Biokatalízis és enzimkatalízis

A biokatalízis vagy az enzimatikus katalízis biológiailag aktív komponenseket használ a kémiai átalakulások katalizálására. A biokatalízis elsősorban szén-centrikus reakciók spektrumát segíti elő a sejtmentes, teljesen in vitro és az élő sejttenyészetben zajló fermentáció által közvetített folyamatokig.

A biokatalízis több okból is hasznos alternatívája a hagyományos kémiai katalízisnek. Enzimatikus biokatalizátor reakciók:

• Erősen kemo-, regio- és enantio-specifikusak
• Gyakran gyors kinetikával rendelkeznek
• Enyhébb körülmények között működik, mint a kémiai katalizátorok
• Szüntesse meg a fémkatalizátorok hulladékának, toxicitásának és költségeinek problémáját
• Csökkentse a kémiai reakciókkal kapcsolatos energiaigényt

A biokatalizátorok irányított tervezése javítja az oldószerek stabilitását magas hőmérsékleten, lehetővé téve a biokatalízis széles körű alkalmazását a gyógyszeriparban, a vegyiparban, a bioüzemanyagokban és az élelmiszeriparban.

Töltse le ezt az ingyenes tanulmányt, hogy megtudja, hogyan teszi lehetővé a PAT és az adattudomány a biokatalízis folyamatok kutatásában, fejlesztésében és gyártásában az életképtelen szintézisútvonalak gyors azonosítását, a kinetikus reakció mérését, valamint a folyamatparaméterek szűrését és ellenőrzését.

A biokatalízis a "zöld", fenntartható és költséghatékony vegyipari termékek gyártásához kapcsolódik. A kemotalízishez képest a biokatalizátorok eredendő előnyöket kínálnak a szintézishez, többek között:

• Jelentős vegyületdiverzitás, akár természetes, akár genetikailag módosított forrásokból, a kémiai átalakulások széles körének kezelésére
• A specifikus klasszikus kémiai szintézis/feldolgozási stratégiák szükségességét csökkentő biokatalitikus reakciók specifikussága, mint például blokkoló/deblokkozó csoportok használata, enantiomer keverék elválasztása és a nem kívánt melléktermékek eltávolítására irányuló munka
• Az infrastruktúra és a nyersanyagkövetelmények egyszerűsítése, mivel számos biokatalízis folyamat elvégezhető egyedényes reakciókban, és kiküszöböli a hagyományos kémiai katalízis  által megkövetelt reakciólépéseket

A biokatalízisben használt enzimek fontos és gyakran kiaknázott képességekkel rendelkeznek, amelyek a következők:

A) Más biológiai szerek vagy kis molekulák funkciós csoport- vagy helyspecifikus kötődése és célfelismerése

B) Más biológiai szerek vagy kis molekulák asszociációjának vagy kiszorításának elősegítése

C) Szerkezeti vagy elektrosztatikus jellemzők, amelyek megkönnyítik az ionszállítást

D) rendezetlen szerkezeti átalakulásokra és így változatos katalitikus tevékenységekre rendezett

E) Alloszterikus vagy közvetett módosítások, amelyek enzimaktivitást indukálnak vagy elnyomnak

A továbbfejlesztett vagy módosított rekombináns biokatalizátorok kutatása tovább bővíti hasznosságukat a kemény kémiában, javítja a reakció hatókörét, az enzimek robusztusságát és újrafelhasználhatóságát. Természetes és mesterséges biokatalizátorok állnak rendelkezésre olyan kulcsfontosságú kémiai átalakulások végrehajtására, mint a C-C kötések, amidkötések kialakulása, királis aminok kialakítása és a CH funkcionalizálása.

A biotranszformációhoz használt enzimek köre rendkívül széles, és gyakorlatilag minden ipari ágazatot lefed, beleértve az élelmiszeripart, a gyógyszeripart, a textilipart, a bioüzemanyagokat, a papírt, a vegyi anyagokat és a háztartási termékeket. A finom vegyi anyagok, gyógyszerek és kapcsolódó intermedierek szintézisében a biokatalízis (azaz az enzimatikus katalízis vagy az enzim által közvetített katalízis) gyorsan fejlődött, mint lehetővé tevő technológia. Az enzimek különféle biotranszformációkhoz állnak rendelkezésre, például oxidációkhoz, redukciókhoz, hozzáadásokhoz és eliminációkhoz. 

Az enzimek hat fő osztálya és alkalmazási példák: 

1. Oxidoreduktázok, amelyek katalizálják a molekuláris oxidációkat és redukciókat. A molekuláris oxigénnel rendelkező monooxigenáz enzimek lehetővé teszik a CO-kötés kialakulását, és specifikus enzimeket terveztek, amelyek lehetővé teszik az alkoholok, ketonok, aldehidek és aminok oxidációját. A redukciók tekintetében a ketoreduktázok (KREDS) és a dehidrogenázok lehetővé teszik az enantiospecifikus alkoholok szintézisét. Más enzimek csökkenthetik a kötéseket, például a C=N-t, a nitrileket aminokká alakítva. 

2. A transzferázok hasznosak a funkcionális csoportok egyik molekuláról a másikra történő átvitelére. A kináz és a foszfatázok (foszfátok hozzáadása és eltávolítása) különösen fontosak a molekuláris jelátviteli kaszkádok, a DNS-replikáció, az RNS transzkripció és más funkciók szempontjából. Számos biológiailag jelentős transzferáz is létezik, amelyek olyan funkciókat látnak el, mint például a ketonok vagy aldehidek aminokká történő átalakítása, és amelyek ezt sztereoszelektíven képesek megtenni.

3. A hidrolázok katalizálják a különböző szubsztrátok hidrolízisét. A nukleázok vagy proteázok termékenyek és nélkülözhetetlenek a nukleinsavak és peptidek újrahasznosításában. A hidrolázok, mint például a lipáz, a proteáz és az aciláz, katalizátorként működnek a Michael 1,4-addíciók számára, amelyeket széles körben használnak C-C és szén-heteroatom kötések kialakítására.

4. A liázok általában kettős kötések kialakulásával vagy megszüntetésével katalizálják a reakciókat. A hidrolázok szubsztitúciós reakciójától eltérően a karbonáz vagy a dekarboxiláz reakciók gyakoriak a gyógyszerészeti biokatalízisben a CO₂ hozzáadására vagy eltávolítására, csakúgy, mint a CN-liázok, amelyek aminosavak előállítására használhatók, beleértve a szubsztituált aszparaginsavakat és alaninokat.

5. Az izomerázok lehetővé teszik az atomok átrendeződését egy molekulában. Az izomerázok, mint például a racemák, megfordítják a sztereokémiát a cél királis szénnél, a cisz-transz izomerázok pedig katalizálják a cisz-transz izomerek izomerizációját alkénekben vagy cikloalkánokban. A glükóz fruktózzá történő átalakítása glükóz-izomerázon keresztül jelentős ipari enzimatikus biotranszformációt jelent.

6. A ligázok új kémiai kötéseket képeznek két molekula összekapcsolásával, hogy nagyobb molekulát képezzenek. Az egyik legfontosabb alkalmazás a DNS-ligáz alkalmazása rekombináns DNS-molekulák képződésében, és az endo- vagy exonukleázok komplementje.

Enzimkatalizátorok előállítása. Általában a biokatalízishez használt természetes vagy rekombináns enzimeket először fermentációval szintetizálják, leggyakrabban baktériumok felhasználásával, de esetenként élesztőkultúrákból származnak. Bár az enzimek összetettebb emlőssejtkultúrákban is előállíthatók, a baktériumok és az élesztő általában elegendő és természetben előforduló molekuláris útvonalat tartalmaznak a rekombináns biokatalitikus enzimekhez szükséges hajtogatási és mérsékelt poszttranszlációs módosítások eléréséhez. Az ilyen fermentációkkal előállított enzimeket általában a sejtszerkezetek lízisével vagy más megszakításával gyűjtik be, hogy felszabadítsák a rekombináns enzimeket, és más biológiai enzimekhez hasonló eljárással tovább tisztítják őket. Gyógyszerek. Az erjesztés, a betakarítás és a későbbi feldolgozás saját kihívásokat jelent, amelyeket a folyamatanalitikai technológia (PAT) kihasználásával lehet kezelni.

Stabilizálás és immobilizáció. Az enzim immobilizálását stabilabb, aktívabb és újrafelhasználhatóbb enzimek elérésére használják. Általában a térhálósított enzimaggregátumok (CLEA-k) több különböző szilárd szubsztráttal, például szilícium-dioxiddal, gyantákkal vagy polimerekkel, például PEG-vel, sőt más komplexekkel, például lipid-nanorészecskékkel (LNP-k) is képződhetnek. Egyes áramláskémiai alkalmazásoknál a CLEA-k felületeken és érzékelőkön is kialakíthatók, például analitikai és katalitikus célokra felületjavított mérésekhez. A vakcinaformulázás és az adjuváns folyamatok hasonló megoldásai a kapcsolódó komponensszintézis, adszorpciók, konjugációk vagy egyéb asszociációk, valamint a termék stabilitásának és formulázásának kihívásaival foglalkoznak.

Termékrögzítés és izolálás. A biokatalízis után a CLEA-kat elválasztják a terméktől és a maradék reagensektől, majd újrahasznosíthatók vagy más módon megtarthatók. A kis molekulájú termékeket ezután szűréssel vagy kromatográfiás eljárással izolálhatjuk, bár sok folyamat továbbra is a kristályosítási módszereket részesíti előnyben. A nagy molekulájú biokatalízis termékek általában a hagyományos downstream feldolgozási munkafolyamatokkal folytatódnak.

Bármely szabad, szubsztráthoz kötött vagy felületi immobilizált enzim gyakorlati felezési idejének és stabilitásának megértése kritikus lehet a megfelelő biokatalízis protokollok megtervezésében. A szempontok a következők:

• Oldószerek –Sok természetes enzim küzd a szerves oldószerreakciók kezelésével. A módosított vagy rekombináns enzimek folyamatosan fejlődő profilja javítja a szerves oldószerekkel való kompatibilitást. A rekombináns enzimek ma már képesek katalizálni a reakciókat szerves oldószeres környezetben, lehetővé téve például a módosított foszforamiditok felhasználását az oligonukleotid szintézisében.
• pH -Az enzimek általában szűk pH-tartományban működnek a legjobban, és tolerálják a pH-ingadozást <0,5 pH-egység. Így a pH-szabályozás gyakran kritikus paraméter számos biokatalitikus reakció mérlegeléséhez, és nehéz vagy fárasztó lehet manuálisan szabályozni. 
• Hőmérséklet -A természetes enzimek és rekombináns társaik hatékonyan működnek meghatározott hőmérsékleteken, meglehetősen szűk tartományokban. A hőmérséklet-eltérések változásokat okozhatnak a reakció kinetikájában, a termék hozamában vagy más kritikus folyamateredményekben.
• Oldott oxigén –Ezt a kritikus folyamatparamétert, amely különösen fontos az oxigénellátási és redukciós reakciók szempontjából, általában oxigén vagy inert gáz permetezéssel vagy fejtérrel történő adagolásával szabályozzák. Az oldott oxigén mennyiségének és tömegátvitelének optimalizálása (beleértve a buborékjellemzőket is) a reakciókeverékbe kritikus fontosságú annak biztosításához, hogy az oxidoreduktáz enzimek csúcshatékonysággal működhessenek.
• Keverés, folyadékdinamika és gázok –A megfelelő keverőberendezés nagymértékben befolyásolhatja a biokatalitikus enzimek életciklusát, különösen hosszú időtartamok, áramlási kémia vagy perfúziós stílusú futások esetén. A biokatalitikus reakciók felskálázása nem lehet optimális, ha a keveredés nem megfelelően jellemezhető. A keverés kritikus fontosságú a megfelelő gázelosztás és tömegátadás szempontjából is.
• Reakció sztöchiometria—A helyes reagens-enzimek arány kritikus, és meghatározható a kísérletek tervezésével (DoE), kémiai reaktorokkal automatizálva, és a folyamatfejlesztésbe integrált PAT segítségével.

A biokatalitikus reakciók kifejlesztése és felskálázása az alkalmazott specifikus biokatalizátorok, szubsztrátok, kofaktorok és reakciókörülmények jellegétől függ. A kémiai katalízishez hasonlóan a változók összetett, egymástól függő mátrixát is a reakcióváltozók gondos ellenőrzésével lehet a legjobban megérteni, ha valós idejű analitikai mérésekből származó információkkal kombinálják. A modern folyamatok folyamatfejlesztésének, méretezésének és adatsűrűségének korlátozásainak nagy része azonban a biokatalízis reakciók folyamatos manuális orientációjához kötődik, amelyek jelentős idő- és erőforrásköltséggel járnak. A kézi működtetés azt jelenti, hogy a bioreaktorban szinte állandó gondozásra, beállításra és mintavételre van szükség a folyamatok jellemzése és a technológiatranszfer iránti növekvő szabályozási és intézményi igények kielégítésére.

A biokatalízis felügyelet nélküli működése olyan laboratóriumi automatizálási platformokon keresztül lehetséges, amelyek integrált szenzorok és folyamatanalitikai technológiák (PAT) segítségével folyamatosan mért dinamikus reakciókörülményekre reagálnak. Az automatizált szintézisreaktor platformok gyorsabb kísérletezést tesznek lehetővé az emberi hibák vagy beavatkozások minimalizálásával. Az offline kromatográfiás elemzéshez szükséges moduláris, automatizált reaktormintavétellel párosítva az összes kritikus folyamatparaméter (CPP) átfedhető és trendezhető. A paramétervezérlés és a folyamatelemzési adatok automatikusan, valós időben rögzítésre kerülnek, és strukturálva vannak az adatkezeléshez és az archiváláshoz. A csökkentett kísérleti változékonyság és a különböző reaktorskálák közötti megnövekedett reprodukálhatóság tovább egyszerűsíti a bizonyítékokon alapuló skálázást.

• Az EasyMax és az OptiMax automatizált reaktorok fontos szerepet játszanak annak biztosításában, hogy a biotranszformációk kulcsfontosságú változóinak, például a hőmérsékletnek, a pH-nak, a keverési sebességnek és az adagolásnak a hatása pontosan szabályozható, hatékonyan modellezhető és rögzíthető legyen.
• A ReactIR és a ReactRaman in situ spektroszkópiai technológiák hasznosak a kulcsfontosságú reakciófajok valós idejű nyomon követésére és mérésére. A ReactIR nyomon követi a kulcsfontosságú analitokat az oldatban a lebegő részecskék, például az egész sejtek interferenciája nélkül.
• Az FBRM technológiával készült ParticleTrack a részecskeméretet és -eloszlást méri heterogén szuszpenziókban. Az EasyViewer in situ képeket készít a részecskékről, és valós idejű képelemzést végez a rendszer zavarosságáról, alakjáról, méretéről, morfológiájáról, számáról és eloszlásáról.
• Az EasySampler lehetővé teszi a kémiai reakciók teljesen automatizált és felügyelet nélküli mintavételét, beleértve a minták kioltását és hígítását az offline elemzésre való előkészítés során.
• A Scale-up Suite folyamatfejlesztési és vertikális felskálázási szoftver gyors fejlesztést, optimális folyamatokat és robusztus vertikális felskálázást tesz lehetővé.

Az EasyMax automatizált reaktor egy teljes munkaállomás a biokatalízis paramétereinek optimalizálásához a fejlesztés, a méretezés és a végrehajtás támogatása érdekében. Ez a teljesen automatizált rendszer lehetővé teszi a folyamatparaméterek pontos vezérlését.

• CPP-k kezelése, beleértve a forrásanyag azonosítását, az adagolási sebességet, a hőmérsékletet, a keverést, a fejteret, a permetezést, a pH-mérést és a titrálást
• Könnyen integrálható a biokatalízis in situ elemzésével, beleértve a ReactIR (FTIR), a ReactRaman (Raman), a ParticleTrack (FBRM), az EasyViewer (in situ képelemzés) és az EasySampler (automatizált, in situ reaktormintavétel)
• Kísérletek futtatása felügyelet nélkül; Intelligens automatizált mintavételezés végrehajtása, ha offline elemzésre van szükség
• Az iC Software lehetővé teszi az összes kísérlet és perifériás berendezés automatikus végrehajtását és vezérlését, valamint a teljes adatrögzítést és nyilvántartást

A ReactIRFTIR spektroszkópiát használ vizes és szerves oldható komponensek mérésére a biokatalízis vizsgálatokban. A reactIR méréseket nem befolyásolják a lebegő szilárd anyagok, buborékok vagy más részecsketömeg.

A ReactRamanRaman-spektroszkópiát használ a részecskék molekuláris elemzésére és a reakcióelemzésre.

• Számos termékminőségi attribútumot figyel a helyszínen és valós időben egy edényben vagy áramló folyamatáramban
• Kiküszöböli a minták megragadásával kapcsolatos késéseket
• Számszerűsíti a feldolgozási lépések hatását a termék hozamára és a folyamat hatékonyságára
• Használható adatelemzést biztosít a valós idejű döntéshozatalhoz és ellenőrzéshez
• Támogatja az ICH szabályozási irányelveit az adatokban gazdag kísérletezés és digitalizáció révén
• Segíti a kutatás-fejlesztéstől a gyártásig való növekedést
• Akár 500 ppm analit koncentrációt mér néhány millilitertől több ezer literig terjedő térfogatban

A ParticleTrack  fókuszált sugárvisszaverődési mérési (FBRM) technológiát használ, és egy optikai szonda alapú műszer, amelyet közvetlenül az edénybe helyeznek, hogy valós időben nyomon követhessék a részecskeméret és -szám változását. A ParticleTrack akkordhossz-eloszlás (CLD) méréseket használ a részecskeméret-eloszlás (PSD) meghatározásához.

• A részecskék és részecskék szerkezetét folyamatosan figyelik, mivel a kísérleti körülmények vagy paraméterek változnak
• Jellemezze a szilárd fázisú részecskeszintézist, az enzimim-immobilizációt, a hasítást és a kapcsolódó folyamatmorfológiákat
• Kövesse nyomon a biokatalízis termékek tételes vagy folyamatos növekedését a biokatalízis során valós időben, mintaeltávolítás nélkül
• Jellemezze a részecskerendszer állapotát, amely befolyásolja a nukleációt, a csapadékot, a polimorfizmust és más rendszertulajdonságokat

Az EasyViewer egy szonda alapú részecskeméret-analizátor, amelyet közvetlenül egy edénybe helyeznek, hogy képeket készítsenek a részecskerendszerről. Az EasyViewer képelemzést végez, és méri a részecskeszámot, a méreteloszlást és a morfológiát a folyamat időfelbontású inline képeiből, lehetővé téve a populációk időbeli trendjét.

• A részecskék és részecskék szerkezetét folyamatosan figyelik, mivel a kísérleti körülmények vagy paraméterek változnak
• Jellemezze a szilárd fázisú részecskeszintézist, az enzimim-immobilizációt, a hasítást és a kapcsolódó folyamatmorfológiákat
• Mérje meg a tömegátvitelt (_KLA)buborékjellemzéssel
• Kövesse nyomon a biokatalízis termékek tételes vagy folyamatos növekedését a kristályosítás során valós időben, mintaeltávolítás nélkül
• Jellemezze a részecskerendszer állapotát, amely befolyásolja a nukleációt, a csapadékot, a polimorfizmust és más rendszertulajdonságokat

A kísérlettervezés (DoE) statisztikailag hasznos eszköz a változók reakcióteljesítményre gyakorolt hatásának feltárásához szükséges kísérletek számának minimalizálására a laboratóriumban. Ennek ellenére az enzimkatalízis folyamatok előállítására való kiterjesztése problémákkal jár. Például sok biokatalízis vizsgálat nem veszi figyelembe az olyan változókat, mint az oldószerek, a pH, a hőmérséklet és a keverés a méretnövelésben. A dynochem modellezés lehetővé teszi a fontos fizikai és termikus tulajdonságok figyelembevételét a méretnövelés során. Ha kinetikai információkat használunk a Dynochem modellezéssel, megfelelő mintavételi végpontok határozhatók meg a biokatalízis folyamatokhoz, így időt és erőforrásokat takarítunk meg. Így a Dynochem modellezés javítja a kritikus folyamatparaméterek fejlesztését és a hatékony folyamattervezési teret.