Kryštalizácia proteínov

Kryštalizácia proteínov je proces a metóda vytvárania štruktúrovaných, usporiadaných mriežok pre komplexné makromolekuly. Proteíny sú zvyčajne amorfné ako pevné látky a náchylné na denaturáciu, zatiaľ čo proteíny existujúce v kryštalických mriežkach odolávajú denaturácii a majú väčšiu stabilitu. Proteíny môžu kryštalizovať, ak sú umiestnené v vhodnom, priaznivom prostredí. Kryštalizácia proteínov sa považuje rovnako za umenie ako vedu, vzhľadom na vysoko zložité interakcie premenných, ktoré ovplyvňujú proces kryštalizácie proteínov.

Najbežnejším dôvodom na vytváranie kryštálov proteínov je podpora výskumu štrukturálnej biológie, zvyčajne prostredníctvom röntgenovej difrakčnej kryštalografie. Výskumníci môžu vizualizovať oblasti v rámci štruktúry, ktoré umožňujú interakciu s inými molekulami, pochopením trojrozmerných štruktúr proteínov (napríklad na lepšie pochopenie, ako enzýmy, substráty a ligandy interagujú). Okrem toho kryštalizácia je efektívnym spôsobom vytvárania čistých proteínov bez kontaminácie inými proteínmi alebo cudzorodými biologickými látkami, čím ponúka alternatívny spôsob čistenia a separácie oproti preparatívnej chromatografii. 

Kryštalizácia prebieha prostredníctvom série vzájomne závislých mechanizmov, ktoré sú každý jedinečne ovplyvnené výberom parametrov procesu: nukleácia, rast, olejový výkvet, aglomerácia, lámanie, zasievanie a polymorfný prechod.

Často tieto mechanizmy prebiehajú súčasne, čo robí efektívne navrhovanie kryštalizácie výzvou. Pri absencii mechanistického pochopenia sa vedci spoliehajú na metódu pokus-omyl na úpravu parametrov procesu a optimalizáciu výťažku, čistoty a veľkosti kryštálov. Pochopením, ktoré mechanizmy prebiehajú počas kryštalizácie, môžu vedci nasadiť stratégie na dodanie kryštalického produktu s požadovanými vlastnosťami.

Proteíny sú čoraz dôležitejšie ako terapeutické lieky. Avšak výroba proteínov s potrebnou stabilitou predstavuje kľúčové výzvy, vrátane variability produktu, straty štruktúry, ktorá by znižovala účinnosť, a tvorby potenciálne nebezpečných vedľajších produktov. Kryštalizácia proteínov je metóda na výrobu čistých, stabilných pevných dávkových foriem a množstva injikovaných a infúznych terapeutík, ktoré sú spojené s proteínovými kryštálmi. V minulosti bola kryštalizácia proteínov laboratórnou činnosťou na podporu röntgenovej kryštalografie, ale vzhľadom na exponenciálny rast terapeutík založených na proteínoch je škálovanie kryštalizácie proteínov na výrobnú úroveň čoraz dôležitejšie a predmetom intenzívneho záujmu.

Škálovanie kryštalizácie proteínov je v zásade analogické kryštalizácii malých molekúl vo svojich požiadavkách na optimalizáciu Kritických Procesných Parametrov (CPP) na laboratórnej úrovni na dosiahnutie Kritických Kvalitatívnych Atributov (CQA) kryštalizovanej liekovej látky na komerčných úrovniach. Holistická platforma pre vývoj a škálovanie procesu kryštalizácie proteínov zvyčajne zahŕňa:

• Charakterizáciu častíc systému in-situ
• Spektroskopické monitorovanie a charakterizáciu polymorfov
• Optimalizáciu postupu a stratégií spätnoväzobnej kontroly prostredníctvom integrovaných modulov a senzorov

Sú významné farmaceutické aplikácie spojené s kryštalizáciou proteínov: medicínska chémia prostredníctvom štrukturálnej biológie, vývoj liekov na báze proteínov, škálovanie, separácia a čistenie, formulácia a podávanie liekov.

• Medicínska chémia prostredníctvom štrukturálnej biológie. Pokroky v technikách kryštalizácie proteínov a zlepšená röntgenová kryštalografia viedli k odhaleniu desaťtisícov trojrozmerných štruktúr proteínov. Pochopenie interakcií liek-receptor do veľkých detailov je možné určením štruktúry týchto komplexných makromolekúl a vizualizáciou väzobných miest. Tieto informácie umožňujú lepšie pochopenie na molekulárnej úrovni inhibítorov proteínov, alosterických aktivátorov, kofaktorov a dokonca katalytických miest enzýmov alebo „aktívnych miest“ – čo vedie k lepším liekom s vyššou účinnosťou. Klasickým príkladom významu pochopenia štruktúry proteín-inhibítor prostredníctvom kryštalografie sú veľké pokroky vo vývoji HIV proteáz.
• Vývoj, škálovanie, separácia a čistenie terapeutík na báze proteínov. Okrem pestovania jednotlivých kryštálov proteínov pre röntgenovú kryštalografiu farmaceutický priemysel zvýšil úsilie vo vývoji terapeutík založených na proteínových kryštáloch. Cieľom týchto aplikácií je vyvinúť a škálovať na veľké množstvá čistých, stabilných proteínových kryštálov, ktoré majú správnu veľkosť častíc a dobre kontrolované rozdelenie veľkosti častíc. V porovnaní s preparatívnou chromatografiou má kryštalizácia proteínov potenciál byť nákladovo efektívnou alternatívou na separáciu a čistenie makromolekúl a na izoláciu chirálnych molekúl. Nástroje na škálovanie kryštalizácie proteínov sú analogické tým, ktoré sa používajú na škálovanie chemických reakcií s potrebou pochopenia CPP a ich vplyvu na CQA.
• Formulácia a podávanie liekov. Proteínové terapeutiká sa podávajú ako roztoky a môžu byť aplikované injekčne alebo infúzne. Pretože je potrebné dodať vysoké množstvá proteínu, infúzne proteínové roztoky sa riedia, aby sa predišlo problémom s viskozitou a agregáciou. To je menej pohodlné pre pacienta a nemocnicu kvôli času potrebnému na infúziu celej liečby, ale môže to tiež prispieť k fenoménu nižšej spolupráce pacienta s akoukoľvek formou parenterálneho podávania. Použitie kryštalickej formy proteínov v suspenzii je veľmi zaujímavé, pretože tieto formulácie majú menej problémov s viskozitou a môžu byť podávané vo vyšších koncentráciách. Ďalším kľúčovým bodom je, že veľkosť proteínových kryštálov musí byť starostlivo kontrolovaná, aby sa zabezpečilo, že suspenzia môže ľahko prejsť cez injekčnú alebo infúznu ihlu. Rovnako dôležité je, že akékoľvek zvyškové kryštály, ktoré sa nerozpustia počas rekonštitúcie, nesmú prekročiť kritické veľkosti častíc, ktoré by mohli spôsobiť nepriaznivé vedľajšie účinky v dôsledku kapilárnej akumulácie v cievach, čo všeobecne minimalizuje významné množstvá častíc >15 µm. 

1. Vyberte vhodné rozpúšťadlo. Bežné úvahy zahŕňajú, koľko rozpustenej látky sa môže rozpustiť (rozpustnosť), ako praktické je manipulovať s rozpúšťadlom (bezpečnosť) a ako rozpúšťadlo ovplyvní stabilitu a voľné energetické stavy peptidu alebo proteínu.
2. Dosiahnite presýtenie. Zohrievajte rozpustnú peptidovú/proteínovú liečivú látku v rozpúšťadle alebo puferi na maximálnu povolenú toleranciu (zvyčajne obmedzenú denaturáciou). Roztok sa stane presýteným.
3. Kryštalizujte produkt riadením CPP. Znížte rozpustnosť ochladením, pridaním anti-rozpúšťadla, odparovaním alebo reakciou. Keď sa rozpustnosť zníži, dosiahne sa bod, kde sa kryštály začnú nukleovať a následne rásť. Mali by rásť vysoko čisté kryštály produktu, hoci motívy s vysokou voľnou energiou môžu vytvárať alternatívne alebo ne-kryštalické štruktúry; zabránenie tomu vyžaduje starostlivé riadenie CPP, ak je to vôbec praktické.
4. Nechajte systém dosiahnuť rovnováhu. Toto sa robí na maximalizáciu výťažku pevného liečivého produktu.
5. Filtrovať a vysušiť purifikovaný produkt.

Existuje niekoľko metód používaných na rast proteínových kryštálov; medzi najbežnejšie patria difúzia pary a mikrobatch. Prvá metóda má dve varianty, označované ako visiaci kvapka a sediaci kvapka, a obe fungujú v zásade rovnako. V uzavretom systéme sa kvapka roztoku obsahujúca proteín, pufer a precipitát vyrovnáva s rezervoárom obsahujúcim vyššie koncentrácie rozpustenej látky toho istého roztoku, ale bez proteínu. Voda z kvapky obsahujúcej proteín sa odparuje a je priťahovaná k roztoku s vyššou koncentráciou v rezervoári. Ako sa koncentrácia rozpustených látok v kvapke zvyšuje, proteín začína kryštalizovať. V mikrobatch metóde sú proteíny a ostatné činidlá zavedené a udržiavané pod tenkou vrstvou minerálneho oleja, ktorý eliminuje difúziu vody. Mikrobatch je v podstate malý reaktor obsahujúci všetky potrebné ingrediencie v správnych, stabilných koncentráciách, ktoré umožňujú kryštalizáciu.

Keďže nájdenie správnej sady činidiel, parametrov a podmienok potrebných na kryštalizáciu proteínu je často empirické, najpraktickejším spôsobom úspešnej kryštalizácie proteínov je použitie rôznych experimentálnych podmienok založených na predchádzajúcich skúsenostiach. Najjednoduchší spôsob, ako to dosiahnuť, je použiť komerčne dostupné súpravy na skríning proteínových kryštálov, ktoré obsahujú predpripravené roztoky s puframi, precipitátmi atď. obsiahnuté v viacjamkových platniach. Metóda visiacej kvapky s difúziou pary sa aplikuje na rast kryštálov s týmito súpravami. Keď je potrebný veľkoplošný skríning, sú k dispozícii systémy s vysokou priepustnosťou, ktoré automatizujú mikrobatch metódu, šetria čas a únavu a zároveň minimalizujú množstvo purifikovaného proteínu potrebného. Pre veľkoplošné kryštalizácie proteínov potrebné pre farmaceutické alebo priemyselné aplikácie tvoria informácie získané v skríningových experimentoch základ pre aplikáciu vo väčších automatizovaných reaktorových systémoch charakterizovaných in-situ, v reálnom čase PAT. 

Na podporu vývoja procesov a výroby je jedným z najdôležitejších počiatočných krokov úspešnej kryštalizácie proteínov zabezpečiť dostatočnú zásobu vysoko purifikovaného a dobre charakterizovaného proteínu. Okrem toho, že proteín je čistý (t.j. bez kontaminantov, ako sú nečistoty z fermentačných matríc), mal by byť proteín homogénny a stabilný (alebo stabilizovaný) v roztoku s:

• Minimálnou agregáciou (Obrázok A)
• Správnou sekundárnou, terciárnou a kvartérnou štruktúrou (Obrázok B)
• Akýmikoľvek konjugovanými alebo rekombinantnými modifikáciami (Obrázok C)

Okrem toho všetky činidlá a rozpúšťadlá používané v procese kryštalizácie proteínov musia byť bez kontaminantov, pretože tieto môžu mať významný vplyv na nukleáciu.

Podobne ako pri kryštalizácii malých molekúl, proteíny kryštalizujú z presýtených roztokov. Pre malé molekuly, ktoré tvoria robustné kryštalické mriežky, je manipulácia s teplotou primárnym spôsobom dosiahnutia presýtenia; toto je užitočné aj pre proteíny. Avšak povolený rozsah teplôt je znížený, pretože proteínové kryštály zvyčajne obsahujú rozpúšťadlo ako súčasť kryštalickej štruktúry, sú často citlivé na teplotu a náchylné na denaturáciu a agregáciu.

Malé molekuly majú výrazne menej stupňov stereoskopickej slobody a preto sa kryštalizujú oveľa ľahšie. Veľké molekuly peptidov majú oveľa viac vnútorných kyslých, zásaditých, polárnych, nepolárnych interakcií a odpudivých síl, ktoré odolávajú usporiadanej kryštalizácii, čo je jav zosilnený u ešte väčších proteínov. Väčšina peptidov kompatibilných s kryštalizáciou tiež obsahuje významný počet disulfidových väzieb, ktoré sú kľúčové pre immobilizáciu štrukturálnych motívov. Rozsah intramolekulárneho neporiadku alebo možnej variácie v štruktúre je dôležitým atribútom určujúcim, či sa peptid alebo proteín môže vôbec kryštalizovať namiesto precipitácie. Aj keď je molekula predisponovaná atribútmi vhodnými na kryštalizáciu, existuje množstvo ovplyvňujúcich procesných parametrov, ktoré ovplyvňujú komerčnú životaschopnosť procesu a musia byť charakterizované.

Okrem teploty existuje množstvo ďalších faktorov, ktoré ovplyvňujú/pomáhajú kryštalizácii proteínov prostredníctvom presýtenia, vrátane úpravy pH a iónovej sily roztoku, pridávania solí a precipitátov ako PEG na zníženie rozpustnosti proteínu, typu prítomného ligandu atď. Kľúčom je presýtiť roztok v prostredí, ktoré nevyrušuje normálnu charakteristiku proteínu. To naznačuje dôležitosť nájdenia sady premenných a podmienok, ktoré vedú ku kryštálom so správnou morfológiou, čistotou a prijateľnou rýchlosťou rastu.

Kryštalizácia proteínov prebieha prostredníctvom série vzájomne závislých mechanizmov:

1. Nukleácia
2. Rast
3. Vytláčanie oleja pri kryštalizácii
4. Aglomerácia
5. Rozpad
6. Výsev
7. Chémia polymorfizmu

Tieto mechanizmy, ktoré sú často skryté pred vedcami, zohrávajú dominantnú úlohu pri definovaní výsledku procesu kryštalizácie.

Vývoj a zväčšovanie rozsahu kryštalizácie proteínových terapeutík vyžaduje dôkladné pochopenie premenných a podmienok, ktoré ovplyvňujú proces kryštalizácie. Rovnako ako pri iných kryštalizáciách, dosiahnutie požadovanej formy kryštálov, tvaru, veľkosti častíc a distribúcie veľkosti vyžaduje starostlivú kontrolu na zabezpečenie konzistentnej kvality produktu. Akákoľvek variácia v CQA suspenzií proteínových kryštálov priamo ovplyvní terapeutickú účinnosť. Pretože proteínové kryštály sú veľmi citlivé na prostredie rastu a môžu byť ľahko poškodené nadmerným teplom, stratou rozpúšťadla a inými vonkajšími stresmi alebo dokonca procesom odberu vzoriek, je žiaduce merať CPP a kvalitu produktu in situ, t.j. bez vybratia kryštálov z ich roztokového prostredia.

• Automatizované chemické reaktory EasyMax a OptiMax umožňujú presnú kontrolu, nastavenie a zaznamenávanie parametrov vrátane teploty, pH, vodivosti, rýchlosti miešania a dávkovania pufrov a excipientov, ktoré sú kriticky dôležité pre úspešný vývoj a zväčšovanie rozsahu kryštalizácie proteínov
• Analytické nástroje in situ, ktoré pomáhajú monitorovať, riešiť problémy a korigovať odchýlky procesu, sú tiež užitočné
  • Ramanova spektroskopia in situ a FTIR spektroskopia sledujú koncentrácie činidiel, monitorujú rast štruktúry kryštálov a tiež merajú koncentráciu presýtených roztokov
  • Technológia ParticleTrack (s FBRM) monitoruje zmenu veľkosti kryštálov a distribúcie veľkosti v reálnom čase ako kľúčové segmenty procesu kryštalizácie
  • EasyViewer umožňuje vizualizáciu a analýzu obrazu procesu kryštalizácie počas jeho priebehu

Keď sa automatizované laboratórne reaktory používajú v spojení s analyzátormi in situ v reálnom čase, možno identifikovať vplyv parametrov procesu na mechanizmy kryštalizácie, ako sú agregácia, rast, aglomerácia, rozpad a zmena tvaru. Presná kontrola procesu kryštalizácie v spojení s kontinuálnym monitorovaním tvorby kryštálov in situ umožňuje optimalizáciu a zväčšovanie rozsahu založené na faktoch a dátach.

Automatizovaný laboratórny reaktor EasyMax je kompletné pracovisko na optimalizáciu parametrov pri kryštalizácii proteínov na podporu vývoja a návrhu zväčšovania rozsahu a jeho realizácie. Tento plne automatizovaný systém umožňuje presnú kontrolu nad parametrami procesu.

• Spravujte CPP vrátane rýchlosti dávkovania, teploty, miešania, pH a vodivosti
• Jednoducho sa integruje s analytikou in situ pre kryštalizáciu vrátane ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FFE) a EasyViewer (analýza obrazu in situ)
• Softvér iC umožňuje automatizované vykonávanie a kontrolu všetkých experimentov a periférnych zariadení, ako aj úplné zachytávanie dát a vedenie záznamov

ReactIR používa strednú infračervenú spektroskopiu na meranie fázy roztoku pri štúdiách kryštalizácie. Merania ReactIR nie sú ovplyvnené suspendovanými pevnými látkami, bublinami ani inou časticovou hmotou.

• Sledujte jednotlivé kryštalizačné látky in situ a v reálnom čase.
• Merajte koncentrácie roztokov na podporu štúdií presýtenia
• Poskytujte použiteľnú dátovú analytiku pre rozhodovanie a kontrolu v reálnom čase

ReactRaman používa Ramanovu spektroskopiu na molekulárnu analýzu častíc v roztoku

• Sledujte rast kryštálov, štruktúru a morfológiu neinvazívne, in situ a v reálnom čase
• Určujte vplyv parametrov a optimalizujte podmienky a premenné kryštalizácie na dosiahnutie kvalitatívnych cieľov

ParticleTrack využíva technológiu Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) a je optický prístroj založený na sonde, ktorý sa vkladá priamo do nádoby na sledovanie zmien veľkosti a počtu častíc v reálnom čase. ParticleTrack používa merania distribúcie dĺžky chord na získanie distribúcie veľkosti kryštálov (CSD).

• Proteínové kryštály sú nepretržite monitorované počas menenia experimentálnych podmienok
• Sledujte rast dávkový alebo kontinuálny počas kryštalizácie v reálnom čase bez potreby odberu vzorky
• Charakterizujte podmienky ovplyvňujúce nukleáciu, agregáciu, polymorfizmus a ďalšie atribúty systému

EasyViewer je prístroj založený na sonde, ktorý sa vkladá priamo do nádoby na zachytenie obrazov systémov častíc. EasyViewer vykonáva analýzu obrazu a meria počet častíc, distribúciu veľkosti a morfológiu z časovo rozlíšených inline obrazov procesu, čo umožňuje sledovať populácie v priebehu času.

• Proteínové kryštály sú nepretržite monitorované počas menenia experimentálnych podmienok
• Sledujte rast dávkový alebo kontinuálny počas kryštalizácie v reálnom čase bez potreby odberu vzorky
• Vizualizujte parametre kryštalizácie, ktoré ovplyvňujú nukleáciu, agregáciu, polymorfizmus a ďalšie atribúty systému v reálnom čase

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Autori uviedli úspech pri vývoji efektívneho prístupu k monitorovaniu kryštalizácie biofarmaceutík v reálnom čase. Tento postup využíva ParticleTrack na meranie CLD pre sériu biofarmaceutických molekúl za statických aj dynamických podmienok a následne aplikuje matematické modelovanie na konverziu CLD na CSD. Skúmané biomolekuly majú rôzne kryštalické formy, ktoré závisia od experimentálnych podmienok kryštalizácie. Lyzozým môže vytvárať tetragonálne a ihličkovité kryštály, rHu inzulín tvorí rombohedrálne kryštály a B12 tvorí polyhedrálne kryštály.

Autori vyvinuli modely na určenie CSD pre kryštály s nízkym pomerom strán tetragonálne, rombohedrálne, polyhedrálne a kryštály s vysokým pomerom strán ihličkového tvaru. Autori použili tri rôzne modely na určenie distribúcie veľkosti kryštálov:

• Model vyvinutý inou výskumnou skupinou, ktorý predpokladal, že kryštály môžu byť reprezentované ako gule (sférický ekvivalentný priemer, SED), bol účinný pre kryštály s nízkym pomerom strán
• Pre kryštály s vysokým pomerom strán autori v tejto štúdii vyvinuli model založený na šírke
• Nakoniec vyvinuli model založený na dĺžke, ktorý vyžadoval špecifikáciu pomeru strán

Výsledky modelov vyvinutých na výpočet CSD z meraní FBRM boli následne porovnané s meraniami CSD získanými analýzou obrazu.

Sledovanie nepriehľadnej kryštalickej suspenzie predstavuje výzvy, najmä keď výrobné špecifikácie vyžadujú úzku distribúciu veľkosti častíc (PSD). Pre injikovateľné formulácie proteínových kryštálov môže PSD výrazne ovplyvniť viskozitu a zároveň slúžiť ako skoré varovanie pred agregáciou alebo inými degradačnými udalosťami, ktoré môžu potenciálne ohroziť formuláciu. In-situ monitorovanie bolo použité v štúdii zväčšenia dávkovej kryštalizácie na charakterizáciu tvorby a rastu kryštálov ľudského rastového hormónu (hGH). Analýza v reálnom čase odhalila odchýlku od obvyklého profilu PSD spôsobenú rozdielmi v miešaní medzi nádobami. Toto bolo potvrdené následnou offline analýzou obrazu (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Kontinuálne kryštalizačné procesy vo farmaceutickej výrobe: prehľad. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Odhad parametrov stochastickej kinetiky primárnej nukleácie pomocou stochastických integrálov s využitím meraní odrazu z fokusovaného lúča. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitorovanie kryštalizácie biofarmaceutík v reálnom čase: rozdelenie dĺžky chordy na rozdelenie veľkosti kryštálov pre lyzozým, rHu inzulín a vitamín B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulácia kryštalizácie lyzozýmu a supramolekulárneho samoorganizovania v roztoku pomocou iónových kvapalín. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modelovanie a riadenie tvaru kryštálov v kontinuálnej kryštalizácii bielkovín. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Zvýšenie rýchlosti produkcie kryštálov a zníženie polydisperzity v kontinuálnej kryštalizácii bielkovín. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Bielkovinové kryštály na dodávanie biofarmaceutík. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301