Budoucnost analýzy buněk nevyžaduje barvení

Nová data ukazují, že metoda bez barvení poskytuje při hodnocení životaschopnosti buněk výsledky srovnatelné s průtokovou cytometrií.

Výsledky životaschopnosti buněk do značné míry závisí na metodě, která se k jejich měření použije. Nová bílá kniha společnosti METTLER TOLEDO porovnává CytoDirect, průtokovou cytometrii a barvení trypanovou modří napříč pěti buněčnými modely. Data ukazují, že testování životaschopnosti buněk bez barvení pomocí CytoDirect se úzce shoduje s výsledky průtokové cytometrie, referenční techniky pro detekci apoptózy a nekrózy.

Stáhněte si bílou knihu a prohlédněte si úplné srovnání a rozhodněte se, zda do vašeho laboratoře zapadá workflow bez barvení.

Porovnání pokročilých metod analýzy životaschopnosti buněk

Průtoková cytometrie zůstává referenční metodou pro detekci apoptózy a nekrózy ve vzorcích buněk. Vyžaduje však nákladné vybavení, časově náročný proces barvení a zkušeného operátora, který dokáže správně provádět měření i interpretovat výsledky. Tyto požadavky omezují její praktické využití pro rutinní laboratorní testování, a to i v laboratořích, které důvěřují její přesnosti.

Metoda vyloučení trypanovou modří řeší otázku nákladů i rychlosti a díky své jednoduchosti se stále široce využívá v běžných i testovacích laboratořích. Má však známé omezení: manuální počítání pomocí hemocytometru nedokáže detekovat buňky v časných stadiích apoptózy. Tento nedostatek ovlivňuje přesnost údajů o životaschopnosti buněk právě ve chvíli, kdy jsou pro výzkumníky nejdůležitější, tedy před tím, než vzorek postoupí do dalších fází studie.

Testování životaschopnosti buněk bez barvení v praxi

Bílá kniha porovnává systém CytoDirect s oběma referenčními metodami v pěti experimentálních modelech, z nichž každý představuje odlišný reálný scénář. Výzkumníci ošetřili buňky HeLa a Jurkat staurosporinem, dobře charakterizovaným cytotoxickým činidlem, které se běžně používá ve výzkumu apoptózy k jejímu vyvolání. Buňky HeLa byly rovněž vystaveny UV záření, tedy nechemickému stresovému faktoru, který vyvolává různorodější buněčné odpovědi. Studie také porovnávala čerstvě izolované a rozmražené PBMC v několika časových bodech po izolaci.

V každém modelu byly použity definované poměry živých a mrtvých buněk 0:100, 50:50 a 100:0. Tento přístup umožnil posoudit, jak si jednotlivé metody vedou u vzorků s nízkou, střední i vysokou životaschopností, nikoli pouze v krajních případech, kde lze rozdíly mezi metodami nejsnáze přehlédnout.

Bodové grafy z CytoDirect a průtokové cytometrie znázorňující údaje o životaschopnosti buněk HeLa

Rozbalit pro zobrazení

Výsledky ukazují těsnou shodu mezi CytoDirect a průtokovou cytometrií ve všech testovaných modelech:

Buňky HeLa ošetřené staurosporinou: 87 % životaschopnost podle CytoDirect oproti 91 % podle průtokové cytometrie

Buněčná linie Jurkat ošetřená staurosporinou: 96 % oproti 97 %

Buňky HeLa po UV ozáření: 92 % oproti 93 %

PBMC měřené 24 hodin po rozmrazení: 89 % oproti 86 %

Trypanová modř vykazovala ve srovnání s referenční metodou u těchto stejných vzorků větší odchylky. U vzorků s nízkou životaschopností, například u zcela apoptotických buněk Jurkat, měla tendenci životaschopnost podhodnocovat, zatímco při postupném úbytku buněk pozorovaném v modelu PBMC ji měla tendenci nadhodnocovat.

Rychlejší pracovní postup bez barvení

CytoDirect dosahuje těchto výsledků díky kombinaci digitální holografické mikroskopie a metod strojového učení, a to bez použití barviv i bez nutnosti manuálního gateování. Přístroj analyzuje každý vzorek přímo na základě morfologických a biofyzikálních vlastností buněk, nikoli podle fluorescenčních markerů.

Tento přístup bez barvení eliminuje kroky spojené s barvením a gateováním, které zpomalují průtokovou cytometrii, a zároveň odstraňuje ruční počítání, jež omezuje citlivost metody vyloučení trypanovou modří. Každý vzorek ve studii byl analyzován ve třech opakováních a výsledky byly pro účely reportování zprůměrovány, což této metodě poskytuje úroveň konzistence, na kterou se lze v rámci rutinních pracovních postupů spolehnout.

CytoDirect zobrazuje mapu životaschopnosti pro pokročilou vizualizaci údajů o životaschopnosti.

Pro laboratoře, které rutinně provádějí testování životaschopnosti buněk, představuje metoda bez barvení možnost získat výsledky srovnatelné s průtokovou cytometrií bez vysokých nákladů, časových prodlev a nutnosti specializované obsluhy. Tato kombinace výhod je zvláště cenná v běžných a testovacích laboratořích, kde je objem vzorků vysoký a rychlost zpracování ovlivňuje navazující pracovní postupy.

Laboratořím pracujícím s primárními buňkami, jako jsou PBMC, nabízí vyšší citlivost při detekci časných apoptotických událostí přesnější obraz o kvalitě vzorku ještě předtím, než může ovlivnit následné výsledky. Zachycení těchto časných signálů může ovlivnit způsob využití vzorku a pomoci odhalit potenciální problémy dříve, než se projeví v pozdějších fázích výzkumu.

Data o životaschopnosti buněk jsou pouze tak spolehlivá jako metoda, na které jsou založena. Tato bílá kniha představuje kompletní soubor dat pro systém CytoDirect, včetně výsledků získaných u buněk HeLa, Jurkat a PBMC, spolu s bodovými grafy a prahovými hodnotami životaschopnosti použitými při generování jednotlivých výsledků. Díky tomu můžete přesně posoudit, jak si tato metoda vede ve srovnání s nástroji, na které se vaše laboratoř již spoléhá.