단백질 결정화

단백질 결정화는 복잡한 거대분자에 대해 구조화되고 질서 있는 격자를 생성하는 행위와 방법입니다. 단백질은 일반적으로 고체 상태에서 비정질이며 변성되기 쉽지만, 결정 격자 내에 존재하는 단백질은 변성에 저항하고 더 큰 안정성을 가집니다. 단백질은 적절하고 적합한 환경에 놓이면 결정화될 수 있습니다. 단백질 결정화는 단백질 결정화 과정에 영향을 미치는 변수들의 매우 복잡한 상호작용 때문에 과학만큼이나 예술로 간주됩니다.

단백질 결정을 만드는 가장 일반적인 이유는 구조 생물학 연구를 지원하기 위해서이며, 일반적으로 X-선 회절 결정학을 통해 이루어집니다. 연구자들은 단백질의 3차원 구조를 이해함으로써 효소, 기질 및 리간드가 어떻게 상호작용하는지 더 잘 이해할 수 있도록 다른 분자와 상호작용할 수 있는 영역을 시각화할 수 있습니다. 더 나아가, 결정화는 다른 단백질이나 불순한 생물학적 물질로부터 오염되지 않은 순수한 단백질을 만드는 효과적인 방법으로, 준비 크로마토그래피에 대한 대안적인 정제 및 분리 수단을 제공합니다.

결정화는 각각의 공정 매개변수 선택에 따라 독특하게 영향을 받는 상호 의존적인 일련의 메커니즘을 통해 진행됩니다: 핵생성, 성장, 오일링 아웃, 응집, 파손, 시딩 및 다형성 전이.

이 메커니즘들은 종종 동시에 발생하여 효과적인 결정화 설계를 어렵게 만듭니다. 메커니즘에 대한 이해가 없으면 과학자들은 시행착오를 통해 공정 매개변수를 조정하고 수율, 순도 및 결정 크기를 최적화합니다. 결정화 중 어떤 메커니즘이 발생하는지 이해함으로써 과학자들은 원하는 특성을 가진 결정 제품을 제공하기 위한 전략을 사용할 수 있습니다.

단백질은 치료용 의약품으로 점점 더 중요해지고 있습니다. 그러나 필요한 안정성을 가진 단백질을 생산하는 데는 제품 변동, 효능 저하를 초래할 수 있는 구조 손실, 잠재적으로 위험한 부산물 형성 등 주요 과제가 있습니다. 단백질 결정화는 순수하고 안정적인 고형 제형 및 단백질 결정과 관련된 여러 주사 및 주입 치료제를 생산하는 방법입니다. 과거에는 단백질 결정화가 X-선 결정학을 지원하는 실험실 활동이었으나, 단백질 기반 치료제의 기하급수적 성장으로 인해 단백질 결정화를 생산 수준으로 확장하는 것이 점점 더 중요해지고 집중적인 연구 분야가 되고 있습니다.

단백질 결정화의 스케일업은 실험실 규모에서 결정화된 의약품 물질의 중요한 품질 속성(CQA)을 달성하기 위해 중요한 공정 매개변수(CPP)를 최적화해야 한다는 점에서 소분자 결정화와 근본적으로 유사합니다. 단백질 결정화 공정 개발 및 스케일업을 위한 총체적 플랫폼은 일반적으로 다음을 포함합니다:

• 현장 입자 시스템 특성화
• 분광학적 모니터링 및 다형성 특성화
• 통합 모듈 및 센서를 통한 절차 최적화 및 피드백 제어 전략

단백질 결정화와 관련된 주요 제약 응용 분야는 다음과 같습니다: 구조 생물학을 통한 의약 화학, 단백질 약물 개발, 스케일업, 분리 및 정제, 제형 및 약물 전달.

• 구조 생물학을 통한 의약 화학. 단백질 결정화 기술의 발전과 향상된 X-선 결정학 덕분에 수만 건의 3차원 단백질 구조가 밝혀졌습니다. 이러한 복잡한 거대분자의 구조를 결정하고 결합 부위를 시각화함으로써 약물-수용체 상호작용을 매우 상세히 이해할 수 있습니다. 이 정보는 단백질 억제제, 알로스테릭 활성제, 보조 인자 및 효소 촉매 부위 또는 '활성 부위'에 대한 분자 수준의 이해를 가능하게 하여 효능이 향상된 더 나은 약물을 개발하는 데 기여합니다. 결정학을 통해 단백질-억제제 구조를 이해하는 것의 중요성은 HIV 프로테아제 개발의 큰 진보에서 잘 나타납니다.
• 단백질 기반 치료제의 개발, 스케일업, 분리 및 정제. X-선 결정학을 위한 단일 단백질 결정 성장 외에도 제약 산업은 단백질 결정 기반 치료제 개발에 노력을 기울이고 있습니다. 이러한 응용의 목표는 순수하고 안정적인 단백질 결정을 대량으로 개발하고 스케일업하는 것으로, 적절한 입자 크기와 잘 제어된 입자 크기 분포를 갖추는 것입니다. 준비 크로마토그래피에 비해 단백질 결정화는 거대분자의 분리 및 정제와 키랄 분자 분리에 비용 효율적인 대안이 될 잠재력이 있습니다. 단백질 결정화 스케일업 도구는 CPP와 CQAs에 미치는 영향을 이해해야 하는 화학 반응 스케일업 도구와 유사합니다.
• 제형 및 약물 전달. 단백질 치료제는 용액 형태로 투여되며 주사 또는 주입을 통해 전달될 수 있습니다. 많은 양의 단백질을 투여해야 하기 때문에 주입되는 단백질 용액은 점도 및 응집 문제를 피하기 위해 희석됩니다. 이는 전체 치료를 주입하는 데 걸리는 시간 때문에 환자와 병원 모두에게 덜 편리하며, 경피 투여 형태의 낮은 환자 순응도 현상에 기여할 수 있습니다. 현탁액 내 단백질의 결정 형태 사용은 점도 문제를 줄이고 더 높은 농도로 전달할 수 있기 때문에 큰 관심을 받고 있습니다. 또 다른 중요한 점은 주사 또는 주입 바늘을 쉽게 통과할 수 있도록 단백질 결정의 크기를 신중하게 제어해야 한다는 것입니다. 또한 재구성 중에 용해되지 않는 잔류 결정은 혈관 내 모세혈관 축적으로 인한 부작용을 일으킬 수 있는 임계 입자 크기를 초과하지 않아야 하며, 일반적으로 15 µm 이상의 상당한 입자 수를 최소화해야 합니다. 

1. 적절한 용매를 선택하세요. 일반적으로 고려되는 사항은 용질이 얼마나 용해될 수 있는지(용해도), 용매를 다루는 것이 얼마나 실용적인지(안전성), 그리고 용매가 펩타이드나 단백질의 안정성과 자유 에너지 상태에 어떤 영향을 미치는지입니다.
2. 과포화를 달성하세요. 용매나 완충액에서 용해 가능한 펩타이드/단백질 의약품 물질을 최대 허용 한도(보통 변성에 의해 제한됨)까지 가열합니다. 용액은 과포화 상태가 됩니다.
3. CPP를 제어하여 제품을 결정화하세요. 냉각, 항용매 첨가, 증발 또는 반응을 통해 용해도를 감소시킵니다. 용해도가 감소함에 따라 결정이 핵생성되고 성장하는 지점에 도달합니다. 높은 자유 에너지를 가진 모티프가 대체 구조나 비결정 구조를 형성할 수 있지만, 이는 CPP를 신중하게 제어해야 하며 실제로 가능한 경우에만 예방할 수 있습니다.
4. 시스템이 평형에 도달하도록 허용하세요. 이는 의약품 고체의 수율을 극대화하기 위해 수행됩니다.
5. 정제된 제품을 여과하고 건조하세요.

단백질 결정을 성장시키기 위해 여러 방법이 사용되며, 가장 일반적인 방법은 증기 확산법과 마이크로배치법입니다. 전자는 행잉 드롭과 시팅 드롭이라는 두 가지 변형이 있으며, 기본적으로 동일한 방식으로 작동합니다. 밀폐된 시스템에서 단백질, 완충액 및 침전제가 포함된 용액 한 방울이 단백질이 없는 동일한 용액의 더 높은 용질 농도를 가진 저장 용액과 평형을 이룹니다. 단백질이 포함된 방울에서 물이 증발하여 저장 용액의 높은 농도 쪽으로 이동합니다. 방울 내 용질 농도가 증가함에 따라 단백질이 결정화되기 시작합니다. 마이크로배치법에서는 단백질과 기타 시약이 미네랄 오일의 얇은 층 아래에 도입되어 수분 확산을 차단합니다. 마이크로배치는 결정화가 일어나도록 필요한 모든 성분이 올바른 안정 농도로 포함된 작은 반응기와 같습니다.

단백질을 결정화하는 데 필요한 적절한 시약, 매개변수 및 조건을 찾는 것은 종종 경험적이므로, 성공적인 단백질 결정화를 위한 가장 실용적인 방법은 이전 경험을 바탕으로 다양한 실험 조건을 사용하는 것입니다. 가장 쉬운 방법은 완충액, 침전제 등이 포함된 다중 웰 플레이트에 포장된 상업용 단백질 결정 스크리닝 키트를 사용하는 것입니다. 행잉 드롭 증기 확산법이 이러한 키트로 결정 성장을 위해 적용됩니다. 대규모 스크리닝이 필요한 경우, 마이크로배치법을 자동화하는 고처리량 시스템이 있어 시간과 수고를 절약하고 동시에 필요한 정제 단백질 양을 최소화합니다. 제약 또는 산업용 대규모 단백질 결정화에는 스크리닝 실험에서 얻은 정보가 현장 실시간 PAT가 특징인 대규모 자동화 반응기 시스템에 적용되는 기초가 됩니다. 

공정 개발 및 제조 지원을 위해 단백질을 성공적으로 결정화하는 데 가장 중요한 초기 단계 중 하나는 고도로 정제되고 잘 특성화된 단백질을 충분히 확보하는 것입니다. 단백질이 순수한 것(즉, 발효 매트릭스의 불순물과 같은 오염물이 없는 것) 외에도, 단백질은 용액 내에서 균질하고 안정적(또는 안정화된)이어야 합니다:

• 최소한의 응집 (그림 A)
• 올바른 2차, 3차 및 4차 구조 (그림 B)
• 모든 접합체 또는 재조합 변형 (그림 C)

또한, 단백질 결정화 공정에 사용되는 모든 시약과 용매는 오염물이 없어야 하며, 이는 핵생성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

소분자 결정화와 유사하게, 단백질은 과포화 용액에서 결정화됩니다. 견고한 결정 격자를 형성하는 소분자의 경우, 온도 조절이 과포화를 달성하는 주요 수단이며, 이는 단백질에도 유용합니다. 그러나 단백질 결정은 일반적으로 결정 구조의 일부로 용매를 포함하고 온도에 민감하며 변성 및 응집에 취약하므로 허용되는 온도 범위가 제한적입니다.

소분자는 입체적 자유도가 훨씬 적어 결정화가 훨씬 쉽습니다. 대분자 펩타이드는 내부에 산성, 염기성, 극성, 비극성 상호작용과 반발력이 많아 정돈된 결정화를 저항하며, 이는 더 큰 단백질에서 더욱 심화됩니다. 대부분의 결정화에 적합한 펩타이드는 구조 모티프를 고정하는 데 중요한 다수의 이황화 결합을 포함합니다. 분자의 분자 내 무질서 정도나 구조 변이 가능성은 펩타이드나 단백질이 침전물이 아닌 결정을 형성할 수 있는지를 결정하는 중요한 속성입니다. 분자가 결정화에 적합한 특성을 가지고 있더라도, 공정의 상업적 실현 가능성에 영향을 미치는 여러 공정 매개변수가 있으며 이를 특성화해야 합니다.

온도 외에도, pH 조정, 용액의 이온 강도, 단백질 용해도를 감소시키는 염 및 PEG와 같은 침전제 첨가, 존재하는 리간드 유형 등 과포화를 통한 단백질 결정화에 영향을 주거나 도움을 주는 여러 요인이 있습니다. 핵심은 단백질의 정상적인 특성을 방해하지 않는 환경 내에서 용액을 과포화 상태로 만드는 것입니다. 이는 올바른 형태, 순도 및 허용 가능한 성장 속도를 가진 결정을 얻기 위한 변수 및 조건 세트를 찾는 것이 중요함을 의미합니다.

단백질 결정화는 상호 의존적인 일련의 메커니즘을 통해 진행됩니다:

1. 핵생성
2. 성장
3. 결정화에서의 오일링 아웃
4. 응집
5. 파쇄
6. 시딩
7. 다형성 화학

과학자들에게 종종 숨겨진 이러한 메커니즘은 결정화 과정의 결과를 정의하는 데 지배적인 역할을 합니다.

단백질 기반 치료제의 결정화 개발 및 스케일업은 결정화 과정에 영향을 미치는 변수와 조건에 대한 심층적인 이해가 필요합니다. 다른 결정화와 마찬가지로 원하는 결정 형태, 모양, 입자 크기 및 크기 분포를 달성하려면 일관된 제품 품질을 위해 신중한 제어가 필요합니다. 단백질 결정 현탁액의 CQA(핵심 품질 속성) 변동은 치료 효능에 직접적인 영향을 미칩니다. 단백질 결정은 성장 환경에 매우 민감하며 과도한 온도, 용매 손실 및 기타 외부 스트레스 또는 샘플링 과정에서도 쉽게 손상될 수 있으므로, 결정이 용액 환경에서 제거되지 않은 상태에서 CPP(핵심 공정 매개변수)와 제품 품질을 현장에서 측정하는 것이 바람직합니다.

• EasyMax 및 OptiMax 자동화된 화학 반응기는 온도, pH, 전도도, 교반 속도 및 완충제와 부형제의 투여량 등 단백질 결정화의 성공적인 개발 및 스케일업에 중요한 매개변수의 정밀한 제어, 조정 및 기록을 가능하게 합니다
• 프로세스 편차를 모니터링, 문제 해결 및 수정하는 데 도움이 되는 현장 분석 기술 도구도 유용합니다
  • 현장 라만 분광법 및 FTIR 분광법은 시약 농도를 추적하고 결정 구조 성장을 모니터링하며 과포화 용액의 농도도 측정합니다
  • ParticleTrack (FBRM 포함) 기술은 결정화 과정의 주요 단계가 진행됨에 따라 결정 크기와 크기 분포 변화를 실시간으로 모니터링합니다
  • EasyViewer는 결정화 과정이 진행되는 동안 시각화 및 이미지 분석을 가능하게 합니다

자동화된 실험실 반응기와 실시간 현장 분석기를 함께 사용할 때, 응집, 성장, 응집, 파쇄 및 형태 변화와 같은 결정화 메커니즘에 대한 공정 매개변수의 영향을 확인할 수 있습니다. 결정 형성 진행 상황을 지속적이고 현장에서 모니터링하면서 결정화 과정을 정밀하게 제어하면 최적화 및 스케일업을 사실 기반 및 데이터 중심으로 수행할 수 있습니다.

EasyMax 자동화 실험실 반응기는 단백질 결정화에서 매개변수 최적화를 위한 완벽한 작업 공간으로, 개발 및 스케일업 설계와 실행을 지원합니다. 이 완전 자동화 시스템은 공정 매개변수에 대한 정밀한 제어를 가능하게 합니다.

• 투여 속도, 온도, 교반, pH 및 전도도를 포함한 CPP 관리
• ReactIR (FTIR), ReactRaman (라만), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (현장 이미지 분석) 등 결정화 현장 분석기와 손쉽게 통합
• iC 소프트웨어는 모든 실험과 주변 장비의 자동 실행 및 제어뿐만 아니라 완전한 데이터 캡처 및 기록 보관을 지원

ReactIR는 중적외선 분광법을 사용하여 결정화 연구에서 용액 상을 측정합니다. ReactIR 측정은 현탁 고형물, 기포 또는 기타 입자 질량에 영향을 받지 않습니다.

• 개별 결정화 용질을 현장에서 실시간으로 추적합니다.
• 과포화 연구를 지원하기 위해 용액 농도를 측정합니다
• 실시간 의사 결정 및 제어를 위한 실행 가능한 데이터 분석을 제공합니다

ReactRaman은 라만 분광법을 사용하여 용액 내 입자의 분자 분석을 제공합니다

• 결정 성장, 구조 및 형태를 비파괴적으로, 현장에서, 실시간으로 추적합니다
• 매개변수 영향을 결정하고 품질 목표 달성을 위한 결정화 조건 및 변수를 최적화합니다

ParticleTrack는 Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) 기술을 사용하며, 광학 기반 프로브 장비로서 용기에 직접 삽입되어 실시간으로 변화하는 입자 크기와 수를 추적합니다. ParticleTrack은 코드 길이 분포 측정을 통해 결정 크기 분포(CSD)를 얻습니다.

• 실험 조건이 변화함에 따라 단백질 결정을 지속적으로 모니터링합니다
• 시료 제거 없이 실시간으로 배치 또는 연속 성장 과정을 추적합니다
• 핵생성, 응집, 다형성 및 기타 시스템 속성에 영향을 미치는 조건을 특성화합니다

EasyViewer는 용기에 직접 삽입되는 프로브 기반 장비로, 입자 시스템의 이미지를 캡처합니다. EasyViewer는 이미지 분석을 수행하며, 공정의 시간 해상도 인라인 이미지에서 입자 수, 크기 분포 및 형태를 측정하여 개체군의 변화를 시간에 따라 추적할 수 있습니다.

• 실험 조건이 변화함에 따라 단백질 결정을 지속적으로 모니터링합니다
• 시료 제거 없이 실시간으로 배치 또는 연속 성장 과정을 추적합니다
• 핵생성, 응집, 다형성 및 기타 시스템 속성에 영향을 미치는 결정화 매개변수를 실시간으로 시각화합니다

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). 생물의약품 결정화의 실시간 모니터링: 라이소자임, rHu 인슐린 및 비타민 B12에 대한 코드 길이 분포에서 결정 크기 분포로의 변환. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

저자들은 생물의약품 결정화를 실시간으로 효율적으로 모니터링하는 방법을 개발하는 데 성공했다고 보고했습니다. 이 절차는 ParticleTrack를 사용하여 정적 및 동적 조건 모두에서 일련의 생물의약품 분자의 CLD를 측정하고, 수학적 모델링을 적용하여 CLD를 CSD로 변환합니다. 조사된 생체분자는 결정화의 실험 조건에 따라 다른 결정 형태를 가집니다. 라이소자임은 사각기둥형과 바늘형 결정을 생성할 수 있고, rHu 인슐린은 마름모꼴 결정을 형성하며, B12는 다면체 결정을 형성합니다.

저자들은 낮은 종횡비의 사각기둥형, 마름모꼴, 다면체 결정과 높은 종횡비의 바늘형 결정에 대해 CSD를 결정하는 모델을 개발했습니다. 저자들은 결정 크기 분포를 결정하기 위해 세 가지 다른 모델을 사용했습니다:

• 다른 연구 그룹에서 개발한 모델로, 결정을 구(구형 등가 직경, SED)로 표현하는 가정을 한 모델은 낮은 종횡비 결정에 효과적이었습니다
• 높은 종횡비 결정의 경우, 본 연구의 저자들은 폭 기반 모델을 개발했습니다
• 마지막으로, 종횡비를 지정해야 하는 길이 기반 모델을 개발했습니다

FBRM 측정에서 계산된 CSD 모델의 결과는 이미지 분석을 통해 얻은 CSD 측정값과 비교되었습니다.

불투명한 결정 슬러리를 모니터링하는 것은 특히 제조 사양이 좁은 입자 크기 분포(PSD)를 요구할 때 도전 과제를 제시합니다. 주사 가능한 단백질 결정 제형의 경우, PSD는 점도에 큰 영향을 미치며, 응집 또는 기타 분해 현상에 대한 조기 경고 신호로 작용하여 제형을 손상시킬 수 있습니다. 현장 모니터링은 인간 성장 호르몬(hGH) 결정 형성과 성장을 특성화하기 위한 스케일업 배치 결정화 연구에 사용되었습니다. 실시간 분석은 용기 간 혼합 차이로 인한 일반적인 PSD 프로필에서 벗어난 변화를 감지했습니다. 이는 이후 오프라인 이미지 분석(IA)으로 확인되었습니다.

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). 제약 제조에서의 연속 결정화 공정: 리뷰. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). 집중 빔 반사 측정을 이용한 확률적 적분에 의한 확률적 초기 핵생성 동역학의 파라미터 추정. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). 생물의약품 결정화 실시간 모니터링: 라이소자임, rHu 인슐린, 비타민 B12의 코드 길이 분포에서 결정 크기 분포까지. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). 이온성 액체를 이용한 라이소자임 결정화 및 용액 내 초분자 자기 배열 조작. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). 연속 단백질 결정화에서 결정 형태의 모델링 및 제어. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). 연속 단백질 결정화에서 결정 생산 속도 향상 및 다분산성 감소. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). 생물의약품 전달을 위한 단백질 결정. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301