단백질 결정화

단백질 결정화란 복잡한 거대분자에 대해 구조화되고 정렬된 격자를 생성하는 행위 및 방법을 말합니다. 단백질은 일반적으로 무정형의 고체로서 탈수현상이 발생하기 쉬운 반면, 결정질 격자에 존재하는 단백질은 탈수현상에 저항성이 있고 고도의 안정성을 지닙니다. 단백질이 적합하고 유리한 환경에 존재하는 경우 결정을 형성할 수 있습니다. 단백질 결정화 공정에 영향을 주는 변수와의 고도의 복잡한 상호작용으로 인해 단백질 결정화는 과학만큼이나 상당한 기술로 인식되고 있습니다.

단백질 결정을 생성하는 가장 일반적인 이유는 일반적으로 엑스선 회절 결정학(x-ray diffraction crystallography)을 통해 구조 생물학 연구를 뒷받침하기 위함입니다. 연구자들은 단백질의 3차원 구조를 이해함으로써(예를 들어 효소, 기질 및 리간드의 상호작용 방식의 보다 나은 이해) 다른 분자와의 상호작용을 허용하는 프레임워크 영역을 시각화할 수 있습니다. 더 나아가 결정화란 다른 단백질 또는 외부 생물학적 물질로부터 오염물이 제거된 순수 단백질을 생성하여 예비 크로마토그래피를 대체하는 정제 및 분리 방법을 제공하는 효과적인 방법입니다. 

단백질은 치료제로서 그 중요성이 날로 증가하고 있습니다. 하지만 안정성이 필수적인 단백질을 생산하는 데에는 생성물 변화, 효율성 감소를 초래할 수 있는 구조 상실 및 잠재적으로 유해한 부산물 형성을 포함하는 주요한 문제를 제기합니다. 단백질 결정화는 순수하고 안정적인 고체 제형과 단백질 결정과 관련된 다수의 주사 및 주입 치료제를 생산하는 방법입니다. 단백질 결정화는 과거에 X선 결정학을 뒷받침하는 실험실 활동으로 사용되었으나, 단백질 기반 치료제의 기하급수적인 증가로 인해 단백질 결정화를 생산 수준으로 확장하는 것이 날로 중요해지고 집중적인 관심분야로 확립되었습니다.

단백질 결정화의 스케일업은 상업적 규모에서 결정화된 원료의약품의 중요품질특성(CQAs)을 달성하기 위해 실험실 규모에서 중요공정변수(CPPs)를 최적화하기 위한 요구사항에서 저분자 결정화와 기본적으로 유사합니다. 단백질 결정화 공정 발전과 스케일업을 위한 전체적인 플랫폼은 일반적으로 다음을 포함합니다.

• 현장(In-situ) 입자 시스템 특성화
• 분광 분석 모니터링 및 다형성 특성화
• 통합 모듈과 센서를 통한 절차와 피드백 제어 전략을 통한 최적화

단백질 결정화와 관련된 주요한 제약 Application으로는 구조 생물학을 통한 의약화학, 단백질 약물 개발, 스케일업, 분리 및 정제, 조제 및 약물 전달이 있습니다.

• 구조 생물학을 통한 의약화학. 단백질 결정화 기법이 발전하고 X선 결정학이 개선됨에 따라 수만개의 3차원 단백질 구조가 감소하게 되었습니다. 이러한 복잡한 거대분자의 구조를 결정하고 결합 부위를 시각화함으로써 약물-수용체 상호작용을 매우 자세히 이해하는 것이 가능합니다. 이 정보를 통해서 분자 수준의 단백질 억제제, 알로스테리 활성제, 보조인자 및 심지어 효소 촉매 부위 또는 “활성 부위”에 대한 이해를 확대하여 효능이 개선된 보다 우수한 약물을 개발할 수 있습니다. 결정학을 통한 단백질 억제제 구조를 이해해야 하는 중요성에 관한 대표적인 사례는 HIV 단백질 분해효소의 개발이 상당히 발전함으로써 입증되었습니다.
• 단백질 기반 치료제의 개발, 스케일업, 분리 및 정제. 제약 산업은 X선 결정학을 위한 단일 단백질 결정을 생성하는 것 뿐만 아니라 단백질 결정 기반 치료제의 개발에 더 많은 노력을 기울였습니다. 이러한 Application의 목적은 입자 크기가 정확하고 입도 분포가 잘 관리되는 순수하고 안정적인 단백질 입자의 많은 양을 개발하고 스케일업 하는 것에 있습니다. 예비 크로마토그래피와 비교하여 단백질 결정화는 거대분자의 분리와 정제 및 카이랄 분자의 분리를 위한 비용 효율적인 대체 수단이 될 수 있는 가능성이 있습니다. 단백질 결정화 확대를 위한 도구는 CPP 및 CQA에 대한 그 영향을 이해하는 것이 요구되는 화학 반응을 확대하는 데 사용되는 도구와 유사합니다.
• 조제 및 약물 전달 단백질 치료제는 용약으로 투여되고 주사 또는 주입으로 전달될 수 있습니다. 많은 양의 단백질이 전달되어야 하므로 점성과 응집 문제를 피하기 위해 단백질 용액을 희석시킵니다. 약물 전체를 주입하는 데에는 일정 시간이 요구되므로 환자와 병원은 불편감을 느낄 수 있지만 그 어떤 형태의 비경구 투여를 준수하는 환자가 감소하는 현상에 기여할 수 있습니다. 이러한 조제는 점도 문제가 적고 고농도로 전달될 수 있으므로 현탁액에서 단백질의 결정 형태를 사용하면 이점이 증가합니다. 또다른 핵심사항으로는 현탁액이 쉽게 주사 바늘 또는 주입 바늘을 통과할 수 있도록 단백질 결정의 크기를 주의깊게 관리합니다. 또한 중요한 사항으로, 재구성 동안 용해되지 않는 모든 잔여 결정의 크기는 유해한 부작용을 일으킬 수 있는 중요 입자 크기를 초과해서는 안 되는데 그 원인은 혈관구조의 모세관 축적으로 인해 일반적으로 상당한 양의 입자 크기가 >15µm로 최소화되기 때문입니다. 

1. 적절한 용매를 선택하십시오. 일반적인 고려사항에는 용질의 용해량(용해도), 용매 취급의 실용성(안전성) 및 용매가 펩타이드 또는 단백직의 안정성과 자유 에너지 상태에 영향을 주는 정도가 포함됩니다.
2. 과포화를 달성합니다. 용매 또는 완충용액의 용해성 펩타이드/단백질 원료 의약품을 최대 허용된 허용오차(일반적으로 변성으로 제한됨)까지 가열합니다. 용액이 과포화됩니다.
3. CPP를 조절하여 생성물을 결정화합니다. 냉각, 반용매 첨가, 증발 또는 반응을 통해 용해도를 감소시킵니다. 용해도가 감소되면 결정 핵이 생겨 성장을 하는 지점에 이르게 됩니다. 고도로 순수한 생성물 결정은 증가시켜야 하지만 자유에너지가 높은 모티프는 대체 구조 또는 비결정 구조를 형성할 수 있으므로 이를 방지하려면 CPP가 심지어 실용적인 수준이라 하더라도 이를 주의깊게 조절해야 합니다.
4. 이 체계가 평형상태에 도달하도록 합니다. 이는 고체 약제품의 수율을 최대화하기 위함입니다.
5. 정화된 생성물을 여과 및 건조시킵니다.

단백질 결정 증가를 위해 사용되는 방법에는 몇 가지가 있으며 이중 가장 일반적인 방법으로는 증기 확산 및 마이크로 배치가 있습니다. 전자의 방법에는 걸이형 액적(drop) 분석법과 안착형 액적(drop) 분석법으로 설명되는 두 가지 변형이 있으며, 두 방법 모두 기본적인 작동 원리는 동일합니다. 밀봉된 시스템에서 단백질, 완충용액 및 침전물을 함유한 용액의 액적은 동일한 용액의 고농도 용질을 함유하지만 단백질은 함유하지 않는 저장용기와 평형을 이룹니다. 단백질을 함유하는 액적 용액에서 물이 증발되어 저장용기의 고농도 용액으로 모입니다. 액적의 용질 농도가 증가함에 따라 단백질이 결정화되기 시작합니다. 마이크로배치법에서 물의 확산을 제거하는 광유의 얇은 반응부 아래에 단백질과 다른 시약을 도입하여 함유됩니다. 마이크로배치란 기본적으로 결정화가 발생할 수 있도록 정확하고 안정적인 농도로 모든 필수 성분을 함유한 소형 반응기를 말합니다.

단백질을 결정화하는 것에 요구되는 정확한 세트의 시약, 파라미터 및 조건은 종종 경험적으로 확인되므로 단백질 결정화에 성공하기 위한 가장 실용적인 수단은 이전 경험에 기반하여 다양한 실험적 조건을 사용하는 것입니다. 이를 수행하는 데 가장 손쉬운 방법은 완충용액, 침전물 등이 멀티웰 플레이트에 담긴 사전 포장된 용액을 포함하는 상업적으로 사용가능한 단백질 결정 스크리닝 키트를 사용하는 것입니다. 걸이형 액적(drop) 증기 확산법은 이러한 키트를 사용하여 결정을 증가시키기 위해 적용됩니다. 대규모 스크리닝이 요구되는 경우 높은 처리량 시스템을 사용하여 마이크로배치법을 자동화함으로써 시간과 지루함을 줄이는 동시에 정제 단백질의 필요량을 최소화합니다. 제약 또는 산업 Application을 위해 대규모 단백질 결정화가 요구되는 경우, 스크리닝 실험에서 획득된 정보가 현장(In-situ)에서 실시간 PAT로 규명된 자동화된 대규모 반응기 시스템에서 Application을 위한 기초를 형성합니다. 

공정 개발 및 제조의 지원에 있어 단백질을 성공적으로 결정화하는 가장 중요한 초기 단계 중 하나는 고도로 정제되고 특성 규명이 명확한 단백질을 충분히 공급하는 것입니다. 단백질이 순수할 뿐만 아니라(즉, 발효 매트릭스의 불순물과 같은 이물질을 포함하지 않음), 단백질이 다음을 함유하는 용액에서 균질하고 안정적(또는 안정화됨)이어야 합니다.

• 최소의 응집(그림 A)
• 올바른 2차, 3차 및 4차 구조(그림 B)
• 모든 결합물 또는 재조합 변형(그림 C)

추가적으로 단백질 결정화 공정에 사용되는 모든 시약 및 용매는 핵형성에 상당한 영향을 줄 수 있으므로 이물질이 포함하지 않아야 합니다.

저분자 결정화와 유사하게 단백질은 과포화 용액에서 결정화됩니다. 저분자가 단단한 결정 격자를 형성하는 경우 온도 조절은 과포화를 달성할 수 있는 주요 수단이며 이는 단백질에도 유용하게 작용합니다. 하지만 단백질 결정은 일반적으로 결정 구조의 일부로서 용매를 포함하고, 온도에 민감한 반응을 자주 보이고, 변성 및 응집에 자주 발생하므로 온도 범위의 축소가 허용될 수 있습니다.

저분자는 입체적 자유도가 유의하게 작아서 결과적으로 훨씬 쉽게 결정화됩니다. 고분자 펩타이드는 보다 많은 내부 산성, 염기성, 극성, 비극성 상호작용 및 정렬된 결정화에 저항하는 반발력을 가지고 있으며 이러한 현상은 단백질의 크기가 커질수록 악화됩니다. 또한 대부분의 결정화와 호환되는 펩타이드에는 구조적 모티프를 고정하는 데 중요한 역할을 하는 많은 수의 이황결합을 포함합니다. 분자 내 불규칙과 구조의 변경 가능성의 정도는 펩타이드 또는 단백질이 침전보다는 결정화될 수 있는지 여부를 결정하는 중요한 속성입니다. 분자에 결정화를 수정할 수 있는 속성이 있는 경향이 있다 해도, 공정 상업적 중요성에 영향을 주고 특성이 규명되는 데에 영향을 주는 공정 파라미터는 많습니다.

온도 이외에 많은 다른 요소가 용액의 pH 조절 및 이온 강도를 포함하여 과포화를 통한 단백질 결정화에 영향을 주고/보조하며, 단백질의 용해도와 존재하는 리간드의 유형을 줄이기 위해 염과 PEG와 같은 침전제를 첨가합니다. 단백질의 일반적인 특성을 교란시키지 않는 환경 내에서 용액을 과포화시키는 것이 중요합니다. 이는 형태, 순도 및 허용가능한 성장률이 올바른 결정을 생성하는 변수와 조건을 세트를 확인하는 중요성을 내포합니다.

단백질 결정화는 일련의 상호의존적 메커니즘을 통해 진행됩니다.

1. 핵형성
2. 성장
3. 결정화에서의 오일링 아웃
4. 응집
5. 파손
6. 투여(Seeding)
7. 다형성 화학물질

종종 과학자에게 숨겨지는 이러한 메커니즘은 결정화 공정 결과를 정의하는 데 있어 중요한 역할을 합니다.

단백질 기반 치료제를 위한 결정화를 개발하고 스케일업하려면 결정화 공정에 영향을 주는 변수 및 조건을 심층적으로 이해해야 합니다. 다른 결정화에서와 마찬가지로 바람직한 결정 형태, 모양, 입자 크기 및 크기 분포를 달성하려면 세심한 관리를 통해 일관적인 제품 품질을 달성해야 합니다. 단백질 결정 현탁액의 CQA 변화는 치료 효능에 직접적인 영향을 미칩니다. 단백질 결정은 성장 환경에 고도로 민감하고 과도한 온도, 용매 손실, 기타 외부 스트레스 또는 심지어 샘플링 공정에 의해 쉽게 손상될 수 있으므로 현장에서, 즉 용매 환경에서 결정을 제거하지 않고 CPP와 제품 품질을 측정하는 것이 바람직합니다.

• EasyMax 및 Optimax 자동 화학 반응기를 통해 완충액 및 첨가제의 온도, pH, 전도도, 교반율 및 분주를 포함하는 파라미터를 정확하게 관리, 조정 및 기록할 수 있으며, 이는 단백질 결정화를 성공적으로 발전시키고 스케일업하는 데에 매우 중요합니다.
• 모니터링, 문제 해결 및 공정 편차의 수정을 지원하는 현장(In-situ) 분석기술 도구 또한 유용할 수 있습니다.
  • 현장(In-situ) 라만 분광법 및 FTIR 분광법은 시약 농도를 추적하고 결정 구조 성장을 모니터링하고 과포화된 용액의 농도를 측정합니다.
  • 결정화 공정의 주요 부분이 진행됨에 따라 ParticleTrack(FBRM 포함) 기술은 실시간으로 결정 크기 및 크기 분포의 변화를 모니터링합니다.
  • EasyViewer는 진행중인 결정화 공정의 시각화 및 이미지 분석을 가능하게 합니다.

자동화된 실험실 반응기를 실시간 현장(In-situ) 분석기와 함께 사용하는 경우 응집, 성장, 응결, 파손 및 형태 변화와 같은 결정화 메커니즘에 대한 공정 파라미터의 영향을 확인할 수 있습니다. 결정 형성 진행 과정에 대한 지속적인 현장 모니터링과 함께 결정화 공정에 대한 정확한 제어를 통해 사실 기반 및 데이터 기반의 최적화 및 스케일업이 가능합니다.

EasyMax 자동 실험실 반응기는 개발과 스케일업 설계 및 수행을 지원하기 위한 단백질 결정화에서 파라미터 최적화를 위한 완벽한 워크스테이션입니다. 이 완전 자동화된 시스템은 공정 파라미터를 정확하게 통제할 수 있습니다.

• 분주율, 온도, 교반, pH 및 전도도를 포함하는 CPP를 관리합니다.
• ReactIR(FTIR), ReactRaman(Raman), ParticleTrack(FBRM) 및 EasyViewer(현장 영상 분석)를 포함하는 결정화를 위한 현장(In-situ) 분석 방법과 쉽게 통합됩니다.
• iC Software를 통해 모든 실험과 주변 장비 뿐만 아니라 철저한 데이터 기록 및 기록 추적을 자동 실행하고 관리할 수 있습니다

ReactIR은 결정화 연구에서 중적외선 분광법을 사용하여 용액 단계를 측정합니다. ReactIR 측정은 부유 물질, 기포 또는 기타 입자 질량에 영향을 받지 않습니다.

• 개별적인 결정화 용질을 현장에서 실시간으로 추적합니다.
• 과포화에 관한 연구를 뒷받침하기 위해 용액 농도를 측정합니다.
• 실시간 의사결정과 관리를 위해 실용적인 데이터 분석을 제공합니다

ReactRaman은 라만 분광법을 사용하여 용액 내의 입자에 대한 분자 분석을 수행합니다.

• 결정 성장, 구조 및 형태를 비파괴적으로 현장에서 실시간 추적합니다.
• 품질 목적을 달성하기 위해 파라미터의 영향을 측정하고 결정화 조건과 변수를 최적화합니다.

ParticleTrack은 FBRM(Focused Beam Reflectance Measurement)을 사용하는 프로브 기반 광학 장치로서 용기에 직접 삽입되어 입자 크기와 개화 변화를 실시간으로 추적합니다. ParticleTrack는 결정 크기 분포(PSD)를 획득하기 위해 현 길이 분포 측정을 사용합니다.

• 실험 조건이 변하므로 단백질 결정을 지속적으로 모니터링합니다.
• 샘플을 제거할 필요 없이 결정화 동안 배치 또는 지속적인 성장을 실시간으로 추적합니다.
• 핵형성, 응집, 다형성 및 기타 시스템의 속성에 영향을 주는 조건의 특성을 규명합니다.

EasyViewer는 프로브 기반 기기로서 용기에 직접 삽입되어 입자 시스템의 영향을 기록합니다. EasyViewer는 영상 분석을 수행하고 시간 경과에 따라 군집들의 추이를 파악할 수 있는 공정에 대한 시간에 따른 인라인 영상에서 입자 개수, 입도 분포 및 형태를 측정합니다.

• 실험 조건이 변하므로 단백질 결정을 지속적으로 모니터링합니다.
• 샘플을 제거할 필요 없이 결정화 동안 배치 또는 지속적인 성장을 실시간으로 추적합니다.
• 핵형성, 응집, 다형성 및 기타 시스템의 속성에 영향을 주는 결정화 파라미터를 실시간으로 가시화합니다.

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

저자들은 생물의약적 결정화를 실시간 모니터링하는 효율적인 접근법을 성공적으로 개발하였다고 보고했습니다. 이 접근법은 ParticleTrack을 사용하여 정적인 조건과 동적인 조건 모두에서 일련의 생물의학적 분자에 대한 CLD를 측정한 다음, CLD를 CSD로 전환하기 위해 수학적 모델링을 적용합니다. 조사 대상 생물분자는 각기 다른 결정 형태를 지니며 결정화의 실험실 조건과는 무관합니다. 리소자임은 4각형의 바늘 모양 결정을 생성할 수 있고 rHu 인슐린은 6면체의 결정을 형성하고 B12는 다면체의 결정을 형성합니다.

저자들은 종횡비가 낮은 4각형, 6각형 및 다면체와 종횡비가 높은 바늘 결정에 대한 CSD를 측정하기 위한 모델을 개발했습니다. 저자들은 결정 입도 분포를 결정하기 위해 세 개의 다른 모델을 사용했습니다.

• 다른 연구 단체가 결정이 구체(구체 등가 직경, SED)로 표시될 수 있다고 가정하여 개발한 모델은 종횡비가 낮은 결정에 효과적입니다.
• 종횡비가 높은 결정을 위해 이 연구의 저자들은 너비에 기반한 모델을 개발하였습니다.
• 마지막으로 저자들은 길이에 기반하고 종횡비가 특정되어야 하는 모델을 개발했습니다.

FBRM 측정에 기반하여 CSD를 계산하기 위한 용도로 개발된 모델의 결과는 영상 분석에서 획득된 CSD 측정과 대비합니다.

특히 제조 사양에서 입도 분포(PSD)가 좁아야 한다고 요구할 때 불투명한 결정 슬러리를 모니터링하려는 시도는 문제를 야기합니다. 주사가능한 단백질 결정 조제의 경우, PSD는 조제를 악화시킬 가능성이 있는 응집 또는 기타 저하 사례에 대한 초기 경고로서의 제공뿐만 아니라 점도에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 스케일업 배치 결정화 연구는 인간 성장 호르몬(hGH) 결정 형성 및 성장의 특성을 규명하기 위해 현장(In-situ) 모니터링을 사용했습니다. 실시간 분석은 용기 간의 혼합 차이로 인한 일반적인 PSD 프로파일과의 편차를 감지했습니다. 이는 후속적인 오프라인 영상 분석(IA)으로 확인되었습니다.

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Continuous Crystallization Processes in Pharmaceutical Manufacturing: A Review. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameter Estimation of the Stochastic Primary Nucleation Kinetics by Stochastic Integrals Using Focused-Beam Reflectance Measurements. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulating crystallization in lysozyme and supramolecular self-arrangement in solution using ionic liquids. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modeling and control of crystal shape in continuous protein crystallization. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Enhancing the Crystal Production Rate and Reducing Polydispersity in Continuous Protein Crystallization. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Protein crystals for the delivery of biopharmaceuticals. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301