Pufre sú vodné systémy, ktoré odolávajú zmenám pH pri pridaní malého množstva kyseliny alebo zásady a sú zložené zo slabej kyseliny a jej konjugovanej bázy. Pufr udržuje pH roztoku konštantné absorbovaním protónov, ktoré sa uvoľňujú počas reakcií, alebo uvoľňovaním protónov, keď sú spotrebované reakciami. Objav, že čiastočne neutralizované roztoky slabých kyselín alebo zásad sú odolné voči zmenám pH, keď sa pridávajú malé množstvá silných kyselín alebo zásad, viedol ku konceptu "pufra".

Konjugovaná báza je kyselina, ktorá stratila protón.
HA  ↔  ^H+ + A^-
Kyslý  ↔  protón + konjugovaná báza

Konjugovaná kyselina je zásada, ktorá získala protón.
A + H⁺  ↔  H ⁺ A
Zásada + protónová  ↔  konjugovaná kyselina

Vytvára sa rovnováha medzi disociovanou a nedisociovanou formou.
Napríklad slabá kyselina octová čiastočne disociuje vo vode a vytvára acetátový ión:
CH₃COOH  ↔  H⁺ + CH₃COO^-
Nedisociovaná kyselina octová, vodíkové ióny a disociovaný ión existujú v roztoku v rovnováhe.

Octan sodný sa tiež disociuje vo vode za vzniku rovnakého acetátového iónu:
CH₃COONa  ↔  Na⁺ + CH₃COO^-
Nedisociovaný octan sodný a ióny sodíka a acetátu existujú v roztoku v rovnováhe.

Vodný roztok zmesi kyseliny octovej a octanu sodného preto môže absorbovať ióny H⁺ pridaním kyseliny spojením vodíkových iónov s acetátovou bázou za vzniku kyseliny octovej. Okrem toho, keď sa OH^- ióny zavádzajú do roztoku pridaním alkálie, spájajú sa s molekulami kyseliny (H⁺) za vzniku vody. Týmto spôsobom, keď sa systém pokúša obnoviť rovnováhu, roztok odoláva zmenám hodnoty pH. Takto funguje tlmivý roztok.

Čo sa stane po pridaní kyseliny do pufra?

Keď sa do rovnovážnej zmesi slabej kyseliny a jej konjugovanej bázy pridá nejaká silná kyselina (viac H+), rovnováha sa posunie doľava v súlade s Le Chatelierovým princípom.

Čo sa stane po pridaní základne do vyrovnávacej pamäte?

Podobne, ak sa do zmesi pridá silná zásada, koncentrácia vodíkových iónov klesne o menej, ako sa očakáva množstvo pridanej bázy. Je to preto, že reakcia sa posúva doprava, aby sa prispôsobila strate H⁺ v reakcii s bázou.

Tlmivé roztoky pozostávajúce zo slabej kyseliny a jej konjugovanej bázy sú známe ako kyslé pufre a majú pH < 7. Pufr vyrobený z kyseliny octovej (slabá kyselina) a octanu sodného (konjugovaná báza) je kyslý tlmivý roztok a má pH okolo 4,75.
Tlmivé roztoky pozostávajúce zo slabej zásady a jej konjugovanej kyseliny sú známe ako alkalické pufre a majú pH > 7. Príkladom alkalického tlmivého roztoku je vodný roztok hydroxidu amónneho (slabá zásada) a chloridu amónneho (konjugovaná kyselina), ktorý má pH 9,25.

Pufrovacie roztoky fungujú najlepšie, keď je ich pH podobné pH skúmaného systému alebo roztoku. Pri štúdiu enzýmov v ľudskej biológii je potrebný systém, ktorý zodpovedá pH krvi, t. j. 7,35 až 7,45, inak enzýmy nebudú fungovať správne. Ak má tlmivý systém pH mimo požadovaného rozsahu, bude to mať negatívny vplyv aj na analýzy.

Preto je potrebné vedieť pripraviť tlmivé roztoky špecifického pH a to rôznymi spôsobmi:

• Úprava pH
  Kryštalická kyselina alebo zásada sa najskôr rozpustí v objeme vody, ktorý sa rovná približne 60-70% konečného požadovaného objemu tlmivého roztoku. pH sa testuje a potom upravuje. Ak sa použije kryštalická kyselina, pH sa upraví pomocou zásady, ktorá nebude vytvárať ióny, ktoré by mohli rušiť skúmaný systém. Ak sa použije kryštalická zásada, pH sa upraví pomocou vhodnej kyseliny. Po dosiahnutí požadovaného pH je možné objem tlmivého roztoku doplniť vodou, aby sa získal požadovaný objem.
  
  
• Miešanie kyslých a zásaditých roztokov
  Pri tejto metóde sa roztok kyseliny alebo zásady zmieša s roztokom súvisiacej soli. Koncentrácie zdrojových roztokov musia byť rovnaké ako v požadovanom tlmivom roztoku. Roztoky sa môžu miešať v rôznych pomeroch, aby sa dosiahli rôzne hodnoty pH v konečnom tlmivom roztoku. Alternatívne je možné monitorovať pH pri pridávaní jedného roztoku do druhého.
  
  
• Použitie Henderson-Hasselbachovej rovnice
  Henderson-Hasselbachovu rovnicu možno použiť na odhad pH tlmivého roztoku pomocou disociačnej konštanty_{pK a}. Keď je slabá kyselina (HA) v roztoku a disociácia na vodíkové ióny (H⁺) a jej konjugovaná báza (A^-) je v rovnováhe, disociačná konštanta je mierou sily kyseliny v tomto rovnovážnom bode. Hendersonova-Hasselbachova rovnica je nasledovná: 



Kde: pKa je disociačná konštanta slabej kyseliny
[A-] je koncentrácia konjugovanej bázy v rovnováhe
[HA] je rovnovážna koncentrácia kyseliny

V prípade, že rovnovážna koncentrácia konjugovanej bázy a kyseliny je rovnaká, pH sa rovná disociačnej konštante. V tomto bode poskytuje tlmivý roztok maximálnu pufrovaciu schopnosť.
Hendersonova-Hasselbachova rovnica sa používa aj na určenie disociačnej konštanty slabých kyselín priamym meraním pH

Univerzálne tlmivé roztoky pozostávajú z kombinácie niekoľkých párov kyseliny a bázy. To umožňuje univerzálnym pufrom udržiavať hodnotu pH roztoku v širšom rozsahu, a preto ich možno použiť v mnohých ďalších aplikáciách.

• Vytvorenie SOP prípravy pufra
  Je dobré zdokumentovať proces prípravy pufra a uistiť sa, že všetci dodržiavajú rovnaký postup, aby sa zabezpečila konzistentnosť a reprodukovateľnosť. SOP by mal obsahovať podrobnosti o použitých materiáloch a presné kroky, kedy a ako pridať komponenty a merať pH. SOP môže obsahovať aj mnohé z nižšie uvedených bodov.
  
  
• Noste ochranný odev
  Musia sa nosiť vhodné osobné ochranné prostriedky (OOP), napríklad ochranné okuliare a odev, najmä pri práci so silnými kyselinami alebo zásadami.
  
  
• Kontrola mikrobiálnej kontaminácie (najmä v biologických aplikáciách)
  Pred použitím akéhokoľvek pufra skontrolujte nádobu, či nie je mikrobiálna kontaminácia. Tlmivé roztoky s pH blízkym neutrálnemu sú obzvlášť náchylné na kontamináciu. V roztoku môžete vidieť zákal alebo kontaminanty, ktoré sa usadili na dne.
  
  
• Používajte pH meter správne
  Váš pH meter by mal byť pravidelne kalibrovaný a udržiavaný, aby sa zabezpečili presné merania pH. Elektróda by mala byť pred použitím riadne pripravená a malo by sa použiť dostatočné množstvo tlmivého roztoku, aby sa zabezpečilo, že elektródový prechod je správne ponorený. Pred odčítaním počkajte na stabilnú hodnotu pH a potom elektródu opláchnite destilovanou vodou. Uistite sa, že používate pH meter pri teplote okolia alebo použite elektródu s integrovanou teplotnou sondou.
  
  
• Dávajte pozor na teplotu
  Množstvo disociácie sa môže líšiť v závislosti od teploty. Váš tlmivý roztok by sa preto mal pripraviť pri rovnakej teplote, pri akej budete vykonávať analýzy. Tiež sa uistite, že teplota, pri ktorej kalibrujete elektródu, je rovnaká ako teplota, pri ktorej meriate.
  
  
• Uvedomte si koncentráciu
  Bežnou praxou je riedenie zásobných tlmivých roztokov na požadovanú koncentráciu na použitie v analýzach. Zmena koncentrácie však môže ovplyvniť mieru disociácie. Keďže pH je mierou vodíkových iónov (H⁺), zmena disociácie môže spôsobiť zmenu pH. Po zriedení je potrebné pred použitím tlmivého roztoku znova skontrolovať pH.