำให้สารละลายมีความอิ่มตัวเกินในสภาพแวดล้อมที่ไม่รบกวนลักษณะปกติของโปรตีน ซึ่งแสดงถึงความสำคัญของการหาชุดตัวแปรและเงื่อนไขที่ทำให้ได้ผลึกที่มีรูปร่าง ความบริสุทธิ์ และอัตราการเจริญเติบโตที่เหมาะสม

การตกผลึกของโปรตีนดำเนินไปผ่านกลไกที่พึ่งพาอาศัยกันหลายขั้นตอน:

1. การก่อตัวของเมล็ดผลึก
2. การเจริญเติบโต
3. การเกิดน้ำมันแยกตัวในกระบวนการตกผลึก
4. การรวมตัวกัน
5. การแตกหัก
6. การหว่านเมล็ดผลึก
7. เคมีของโพลีมอร์ฟิซึม

กลไกเหล่านี้ซึ่งมักถูกซ่อนเร้นจากนักวิทยาศาสตร์ มีบทบาทสำคัญในการกำหนดผลลัพธ์ของกระบวนการตกผลึก

การพัฒนาและการขยายขนาดของกระบวนการตกผลึกสำหรับยาที่มีพื้นฐานจากโปรตีนต้องการความเข้าใจอย่างลึกซึ้งเกี่ยวกับตัวแปรและเงื่อนไขที่มีผลต่อกระบวนการตกผลึก เช่นเดียวกับการตกผลึกอื่น ๆ การบรรลุรูปแบบผลึก รูปร่าง ขนาดอนุภาค และการกระจายขนาดที่ต้องการจำเป็นต้องมีการควบคุมอย่างรอบคอบเพื่อให้ได้คุณภาพผลิตภัณฑ์ที่สม่ำเสมอ ความแปรผันใด ๆ ใน CQAs ของสารแขวนลอยผลึกโปรตีนจะส่งผลโดยตรงต่อประสิทธิภาพในการรักษา เนื่องจากผลึกโปรตีนมีความไวสูงต่อสภาพแวดล้อมการเจริญเติบโตและสามารถเสียหายได้ง่ายจากอุณหภูมิที่สูงเกินไป การสูญเสียตัวทำละลายและความเครียดภายนอกอื่น ๆ หรือแม้แต่กระบวนการเก็บตัวอย่าง จึงเป็นที่ต้องการที่จะวัด CPPs และคุณภาพผลิตภัณฑ์ในสถานที่ หรือกล่าวคือ โดยไม่ต้องนำผลึกออกจากสภาพแวดล้อมของสารละลาย

• EasyMax และ Optimax เป็น เครื่องปฏิกรณ์เคมีอัตโนมัติ ที่ช่วยให้การควบคุม ปรับแต่ง และบันทึกพารามิเตอร์ต่าง ๆ อย่างแม่นยำ รวมถึงอุณหภูมิ ค่า pH ความนำไฟฟ้า อัตราการกวน และการจ่ายบัฟเฟอร์และสารเติมแต่ง ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการพัฒนาและขยายขนาดของกระบวนการตกผลึกโปรตีนให้ประสบความสำเร็จ
• เครื่องมือเทคโนโลยีวิเคราะห์ในสถานที่ที่ช่วยในการติดตาม ตรวจสอบปัญหา และแก้ไขความเบี่ยงเบนของกระบวนการก็มีประโยชน์เช่นกัน
  • สเปกโตรสโกปีแรมานในสถานที่ และ สเปกโตรสโกปี FTIR ติดตามความเข้มข้นของสารรีเอเจนต์ ตรวจสอบการเจริญเติบโตของโครงสร้างผลึก และวัดความเข้มข้นของสารละลายที่มีความอิ่มตัวเกิน
  • เทคโนโลยี ParticleTrack (พร้อม FBRM) ติดตามการเปลี่ยนแปลงของขนาดผลึกและการกระจายขนาดแบบเรียลไทม์ในขณะที่กระบวนการตกผลึกดำเนินไป
  • EasyViewer ช่วยให้สามารถมองเห็นและวิเคราะห์ภาพของกระบวนการตกผลึกในขณะที่ดำเนินไป

เมื่อใช้เครื่องปฏิกรณ์ห้องปฏิบัติการอัตโนมัติร่วมกับเครื่องมือวิเคราะห์ในสถานที่แบบเรียลไทม์ ผลกระทบของพารามิเตอร์กระบวนการต่อกลไกการตกผลึก เช่น การรวมตัว การเจริญเติบโต การเกาะกลุ่ม การแตกหัก และการเปลี่ยนรูปร่าง สามารถระบุได้ การควบคุมกระบวนการตกผลึกอย่างแม่นยำร่วมกับการติดตามความก้าวหน้าของการก่อตัวของผลึกอย่างต่อเนื่องและในสถานที่ ช่วยให้การเพิ่มประสิทธิภาพและการขยายขนาดเป็นไปตามข้อมูลและหลักฐานที่ชัดเจน

EasyMax automated lab reactor เป็นสถานีทำงานครบวงจรสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพพารามิเตอร์ในการตกผลึกโปรตีน เพื่อสนับสนุนการออกแบบและดำเนินการพัฒนาและขยายขนาด ระบบอัตโนมัตินี้ช่วยให้ควบคุมพารามิเตอร์กระบวนการได้อย่างแม่นยำ

• จัดการ CPPs รวมถึงอัตราการจ่าย อุณหภูมิ การกวน ค่า pH และความนำไฟฟ้า
• ผสานรวมได้ง่ายกับการวิเคราะห์ในสถานที่สำหรับการตกผลึก เช่น ReactIR (FTIR), ReactRaman (แรมาน), ParticleTrack (FBRM) และ EasyViewer (การวิเคราะห์ภาพในสถานที่)
• ซอฟต์แวร์ iC ช่วยให้การดำเนินการและควบคุมการทดลองทั้งหมดและอุปกรณ์เสริมเป็นไปโดยอัตโนมัติ รวมถึงการจับข้อมูลและบันทึกอย่างครบถ้วน

ReactIR ใช้สเปกโตรสโกปีอินฟราเรดกลางในการวัดเฟสสารละลายในงานศึกษาการตกผลึก การวัดด้วย ReactIR ไม่ได้รับผลกระทบจากของแข็งแขวนลอย ฟองอากาศ หรือมวลอนุภาคอื่น ๆ

• ติดตามสารละลายตกผลึกแต่ละชนิดในสถานที่และแบบเรียลไทม์
• วัดความเข้มข้นของสารละลายเพื่อสนับสนุน งานศึกษาความอิ่มตัวเกิน
• ให้ข้อมูลวิเคราะห์ที่นำไปใช้ได้จริงสำหรับการตัดสินใจและควบคุมแบบเรียลไทม์

ReactRaman ใช้สเปกโตรสโกปีแรมานเพื่อวิเคราะห์โมเลกุลของอนุภาคในสารละลาย

• ติดตามการเจริญเติบโตของผลึก โครงสร้าง และรูปร่างอย่างไม่ทำลาย ในสถานที่ และแบบเรียลไทม์
• กำหนดผลกระทบของพารามิเตอร์และเพิ่มประสิทธิภาพเงื่อนไขและตัวแปรการตกผลึกเพื่อบรรลุวัตถุประสงค์ด้านคุณภาพ

ParticleTrack ใช้เทคโนโลยี Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) และเป็นอุปกรณ์ตรวจวัดแบบโพรบที่สอดเข้าไปในภาชนะโดยตรงเพื่อเฝ้าติดตามการเปลี่ยนแปลงของขนาดและจำนวนอนุภาคแบบเรียลไทม์ ParticleTrack ใช้วัดการแจกแจงความยาวเชือก (Chord Length Distribution) เพื่อให้ได้การแจกแจงขนาดผลึก (Crystal Size Distribution, CSD)

• เฝ้าติดตามผลึกโปรตีนอย่างต่อเนื่อง ขณะที่มีการเปลี่ยนแปลงเงื่อนไขการทดลอง
• ติดตามการเจริญเติบโตแบบแบตช์หรือแบบต่อเนื่องในระหว่างการตกผลึกแบบเรียลไทม์โดยไม่ต้องนำตัวอย่างออก
• ลักษณะเงื่อนไขที่มีผลต่อการก่อตัวของนิวเคลียส การรวมตัว รูปแบบผลึกหลายชนิด และคุณสมบัติอื่น ๆ ของระบบ

EasyViewer เป็นอุปกรณ์ตรวจวัดแบบโพรบที่สอดเข้าไปในภาชนะโดยตรงเพื่อจับภาพระบบอนุภาค EasyViewer ทำการวิเคราะห์ภาพและวัดจำนวนอนุภาค การแจกแจงขนาด และรูปร่างจากภาพแบบอินไลน์ที่มีการจับภาพตามเวลาของกระบวนการ ทำให้สามารถติดตามประชากรอนุภาคตามเวลาได้

• เฝ้าติดตามผลึกโปรตีนอย่างต่อเนื่อง ขณะที่มีการเปลี่ยนแปลงเงื่อนไขการทดลอง
• ติดตามการเจริญเติบโตแบบแบตช์หรือแบบต่อเนื่องในระหว่างการตกผลึกแบบเรียลไทม์โดยไม่ต้องนำตัวอย่างออก
• มองเห็นพารามิเตอร์การตกผลึกที่มีผลต่อการก่อตัวของนิวเคลียส การรวมตัว รูปแบบผลึกหลายชนิด และคุณสมบัติอื่น ๆ ของระบบแบบเรียลไทม์

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). การเฝ้าติดตามการตกผลึกชีวเภสัชภัณฑ์แบบเรียลไทม์: การแจกแจงความยาวเชือกสู่การแจกแจงขนาดผลึกสำหรับไลโซไซม์, rHu อินซูลิน และวิตามิน B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

ผู้เขียนรายงานความสำเร็จในการพัฒนาวิธีการที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเฝ้าติดตามการตกผลึกชีวเภสัชภัณฑ์แบบเรียลไทม์ วิธีการนี้ใช้ ParticleTrack เพื่อวัด CLD สำหรับโมเลกุลชีวเภสัชภัณฑ์ชุดหนึ่งภายใต้สภาวะนิ่งและไดนามิก จากนั้นใช้การสร้างแบบจำลองทางคณิตศาสตร์เพื่อแปลง CLD เป็น CSD โมเลกุลชีวภาพที่ศึกษามีรูปผลึกแตกต่างกันซึ่งขึ้นอยู่กับเงื่อนไขการทดลองของการตกผลึก ไลโซไซม์สามารถสร้างผลึกทรงสี่เหลี่ยมมุมฉากและทรงเข็ม rHu อินซูลินสร้างผลึกทรงรอมโบเฮดรัล และ B12 สร้างผลึกทรงหลายหน้า

ผู้เขียนพัฒนารูปแบบเพื่อกำหนด CSD สำหรับผลึกทรงสี่เหลี่ยมมุมฉากที่มีอัตราส่วนมิติด้านต่ำ ผลึกทรงรอมโบเฮดรัล ผลึกทรงหลายหน้า และผลึกทรงเข็มที่มีอัตราส่วนมิติด้านสูง ผู้เขียนใช้รูปแบบสามแบบที่แตกต่างกันสำหรับการกำหนดการแจกแจงขนาดผลึก:

• รูปแบบที่พัฒนาโดยกลุ่มวิจัยอื่นซึ่งสมมติว่าผลึกสามารถแทนด้วยทรงกลม (เส้นผ่านศูนย์กลางเทียบเท่าทรงกลม, SED) ซึ่งมีประสิทธิภาพสำหรับผลึกที่มีอัตราส่วนมิติต่ำ
• สำหรับผลึกที่มีอัตราส่วนมิติด้านสูง ผู้เขียนในการศึกษานี้พัฒนารูปแบบที่อิงตามความกว้าง
• สุดท้าย พวกเขาพัฒนารูปแบบที่อิงตามความยาวและต้องระบุอัตราส่วนมิติ

ผลลัพธ์จากรูปแบบที่พัฒนาสำหรับการคำนวณ CSD จากการวัด FBRM ถูกเปรียบเทียบกับการวัด CSD ที่ได้จากการวิเคราะห์ภาพ

การพยายามเฝ้าติดตามสารแขวนลอยผลึกที่ขุ่นทึบมีความท้าทาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อข้อกำหนดการผลิตเรียกร้องให้มีการแจกแจงขนาดอนุภาค (PSD) ที่แคบ สำหรับสูตรผลึกโปรตีนที่ฉีดได้ PSD สามารถส่งผลอย่างมากต่อความหนืด รวมถึงเป็นสัญญาณเตือนล่วงหน้าสำหรับการรวมตัวหรือเหตุการณ์เสื่อมสภาพอื่น ๆ ที่อาจส่งผลกระทบต่อสูตร การเฝ้าติดตามแบบ in-situ ถูกใช้ในการศึกษาการตกผลึกแบบแบตช์ขยายขนาดเพื่อบ่งชี้การก่อตัวและการเจริญเติบโตของผลึกฮิวแมนโกรทฮอร์โมน (hGH) การวิเคราะห์แบบเรียลไทม์ตรวจพบความเบี่ยงเบนจากโปรไฟล์ PSD ปกติซึ่งเกิดจากความแตกต่างในการผสมระหว่างภาชนะ ซึ่งได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ภาพแบบออฟไลน์ (IA) ต่อมา

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). กระบวนการตกผลึกต่อเนื่องในการผลิตยา: บทวิจารณ์. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). การประมาณพารามิเตอร์ของจลนพลศาสตร์การก่อตัวของนิวเคลียสขั้นต้นแบบสุ่มโดยใช้ปริพันธ์แบบสุ่มผ่านการวัดการสะท้อนแสงด้วยลำแสงโฟกัส. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). การตรวจสอบแบบเรียลไทม์ของการตกผลึกชีวเภสัชภัณฑ์: การแจกแจงความยาวเชือกไปยังการแจกแจงขนาดผลึกสำหรับไลโซไซม์, rHu อินซูลิน และวิตามิน B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). การควบคุมการตกผลึกในไลโซไซม์และการจัดเรียงตัวเองแบบซูปราโมเลกุลในสารละลายโดยใช้ของเหลวไอออนิก. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). การสร้างแบบจำลองและการควบคุมรูปร่างผลึกในการตกผลึกโปรตีนแบบต่อเนื่อง. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). การเพิ่มอัตราการผลิตผลึกและลดความหลากหลายของขนาดผลึกในการตกผลึกโปรตีนแบบต่อเนื่อง. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). ผลึกโปรตีนสำหรับการส่งมอบชีวเภสัชภัณฑ์. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301