올리고뉴클레오타이드 합성

올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide)는 더 큰 생체분자의 절단을 통한 효소 방식 또는 표적화된 화학 합성으로 형성할 수 있습니다. 후자의 경우, 유기 뉴클레오타이드 합성은 올리고뉴클레오타이드의 주요 모노머 성분인 뉴클레오사이드 포스포라미다이트를 합성하는 화학 공정입니다. 뉴클레오사이드 포스포라미다이트(짧게 뉴클레오사이드 또는 아미다이트라고 부름) 자체는 천연 또는 합성 뉴클레오사이드의 파생물입니다.

그러므로 뉴클레오타이드는 공유 결합된 뉴클레오사이드와 인산기로 구성된 화합물 분자입니다. 뉴클레오타이드는 특수한 배열로 연결되어 원하는 산물을 형성합니다. 따라서 올리고뉴클레오타이드는 서로 연결되어 단일 사슬의 생물학적 폴리머(“-mer”)를 형성하는 짧은 조각의 핵산들로 구성되어 있습니다. 대부분의 올리고뉴클레오타이드(또는 짧게 올리고라고 부름)는 일반적으로 최대 20개의 뉴클레오타이드가 연결되어 구성되기 때문에(하지만 더 긴 연결도 가능), 작은 바이오제약 분자로 간주할 수 있습니다. 

다른 제약 관련 소분자들과 마찬가지로, 올리고뉴클레오타이드 합성에는 온도, pH, 기질의 품질 등과 관련하여 세심한 제어가 필요합니다. 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용되는 일반적 방법으로 인하여, 뉴클레오타이드 배열이 더 길고 복잡할수록 수율, 순도 및 비용 목표를 달성하기가 어려워집니다. 공정 분석 기술(PAT)은 이러한 목표를 달성하는 데 유용합니다.

올리고라고도 불리는 올리고뉴클레오타이드는 짧은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 조각으로, 서로 연결되어 단일 사슬의 생물학적 폴리머를 형성합니다. 개별 뉴클레오타이드의 염기 쌍은 전형적인 화학적 폴리머를 만드는 모노머와 같다고 생각할 수 있습니다. 뉴클레오타이드는 세 부분으로 구성되는데, 질소를 함유한 염기, 5탄당 분자(이 두 부분이 뉴클레오사이드임), 그리고 하나 이상의 인산기입니다. 그 외에도, 뉴클레오타이드는 비천연 또는 비일반적 염기로 구성될 수도 있습니다. 흔한 예로는  LNA(잠금 핵산), 모르폴리노 및 구조적으로 변형된 염기 또는 백본(backbone)이 있습니다. 

뉴클레오타이드의 복잡한 연결을 통해 생물학적으로 중요한 RNA 및 DNA 생체분자가 형성됩니다. 단일 가닥의 생체폴리머인 RNA의 경우, 당은 리보스입니다. DNA의 경우에는 이중 가닥의 분자에 당 디옥시리보스가 포함되어 있습니다. 중요한 올리고뉴클레오타이드의 재료가 되는 것은 짧은 배열의 데옥시리보핵산과 리보핵산입니다. 이 뉴클레오타이드들의 특수한 연결을 통해 생물학, 의학, 법의학 및 임상 Application에 사용되는 표적 생체분자가 만들어집니다. 

올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브

가장 흔하게 사용되는 합성 올리고뉴클레오타이드는 광범위한 Application에서 사용되는 상대적으로 짧은 프로브 및 프라이머(최대 30-mer)입니다. 여기에는 쌍을 이루거나 '역방향 보완'을 통해 더 큰 표적 DNA 또는 RNA 가닥(표적 배열)을 이루는 뉴클레오타이드 배열의 합성이 포함됩니다. 프라이머로서의 올리고는 일반적으로 효소 반응을 시작하여, 예를 들어 짧거나 긴 표적 배열을 수백만 개에서 수십억 개까지 복제하는 데 사용됩니다. 잘 알려진 예로는 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 또는 생어(Sanger) 염기서열 분석법이 있습니다. 올리고 프라이머 Application에는 DNA 염기서열 분석, 유전자 발현, 클로닝 및 분자 진단이 있습니다.

프로브로서의 올리고는 특정 DNA 또는 RNA 표적 배열을 식별하거나 이 배열에 결합하여 주어진 물질 내에 이 배열이 존재하는지 확인하기 위해 사용됩니다. 올리고 프로브를 사용하는 Application에는 노던 블로팅(RNA의 경우) 또는 서던 블로팅(DNA의 경우)과 같은 블로팅 절차, 유전자 발현의 변화를 감지하거나 유전 질병의 선별 검사 또는 특정 병원체의 식별(분자 진단)에 사용되는 마이크로어레이의 형광물질 결합 배열이 있습니다.

올리고 치료법/유전자 요법

치료법 Application에서는 일반적으로 20-30 mer의 종인 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)가 천연 생물학을 이용하여, 원치 않거나 과다 활성인 RNA 배열의 유전자 억제 또는 유전자 침묵(파괴)을 촉진하는데, 이를 통해서 질병을 야기하거나 촉진할 수 있는 손상되거나 과다활성인 특정 단백질의 발현을 차단합니다. 올리고뉴클레오타이드 기반 치료법에 대한 연구는 비약적으로 증가해 왔으며 최근 몇몇 약물이 승인되었습니다.

앞으로의 합성 뉴클레오타이드 사용: DNA 및 RNA 백신 유형의 모색

엄격한 정의에 의하면 올리고뉴클레오타이드가 아니지만, 수백 또는 수천 개의 염기 길이를 가진 mRNA 또는 플라스미드 또는 벡터 기반 핵산과 같은 DNA 또는 RNA 기반 백신 약품들은 발전하고 있는 합성 뉴클레오타이드 기술의 최첨단을 대표합니다.

개념적으로 DNA 또는 RNA 백신은 병원체 세균 또는 바이러스의 불필요하거나 해로운 모든 부분을 없앨 수 있습니다. 그 대신 이러한 핵산 기반 백신은 병원체의 DNA 또는 RNA의 일부에만 해당하는 코드를 포함합니다. 이 DNA 또는 RNA 가닥들은 환자의 면역 체계에 지시를 내려 개별 항원 또는 병원체의 조각을 생성하도록 합니다. 현대적 컴퓨팅 및 가상환경(in silico) 모델링을 통해, 이 올리고뉴클레오타이드 백신 유형은 설계할 적절한 표적 배열만 주어지면 수일 또는 수주만에 만들어 낼 수 있습니다. 플랫폼 기술로서의 핵산 기반 백신은 재료 또는 원료 물질의 표준 세트를 활용해 무수한 조합을 거의 원하는 대로 만들어 낼 수 있습니다. 또한 이 백신은 기존의 백신 유형에 비해서 상대적으로 저렴하고 생산이 쉽습니다. 그러나 아직 바이오제약 산업의 패러다임은 성숙 단계에 있으며, 새로운 어려움들이 계속 나타나고 있는데 그 중 일부는 올리고 및 긴 핵산 약품에 특수한 것이고 일부는 다른 바이오치료 유형에도 공통된 것입니다.

올리고뉴클레오타이드 합성은 뉴클레오타이드가 특수하게 연결되어 원하는 배열의 산물을 형성하도록 하는 화학 공정입니다. Packed-bed 컬럼을 사용한 연속 고체상 합성이 올리고뉴클레오타이드 생산에 일반적으로 사용됩니다. 일부의 경우에는 단일 배치의 슬러리 반응이 채용됩니다.

표적 올리고머 배열의 생산 공정은 특수한 합성 단계로 구성된 여러 주기가 필요합니다. 첫 단계에서는 고체상 지지 뉴클레오타이드에 있는 4,4’ 디메톡시트리틸 보호기를 제거합니다. 그 다음 포스포아미다이트 모노머가 활성화되고 고체상 결합 뉴클레오타이드에 있는 유리 하이드록실기를 통해 신속히 결합하여 아인산염 트리에스테르 연결을 포함한 다이뉴클레오사이드를 생성합니다. 세 번째 단계에서는 아인산염 트리에스테르가 산화됩니다. (첫 번째 주기의) 마지막 단계에서는 반응하지 않은 모든 지지 뉴클레오사이드를 아세틸화를 통해 “캡핑(capping)”하여 다음 주기에서 원치 않는 부산물이 형성되는 것을 방지합니다.

올리고뉴클레오타이드의 길이는 배열을 구성하는 뉴클레오타이드의 수로 정의됩니다. 명명법의 측면에서 20개 뉴클레오타이드 길이의 배열은 “20 mer”로 정의됩니다. 올리고 길이는 다양한 Application에 매우 중요합니다. 예를 들어 PCR에서는 짧은 mer의 올리고가 일반적으로 사용되는 반면, 클로닝 또는 CRISPR 편집과 같이 까다로운 Application에서는 매우 긴 배열(200개 이상의 염기)이 사용됩니다. 특수한 긴 mer의 올리고를 합성하는 것은 어려우며, 순수한 배열을 전달하려면 효과적인 합성 제어와 정제 방법이 필요합니다. 평균적으로 대부분의 올리고는 길이가 60 mer 미만입니다. 올리고를 합성하는 방법은 추가적인 뉴클레오타이드를 첨가하는 반복 반응 주기를 필요로 하기 때문에, 필요한 배열이 길수록 원치 않는 부산물이 형성될 가능성이 높아지고, 여기에는 배열의 삭제 또는 절단이 포함될 수 있습니다 .

품질, 수량 및 비용 목표에 따라 다양한 정제 방법이 사용됩니다. 예를 들어 무염분 올리고는 화학 합성의 부산물이 제거되지만 배열 실패는 남습니다. 이러한 탈염분 올리고는 PCR과 같이 더욱 일상적인 Application의 비용과 효과성 측면에서 유용합니다.  더욱 까다로운 Application의 경우, 역상 크로마토그래피는 산물에서 원치 않는 배열을 제거하지만, 고순도의 배열 산물을 제공하는 겔 전기영동법만큼 효과적이지 않으나 제한적인 수량에서는 일반적입니다. 특히 임상 분야의 관심사인 수율 유지는 합성 및 다운스트림 공정에서 언제나 관심사였습니다.

전형적인 고체상 화학 합성은 일반적으로 반응 조건의 영향을 받지 않는 특수 유리 비드 또는 폴리머의 사용을 포함했습니다. 이러한 구슬은 반응물, 시약 및 용제가 흐르는 컬럼 안에 들어 있을 수 있습니다. 이 비드의 용도는 기질 분자가 공유 결합한 후 화학 반응에 의해 작용하는 플랫폼 역할을 하는 것입니다. 기질 분자에 있는 특정 작용기의 보호 및 보호 해제는 합성과 원하는 산물 획득에 중요한 역할을 합니다. 합성 산물은 산물과 기저 폴리머 비드 간의 결합을 화학적으로 끊어서 제거합니다. 

고체상 합성은 합성의 여러 단계에서 불순물과 미반응 물질이 씻겨 나가기 때문에 정제 산물을 빠르게 얻는 데 효과적입니다. 또한 전체 합성을 컴퓨터 제어 및 자동화를 통해 처리할 수 있습니다.  고체상 합성은 맞춤형 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드 생산에 채택되는 가장 일반적인 방법입니다. 후자의 경우, 표적 배열을 형성하기 위해 뉴클레오타이드를 순서대로 첨가하려면 다수의 반복 주기가 필요합니다. 

고체상 올리고뉴클레오타이드 합성에는 사슬 길이가 증가함에 따른 수율 감소를 비롯한 많은  어려움이 있습니다. 하나 이상의 표면 고정 가닥이 그 옆 가닥의 잇따른 연장 각각을 방해하는 경우 수율 불량의 메커니즘으로 입체 장해가 가설이 되는 경우가 많습니다 . 

이러한 어려움과 그 외의 어려움을 처리하기 위해, 다양한 액체상 올리고뉴클레오타이드 합성 방법이 있습니다. 

액체상 합성의 기본 단계 중 다수는  고체상 합성과 유사합니다. 주요 차이점은 합성이 용액 또는 액체상에서 이루어진다는 점입니다(즉, 어떠한 표면에도 고정되지 않음). 이 공정도 마찬가지로 주기 내에서 진행되기 때문에, 올리고뉴클레오타이드 산물의 연장을 유지하는 동시에 미반응 시약을 제거하기 위해 수반되는 몇 가지 방법이 있습니다.

올리고뉴클레오타이드 합성에 PCR을 사용하는 기술은 1985년에 확립되었습니다. 1986년에는  Taq 폴리메라아제 효소를 사용하는 방법이 처음 소개되었습니다. 그러나 산업용 올리고뉴클레오타이드 합성은 세 가지 중요한 이유로 인해 효소 올리고뉴클레오타이드 합성을 채택하는 데 어려움이 있었습니다.

1. 효소 합성에는 배열 확장 DNA 폴리메라아제 효소가 작동할 수 있는 템플릿이 필요합니다. 따라서 효소에 의한 데노보 올리고뉴클레오타이드 합성은 템플릿 없이는 수행할 수 없습니다. 
   
2. 템플릿으로 사용될 수 있는 올리고 프라이머, 프로브 또는 ASO 표적 중 다수는 폴리메라아제 합성을 효과적으로 프라이밍 및 유발하기에는 그 자체가 너무 짧습니다 .
   
3. 많은 치료용 인공 올리고는 체액 순환 내에서 반감기 연장과 기능 강화를 촉진하기 위해 화학적으로 변형되며, 이러한 변형은 점진적으로 유도되는 폴리메라아제와의 상호작용을 거의 또는 완전히 억제합니다(이는 대부분 mRNA와 같이 긴 종과 관련이 있음).

화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 스톡을 사용하여 ASO 합성이 가능한 변형 폴리메라아제에 대한 연구 및 개발이 이어지고 있습니다.

올리고뉴클레오타이드 합성의 복잡한 특성은 고수준의 공정 관찰, 반응 메커니즘 및 이탈의 이해, 그리고 실행 가능한 제어에서 이익을 얻을 수 있습니다. PAT를 사용한 실시간 분석은 시간 소모적이고 느린 오프라인 분석의 필요성을 최소화하거나 없앨 수 있습니다.

• ReactIR 및 ReactRaman은 올리고뉴클레오타이드 합성 반응의 동역학 및 실행 간의 비교를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
• EasyMax 자동 화학 합성 반응기를 통한 정밀한 온도, 교반 및 분주 제어는 반응 추세와 메커니즘의 통합과 함께 데이터 수집을 촉진하며  iC 소프트웨어를 통해 쉽게 관리할 수 있습니다.

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy, and Qunying Dai, "Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides", Organic Process Research and Development (2015), 19, 203-214.

저자들은 자동 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성에 대한 프로토콜이 잘 확립되어 있지만 관련된 화학이 어렵고 가격이 높다는 점을 언급합니다. 제조에서 파악된 주요 위험에는 다음이 포함됩니다.

• 합성기의 지정 입력 포트에 올바르지 않은 화학 용액이 연결됨
• 용액의 올바르지 않은 수량 준비
• 합성기와 관련된 기계적 또는 기타 알 수 없는 원인으로 인해 발생할 수 있는 오류

이러한 위험을 파악하고 그 위험에 반응하지 않으면 공정의 완전한 손실로 이어질 수 있습니다. 따라서 중적외선 데이터에 기반한 명확하고 정량적인 MSPC 모델링과 결합한 실시간 분광광도계 모니터링이 평가되었습니다. ReactIR은 합성 공정에 대한 실시간 보장 및 제어를 가능하게 하고 올리고뉴클레오타이드의 자동 합성을 개선하는 것으로 나타났습니다. 특히 이 접근법의 민감도, 정보 깊이, 넓은 범위 및 경험적 접근성은 이 화합물들과 관련된 제조의 여러 주요 어려움에 즉시 적용할 수 있는 것으로 나타났으며, 그러한 어려움 중 가장 중요한 것은 온라인 배열과 순도 확인입니다.

유동 조건에서 수행되는 화학에 대한 현장 FTIR 및 라만 분광법의 실시간 모니터링 능력은 잘 입증되어 있으며, 올리고뉴클레오타이드 합성의 주요 단계에 적용이 가능합니다.

• 구조 및 순도를 보장하기 위한 뉴클레오타이드 모노머의 합성
• 합성기의 기계적 문제 또는 올바르지 않은 용액 투입으로 인한 위험 완화
• 고체상 결합 뉴클레오타이드의 유리 하이드록실기에 대한 포스포아미다이트 모노머의 결합 반응 추적
• 이중 가닥 합성에서 보완 올리고뉴클레오타이드의 변성 및 어닐링 추적
• 어닐링 공정에서 화학 반응 동역학 결정 – 중간 생성물 또는 알 수 없는 생성물의 식별 및 추적
• 스펙트럼의 변화를 공정 내 주요 지점과 연관시킴
• SPS, 배치 및 수렴 펩타이드 합성에 적용 가능(SPS + 용액상)

잘 제어된 합성 환경은 반응 결과를 보장하는 데 필수적입니다. 자동 반응기 플랫폼은 모든 중요 공정 파라미터에 걸쳐 확신성과 일관성을 동시에 제공합니다.

• 재현 가능한 환경은 우수한 과학의 기초입니다.
• 센서와 인라인 PAT의 데이터를 결합함으로써 공정 파라미터가 중요 품질 속성에 미치는 영향을 이해합니다
• 프로토콜과 자동화는 수동 위험 또는 비일관성을 완화합니다
• 검색 가능하고 구조화된 데이터를 촉진합니다
• 확장에 대한 수십 년의 인용 및 증거에 기반합니다
• SPS, 배치 및 수렴 펩타이드 합성에 적용 가능(SPS + 용액상)