바이러스 불활성화는 일반적으로 생물치료제의 안전성을 향상시키기 위해 고안된 두 단계의 전용 단계 중 첫 번째 단계입니다. 불활성화 동안, 풀링되고 반정제된 치료 현탁액 내에 존재하는 모든 바이러스는 일반적으로 바이러스 주변의 환경을 변경하여 바이러스 구조의 비가역적 파괴 및 변성을 유발함으로써 의도적으로 파괴되거나 불시에 비병원성이 됩니다.
일반적으로 이는 바이러스 주변의 환경을 변경하여 바이러스 구조의 비가역적 파괴 및 변성을 유발함으로써(예: 화학적, 물리적 또는 에너지적인 방법으로) 수행됩니다. 바이러스 제거는 관심 단백질이나 산물에서 바이러스를 제거하거나 분리하여 바이러스 안전성을 더욱 향상시키는 보완적인 공정이므로 바이러스 불활성화와는 별개로 구분됩니다.
많은 생물치료제가 생산 또는 가공 과정에서 바이러스를 포함하거나 바이러스로 오염될 수 있습니다. 이러한 양상에서 병원성 및 바이러스 부하 내지는 바이러스의 양이 환자에게 해를 끼치지 않도록 예방하기 위해서는 불활성화 및 제거 수단을 통해 이를 죽이거나 제거해야 하며, 이는 일반적으로 한 가지 공정만으로는 충분하지 않습니다. 바이러스의 특정한 특성과 생물치료제의 유형에 따라 여러 가지 바이러스 불활성화 및 제거 방법을 사용할 수 있습니다. 많은 생물치료제 가공 업무 공정은 충분히 제거할 수 있는 바이러스의 스펙트럼을 증가시키기 위해 보완적인 방법을 조합하여 사용합니다.
불활성화
여러 불활성화 방법을 사용할 수 있습니다. 가장 흔한 방법은 다음과 같습니다.
덜 자주 사용되는 바이러스 불활성화 방법에는 특히 혈액 또는 혈청 기반 제품의 경우 저온 살균, 건열 및 증기 열이 포함됩니다.
바이러스 제거
잘 문서화된 바이러스 제거 방법에는 침전, 크로마토그래피 및 나노 여과가 포함됩니다.
바이러스 불활성화 및 제거에 사용할 방법의 선택은 제조할 생물치료제의 크기, 유형 및 적응성, 제조자가 원하는 정제 방법, 그리고 우려되는 바이러스의 특성 및 역가에 따라 달라집니다. 원료 약물(DS)의 구조 및 기능은 바이러스 안전성과 함께 똑같이 중요한 품질 속성이며 전체 공정 동안 평가되고 유지되어야 합니다. 낮은 pH 또는 계면 활성제 등 어떠한 바이러스 불활성화 방법이든 복수의 중요 공정 파라미터(CPP)를 정밀하게 동시에 제어하는 장점이 있는데, 이는 공정 자체와 원료 물질(DS)에 미치는 영향을 효과적으로 이해하는 데 필요한 기능입니다. 화학 합성 반응기 는 지정된 파라미터 공간 내에서 현대적인 공정과 일관된 작동의 매핑을 가능하게 하는 동시에 방법 전달 및 스케일업을 위한 모델링도 가능하게 합니다.
생물치료제의 낮은 pH 바이러스 불활성화는 pH, 시간, 온도, 단백질 함량 및 용질이나 버퍼 함량에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있습니다. 많은 바이러스가 pH 5.0–5.5에서 불가역적으로 변성되고 효과적으로 파괴됩니다. 불성화 및 제거 대상 바이러스의 범위에 따라 이 범위로 충분할 수 있습니다. 그러나 일부 외피보유 바이러스는 pH 범위 3.5–4에서만 효과적으로 불활성화됩니다.
많은 mAb 생물치료제는 특히 다양한 바이러스 유형의 광범위한 스펙트럼 제거를 필요로 하며, 그런 이유로 3.5–4의 '낮은' pH 대상이 일반적으로 실행됩니다(그림 A). 그러나 이 pH 범위에 장기간 노출되면 일부 생물치료제, 특히 혈액 단백질, 인슐린 등과 같은 단백질 또는 효소가 손상되거나 불활성화될 수 있습니다(그림 B). pH 스트레스에 장기간 노출되면 단백질과 효소가 상당한 탈아미드화, 변성 및 응집을 겪게 됩니다. 면역 글로불린 용액(IgG 및 IgM mAbs 포함)은 일반적으로 pH 3.5–5.5에서 다른 단백질이나 효소보다 민감하지 않지만 다양한 등급에서 민감성을 유지합니다. 바이러스 불활성화 조건에서 충분한 시간이 지나면 감염성 바이러스 부하가 효과적으로 최소화되겠지만 잔류 바이러스 입자, 이물질 또는 기타 내용물은 아직 물리적으로 제거되지 않았을 수 있습니다(그림 C).
면역 글로불린 mAb 제품의 경우, 낮은 pH는 계면 활성제나 다른 용매와 달리 비교적 간단하고 작은 설치 공간만 필요로 하며 일반적으로 제거에 거의 관여하지 않거나 추가적인 단계가 필요하지 않기 때문에 바이러스 불활성화에 가장 많이 사용되는 방법입니다. 그러나, 적절하고 최적의 조건은 분자를 비롯해 필요한 바이러스 제거 스펙트럼에 따라 다릅니다. 따라서, 각 분자에 대한 연구를 수행하여 효과적인 바이러스 불활성화가 발생할 수 있는 설계 공간 또는 운영 한계를 특성화하고 검증해야 합니다. 이러한 한계와 바이러스 불활성화 공정의 결과는 일반적으로 바이러스 불활성화 결과 및 그로 인한 원료 약물(DS)의 품질에 영향을 미치는 변수나 중요 공정 파라미터(CPP) 모두에 의해, 또는 적어도 하나의 선택된 변수나 파라미터에 의해 정의됩니다. 이러한 요소를 식별하고 조사하는 것은 제품 품질과 수량에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
전통적으로, 낮은 pH 바이러스 불활성화 연구는 마그네틱 교반기를 활용해 비커와 같은 용기에서 설정된 면역 글로불린 용액의 부피와 농도로 수행됩니다. 대부분의 연구 자료에는 생리학적 조건에 가까운 시작 pH를 갖는 면역 글로불린 용액이 사용되므로 바이러스 불활성화 연구에서는 시약 추가 파라미터를 설명할 방법을 찾을 것입니다. 일반적으로, 수동 적정은 간헐적으로 pH 측정을 기록하는 동안 뷰렛 또는 피펫팅을 사용하여 수행됩니다. 대상 바이러스 함량을 불활성화할 수 있을 만큼 낮은 pH 조건에서 규정된 시간 및 기타 파라미터 유지 완료 후, 원료 약물(DS) 또는 면역 글로불린 용액은 낮은 pH 범위에서 적절한 생리적 범위 또는 약염기성의 범위 내로 역 적정됩니다. 이는 낮은 pH 유지를 통해 바이러스 불활성화를 완료하는 역할을 합니다. 그러나 바이러스 불활성화에 대한 낮은 pH 적정 연구 전반에 걸쳐, 샘플 추출이 오프라인 분석에서 크기 교환 크로마토그래피(SEC)와 같은 방법을 통해 응집 또는 탈아미드화와 같은 다양한 품질 속성을 문서화하는 데 필요합니다. 비록 숙련된 과학자로부터 정밀성을 확보할 수는 있지만, 바이러스 불활성화 공정은 일반적으로 힘들며 자연적인 변화, 부정확성 및 수작업 공정의 재현성 문제로 어려움을 겪습니다.
다운스트림 바이오공정에서 낮은 pH 바이러스 불활성화 연구의 주요 필요성은 시약 추가 범위와 공정에 필요한 시간을 정의하는 것이지만 공정 역학의 특성화 및 배합 공정 파라미터의 영향도 중요하며 궁극적으로는 강력하고 최적화된 바이러스 불활성화 공정의 설계를 보장하기 위한 요건입니다. 그러나 온도 모니터링과 제어는 종종 간과되기 쉬우므로 바이러스 불활성화를 위한 공정 개발 연구 중에 통제되지 않는 파라미터입니다.
이러한 실수는 온도를 기록할 수는 있지만 제어할 수는 없는 유지 또는 이송 용기에서 바이러스 불활성화를 수행하는 파일럿 또는 심지어 상업용 제조 규모의 시스템을 사용하는 것이 부분적인 원인일 수 있습니다. 스케일의 대표성, 특히 혼합의 대표성은 종종 자기 교반 플레이트에 의해 제어되는 수동 플랫폼을 통해 수행되는 것과 같은 낮은 pH 바이러스 불활성화 연구에서 쉽게 간과되는 또 다른 파라미터입니다. 혼합과 같은 간단한 것에 대한 데이터 캡처가 부족하면 연구의 가정 조건이 정확하고 일관적인지 확인할 수 없습니다.
바이러스 불활성화 단위 조작을 위한 낮은 pH 처리는 단일 클론 항체용 다운스트림 공정 중에 공정 중 제품 응집이라는 잠재적 위험을 가져옵니다. GlaxoSmithKline의 Hiren D. Ardeshna가 발표한 이 프리젠테이션에서는 다음 네 가지 공정 파라미터의 효과를 조사하기 위한 전체 요인 실험 설계에 대해 설명합니다.
용매 또는 세제 바이러스 불활성화 방법은 일반적으로 외피보유 바이러스에 대해 사용됩니다. 사용되는 시약은 일반적으로 일부 낮은 pH 방법에서 일어날 수 있는 변성 또는 탈아미드화 문제를 겪는 치료 단백질 또는 항체의 적응성에 무시할 수 있을 정도의 영향만 미칩니다. 바이러스 불활성화를 위한 용매 또는 세제 처리 방법은 낮은 pH 방법과 동일한 요구 사항 및 요소가 많습니다. 주로 시약 추가 범위(이 경우 용매 또는 세제)와 공정에 필요한 시간을 정의합니다. 낮은 pH 바이러스 불활성화와 마찬가지로 면역 글로불린 또는 다른 원료 약물(DS) 유형에 따라 조건이 다릅니다. 따라서, 각 분자에 대한 연구를 수행하여 효과적인 용매 또는 세제 바이러스 불활성화가 발생할 수 있는 설계 공간 또는 운영 한계를 특성화하고 검증해야 합니다. 이러한 한계와 바이러스 불활성화 공정의 결과는 온도, 단백질 함량, 용매 또는 세제 함량, 불활성화 조건에서의 시간, 용매 또는 세제 균질화의 혼합 및 효과를 포함하는 중요 공정 파라미터(CPP)에 의해 유사하게 정의됩니다. 이러한 요소를 식별하고 조사하는 것은 제품 품질과 수량에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
세제 바이러스 불활성화 연구는 낮은 pH 연구와 동일한 방식의 시약 적정이 필요하지 않지만, 중요한 변수의 설계 공간은 계속 평가해야 합니다. 낮은 pH와 마찬가지로, 용매 또는 세제를 사용하는 바이러스 불활성화 연구는 전통적으로 공정을 완전히 수동으로 특성화합니다. 시약 투여 및 제어는 여러 가지 중요한 작업을 동시에 수행하는 고도로 숙련된 사람의 정확도와 정밀도에 비슷하게 의존합니다. 용매 또는 세제 바이러스 불활성화 연구는 마찬가지로 자연적인 변화, 부정확성 및 재현성 문제의 영향을 받습니다.
용매 또는 세제에 의존하는 바이러스 불활성화 방법은 일반적으로 낮은 pH 방법과 관련이 없는 추가적인 고려 사항이 필요합니다. 추가된 용매 또는 세제는 반드시 원료 약물(DS) 또는 면역 글로불린 용액에서 제거하고 적절한 분석 방법으로 확인해야 합니다. 일반적으로 용매 또는 세제는 접선 유동 여과를 통해 크로마토그래피 또는 버퍼 교환을 통해 제거됩니다. 추가된 용매 또는 세제의 제거는 낮은 pH 불활성화에서 적절한 생리적 범위 또는 약염기성의 범위 내로 역 적정되는 목적과 다소 유사합니다. 대규모의 버퍼 교환 또는 크로마토그래피 방법은 물질이 유지 용기에서 용매 또는 버퍼 교환을 위해 컬럼 또는 기타 적절한 멤브레인을 통해 이동할 때 연속 또는 반 연속 단위 조작으로 발생할 가능성이 높습니다. 공정 개발에서 용매 또는 세제 바이러스 불활성화는 다음과 같은 정제 또는 제거 단계와 구분되어 별개로 발생하기 쉽습니다. 따라서, 이를 수행하므로써 데이터 또는 정보의 연속성이 더욱 복잡해질 수 있습니다.
톡소이드, 재조합 단백질, 아단위, 다당류 및 몇몇 유사 바이러스 입자 백신 선택을 포함하는 다양한 백신 의약품이 바이러스 불활성화를 거칩니다. 다시 말해, 적절한 바이러스 불활성화 방법의 선택은 효과적으로 제거해야 하는 바이러스의 폭뿐만 아니라 생물치료제의 특성도 고려해야 합니다.
일반적으로, 생물치료제가 바이러스 입자인 생약독화 바이러스와 같은 백신 유형에 대한 외부 바이러스 오염을 방지하는 대체 방법이나 실무에 대해서는 엄격한 검토가 필요합니다. 이러한 제품에 대한 특정 방법론에는 각각의 원료 공급원에서 효과적인 외부 바이러스 부하 저감을 위한 하나 이상의 나노 여과 또는 크로마토그래피 공정이 포함될 수 있습니다. 불활성화되거나 파괴된 바이러스는 여전히 적절한 낮은 pH나 용매 또는 세제 기반 바이러스 불활성화 공정을 겪을 수 있습니다. 이는 바이러스 제품이 변성되거나 다른 방식으로 파괴되더라도 원하는 면역 자극 효과를 계속 유지할 수 있기 때문입니다.
올리고뉴클레오티드 제품 또는 분자 유형에 대한 바이러스 불활성화 방법은 일반적으로 필요한 것으로 간주되지 않습니다. 이는 주로 바이러스에 지속적으로 불리할 수 있는 시약, 반응 조건 및 처리 방법의 특성 때문입니다. 현재 개발 및 생산 중인 많은 올리고뉴클레오티드 제품은 주로 접선 유동 여과를 통한 다양한 버퍼 교환 또는 다양한 유형의 크로마토그래피 분리 중 하나에 의해 정제, 농축 및 배합됩니다.
현장 FTIR 및 Raman 분광광도계는 업스트림, 다운스트림, 활용 및 배합 단위 조작 전반에 걸쳐 중요한 바이오 공정 구성 요소를 추적합니다.
포도당 및 주요 대사물은 업스트림 Application에서 모니터링할 수 있는 반면, 다운스트림 공정에서는 단백질이나 백신 농도, 안정제, 부형제 및 불순물을 모두 오프라인 분석과 관련된 지연이나 비용없이 실시간으로 모니터링하고 제어할 수 있습니다.
이를 통해 공정 종말점을 신속하게 판단할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 공정 파라미터가 제품 품질과 공정 효율성에 미치는 영향을 명확하게 이해할 수 있습니다.
