Správna prax pipetovania: Lepšie výsledky vďaka školeniu a podpore

Väčšina aplikácií v oblasti biologických vied zahŕňa kritické kroky manipulácie s kvapalinami, pri ktorých pipetovaný objem priamo ovplyvňuje výsledok. Ak pipetovanie nie je konzistentné a presné, čas, peniaze a materiál môžu vyjsť nazmar. Presné pipetovanie tvorí základ reprodukovateľnej práce, ktorá je nevyhnutná na generovanie zmysluplných údajov.

Prvým krokom k zlepšeniu presnosti pipetovania je výber správneho typu pipety a správneho rozsahu objemu. Z hľadiska veľkosti vyberte pipetu s najmenším objemom, ktorá sa prispôsobí objemu, ktorý pipetujete. Ak napríklad pipetujete 2 μl a máte 5 μl pipetu a 20 μl pipetu, získate lepšiu presnosť pri použití 5 μl. 

Pozrite si túto bielu knihu o výbere pipety, aby ste pochopili, ktorá pipeta je pre kvapalinu najvhodnejšia, a ďalšie faktory jedinečné pre vašu situáciu: Výber správnej pipety

Keď budete mať správny nástroj, uveďte svoju správnu techniku pipetovania do praxe. Nastavte si plán rutinného testovania, aby ste časom maximalizovali dôveru vo svoje výsledky, a ako pri každom presnom prístroji, nezabudnite zaviesť pravidelný odborný servis a kalibračný režim.

Najjednoduchší spôsob, ako rýchlo otestovať presnosť pipety, môže byť Rainin SmartCheck. Viac informácií nájdete na mt.com/SmartCheck 

Výber správnej pipety zahŕňa vyhodnotenie vašich požiadaviek. Po prvé, aký druh vzoriek pipetujete? Sú vodné? Alebo sú viskózne, prchavé, penivé, korozívne alebo nebezpečné? Pre vodné a takmer vodné kvapaliny sú dobrou voľbou najbežnejšie pipety so vzduchovým výtlakom (nazývané aj pipety so vzduchovým vankúšom). V prípade viskóznych, prchavých a iných nezvyčajných typov kvapalín by bola lepšou voľbou pipeta s priamym posunom z hľadiska presnosti aj bezpečnosti. 

Aký objem budete pipetovať? Koľko vzoriek potrebujete na prenos z jednej nádoby do druhej? Pozrite si túto bielu knihu o výbere pipety , aby ste pochopili, ktorá pipeta funguje najlepšie v závislosti od kvapaliny a ďalších faktorov jedinečných pre vašu situáciu.

Pipetovanie najmenších možných objemov zahŕňa špecializované nástroje a techniky. Opakovacia pipeta môže byť vašou najlepšou voľbou na opakované dávkovanie objemov až do 100 nL. Ďalšia pipeta môže fungovať len na niekoľko dávok. Uistite sa, že používate najmenšiu pipetu, ktorá sa zmestí do objemu, ktorý chcete pipetovať. 

Pri veľmi malých objemoch má pipetovacia technika proporcionálne väčší vplyv na presnosť a reprodukovateľnosť. Hĺbka ponorenia, uhol pipetovania a rýchlosť nasávania sú dôležité na kontrolu. Plagát Techniky pipetovania od spoločnosti Rainin vám môže pomôcť.

Rainin NanoRep opakovane dávkuje alikvotné množstvá až do 100 nl. Viac informácií nájdete tu: mt.com/NanoRep

Najdôležitejším faktorom presného a reprodukovateľného viackanálového pipetovania je integrita tesnenia pre každý kanál pipety. To znamená, že každý hrot perfektne sedí na každom hriadeli s nulovým únikom vzduchu. Rôzni výrobcovia to dosahujú rôznymi spôsobmi, s rôznou ergonomickou ľahkosťou a úrovňou konzistencie tesnenia. Pipetové špičky systému LTS LiteTouch od spoločnosti Rainin vyžadujú najmenšiu silu na nakladanie a vysunutie z viackanálového kanála a vždy konzistentne utesňujú.

Kliknutím sem zobrazíte širokú škálu viackanálových pipiet Rainin.

Pri nasávaní držte pipetu čo najbližšie k zvislej polohe a vyhýbajte sa akémukoľvek uhlu väčšiemu ako 20° od osi Y. Ak sa pri dávkovaní dotýkate steny cieľovej nádoby, aby ste úplne vytiahli všetku tekutinu z hrotu, je v poriadku prekročiť uhol 20°.

Pipetovanie dopredu je štandardná technika pipetovania a najlepšia voľba pre vodné vzorky. V prípade viskóznych a prchavých vzoriek poskytuje reverzné pipetovanie lepšiu presnosť.

Ak chcete pipetu posúvať dopredu, zatlačte piest nadol na prvý doraz, pričom pipetu držíte mimo kvapaliny. Potom ponorte hrot 2-10 mm hlboko do kvapaliny, s ktorou pracujete – nie hlbšie. Pomaly uvoľnite piest až do úplného vysunutia, aby ste nasali celý objem kvapaliny. Ak chcete dávkovať do cieľovej nádoby, posuňte pipetu do nádoby a potom rovnomerne zatlačte piest cez prvý doraz až po druhý doraz. Keď je piest úplne stlačený, zľahka potiahnite špičku pipety po stene nádoby, aby ste sa "dotkli". To pomáha úplne vypustiť celý objem kvapaliny. Uvoľnite piest, vysuňte špičku pipety, vložte novú špičku pipety a opakujte.

Ak chcete obrátiť pipetu, zatlačte piest úplne nadol cez prvý doraz až po druhý doraz – až na doraz piestu. Potom ponorte hrot do kvapaliny a pomaly a rovnomerne uvoľnite piest na nasávanie. Presuňte sa k prijímacej nádobe a stlačte piest LEN NA PRVÝ DORAZ, aby ste vydali správny objem. V špičke pipety zostane malý zvyškový objem. Presuňte pipetu nad nádobu na vyhadzovanie a zatlačte piest na zvyšok cesty nadol až po druhý doraz, nazývaný aj doraz "vyfukovania", aby sa uvoľnila zvyšná kvapalina. 

Uvoľnite piest, vysuňte špičku pipety, vložte novú špičku pipety a opakujte.

Na pipetu mierne viskóznych kvapalín vrátane krvi možno použiť pipetu so vzduchovým výtlakom. Na dosiahnutie maximálnej presnosti použite techniku spätného pipetovania opísanú vyššie. V prípade viskóznejších kvapalín, ako je 85 % glycerol alebo Triton X-100, ponúka pipeta s priamym posunom najlepšiu presnosť a konzistenciu.

Mierne prchavé kvapaliny, ako je etanol, je možné pipetovať vzduchovou pipetou pomocou vyššie uvedenej techniky reverzného pipetovania. Pipety s priamym objemom sú však lepšou voľbou pre prchavé kvapaliny. 

Ak používate pipetu so vzduchovým výtlakom, pred pipetovaním objemu špičku pipety aspoň päťkrát prepláchnite (nasajte a dávkujte). Tým sa vyrovná vzduch vo vnútri pipety a spomalí sa rýchlosť odparovania kvapaliny. Rýchle odparovanie prchavých kvapalín rozširuje vzduch vo vnútri pipety a vytláča kvapalinu z hrotu bez toho, aby sa vyvíjal akýkoľvek tlak na piest, čo znižuje presné dodávanie objemu.

S prchavými kvapalinami, ako je acetonitril, sa vo všeobecnosti lepšie manipuluje pomocou objemovej pipety.

Áno, pipetovanie pomocou pipet so vzduchovým vytláčaním môže vytvárať aerosóly. Aerosóly môžu stúpať do vnútra pipety a kontaminovať vnútorné steny a piest. K aerosólizácii dochádza ľahšie, keď sa piest uvoľní príliš rýchlo počas nasávania, a môže sa vyskytnúť aj v opačnom smere mimo pipety pri príliš rýchlom dávkovaní. 

Aby ste minimalizovali aerosóly, odsávajte a dávkujte pomaly a rovnomerne. Používajte filtrované hroty. 

Pipety s priamym posunutím používajú špičky v štýle injekčnej striekačky, ktoré zabraňujú aerosólizácii. Pipeta s priamym objemom je najlepšou voľbou na pipetovanie nebezpečných kvapalín a akejkoľvek kvapaliny so zvýšenou viskozitou alebo prchavosťou.

Veľmi studené alebo horúce kvapaliny menia tlak vzduchu v pipetách s výtlakom vzduchu, čo vedie k nepresnému pipetovaniu. 

Pipety s priamym posunom s hrotmi v tvare striekačky, ktoré nemajú vzduchové vrecko medzi kvapalinou a piestom, nie sú ovplyvnené rôznymi teplotami kvapalín. Pipety s priamym objemom poskytujú presné výsledky s kvapalinami bez izbovej teploty.

Ak musíte pipetovať veľmi horúcu alebo studenú kvapalinu pomocou pipety so vzduchovým vytláčaním, špičku pipety vopred neoplachujte – zvyčajne je to najlepší postup na dosiahnutie najvyššej presnosti. Namiesto toho rýchlo odsajte a dávkovajte, aby ste minimalizovali vplyv teploty kvapaliny na vnútornú vzduchovú medzeru pipety.

Aby ste predišli bublinám a peneniu pri pipetovaní, neponárajte špičku viac ako 10 mm do nádržky na kvapalinu a odsávajte pomaly.

Reverzné pipetovanie ponúka dodatočnú ochranu, pretože pred nasávaním úplne stlačíte piest na 2. doraz, takže nie je šanca vstreknúť vzduch do kvapalnej vzorky. Ďalšie informácie o reverznom pipetovaní nájdete na tejto stránke. 

Pipeta s priamym posunutím nevytvára pri interakcii s kvapalinou bubliny ani penu, pretože jej hrot v tvare injekčnej striekačky nepredstavuje vzduch, s ktorým by kvapalina mohla interagovať.

Dekontaminujte pipetu utretím vlhkou handričkou a čistiacim prostriedkom, ako je izopropanol alebo 10% roztok bielidla. Vyhnite sa priehľadnému plastovému okienku mikrometra.

Autoklávovanie môže byť ďalšou možnosťou, ale skontrolujte špecifikácie prístroja pipety. Ak je autoklávovateľný, je autoklávovaný celý prístroj alebo iba tekutý koniec?  Často je možné autoklávovať iba tekutý koniec.

Ak sa chcete dozvedieť viac o čistení pipety, zaobstarajte si plagát Čistenie pipety .

Kalibrácia je kontrolované a zdokumentované meranie systematickej chybovosti (presnosti) a náhodnej chybovosti (presnosti) pipety. V mnohých laboratórnych prostrediach musí byť výkon pipety pravidelne testovaný a dokumentovaný zákonom za špecifických podmienok certifikovaných akreditovaným orgánom. 

Poskytovatelia s certifikáciou ISO kalibrujú pipety v kontrolovanom prostredí. Výsledky sú bezpečne zdokumentované na kalibračnom certifikáte, ktorý sa pridáva do histórie výkonu pripravenej na audit pre každý prístroj. Ak sú potrebné úpravy, kalibračné laboratóriá s certifikáciou ISO poskytujú odborný servis s dielmi a mazivami odporúčanými výrobcom. 

Rainin a METTLER TOLEDO sú najväčšia svetová organizácia poskytujúca servis pipiet s rýchlym obratom od služieb poštou a servisu na mieste. Servisné laboratóriá sú certifikované podľa normy ISO 17025 a postupy sa riadia aktualizáciou normy ISO 8655 z roku 2022. 

Presnosť pipiet – alebo pravdivosť, ako sa to teraz nazýva – je rozdiel medzi stredným objemom všetkých meraní (4 – 10 meraní) a nastaveným objemom. 

Presnosť je štandardná odchýlka všetkých vykonaných meraní. Ako ďaleko sú od každého čítania ostatné?

Neistota pipety je kvantitatívny termín pre jej celkovú presnosť. Je to kombinácia pravdivosti (miera systematickej chyby) a presnosti (miera náhodnej chyby). 

Rovnica pre neistotu je: 

Neistota = systematická chyba + náhodná chyba * k. k (faktor pokrytia alebo Z-skóre) závisí od počtu meraní. k=3,31 pre štyri merania a 2 pre desať meraní.

Pipety skladujte vertikálne, zavesené na poličke alebo stojane na pipety. Udržujte pipety čisté a bez akýchkoľvek nečistôt. Stojany na špičky pipet nechajte zatvorené.