Inattivazione virale nei biotrattamenti

L'inattivazione virale è solitamente il primo di due passaggi pensati per aumentare la sicurezza dei prodotti bioterapeutici. Durante l'inattivazione, qualsiasi virus presente nella sospensione terapeutica in pool e semi-purificata viene intenzionalmente distrutto o reso subito non patogeno, di solito mediante l'alterazione dell'ambiente attorno al virus stesso per provocare irreversibilmente la separazione e la denaturazione della struttura virale.

In genere, questa operazione si esegue alterando l'ambiente attorno al virus in modo da causare una separazione e una denaturazione irreversibili della struttura virale , ad esempio mediante metodi chimici, fisici o persino energetici. La rimozione del virus è un'operazione distinta dall'inattivazione, che è un processo complementare in grado di aumentare ulteriormente la sicurezza virale eliminando e separando il virus dalle proteine o dai prodotti di interesse.

Diversi prodotti bioterapeutici contengono virus o possono venire contaminati da essi durante la produzione o la lavorazione. La patogenicità e la carica virale o la quantità di virus in queste modalità devono essere eliminate o azzerate attraverso l'inattivazione e la rimozione, per prevenire danni al paziente. Di solito, nessuno dei due processi è sufficiente se impiegato da solo. A seconda delle specifiche caratteristiche del virus e del tipo di prodotto bioterapeutico, sono disponibili diversi metodi di inattivazione e rimozione. Diversi workflow bioterapeutici prevedono una combinazione di metodi complementari per ampliare lo spettro dei virus che possono essere adeguatamente eliminati.

Inattivazione
Sono possibili diversi metodi di inattivazione virale. I più comuni sono:

• Metodi basati su pH basso , in particolare per prodotti bioterapeutici come anticorpi monoclonali (mAb)
• Metodi basati su solventi o tensioattivi, solitamente per polisaccaridi

I metodi di inattivazione virale usati con minore frequenza includono pastorizzazione, calore secco e calore con vapore, in particolare per prodotti a base di sangue e siero.

Rimozione dei virus
Metodi ben documentati di rimozione dei virus includono precipitazione, cromatografia e nanofiltrazione.

La selezione dei metodi da impiegare per l'inattivazione virale e la rimozione dipende dalle dimensioni, dalla tipologia e dall'instabilità del prodotto bioterapeutico da preparare, dai metodi di purificazione che il produttore intende utilizzare e dalla natura e dal titolo dei virus considerati. Insieme alla sicurezza virale, struttura e funzione delle sostanze farmaceutiche (Drug Substance, DS) sono attributi di qualità ugualmente importanti e devono essere valutati e mantenuti durante tutto il processo. Il controllo accurato e simultaneo dei parametri critici di processo (Critical Process Parameters, CPP) giova a tutti i metodi di inattivazione virale, basati sia su pH basso sia su tensioattivi, ed è inoltre necessario per comprendere in modo efficace il processo stesso e l'effetto sulla sostanza farmaceutica (DS). I reattori di sintesi chimica consentono la mappatura di un processo moderno e un funzionamento costante all'interno di parametri definiti, servendo inoltre da modello per il trasferimento e lo scale-up dei metodi.

Con questo metodo, l'inattivazione virale dei prodotti bioterapeutici viene influenzata da pH, tempo, temperatura, contenuto di proteine e di soluto o soluzione tampone. Molti virus vengono irreversibilmente denaturati ed efficacemente distrutti a un pH compreso tra 5,0 e 5,5. A seconda della portata dei virus oggetto di inattivazione ed eliminazione, questo intervallo potrebbe essere sufficiente. Tuttavia, diversi virus con involucro vengono efficacemente inattivati solo a un pH compreso tra 3,5 e 4.

Diversi prodotti bioterapeutici mAb richiedono l'eliminazione ad ampio spettro di molteplici tipi di virus, tanto che viene comunemente impiegato un target di pH "basso" compreso tra 3,5 e 4 (figura A). Una prolungata esposizione a questo intervallo di pH può anche danneggiare o inattivare alcuni prodotti bioterapeutici, in particolare enzimi o proteine come quelle plasmatiche, insulina e altre ancora (figura B). Con una prolungata esposizione a uno stress da pH, proteine ed enzimi sono soggetti a una significativa deamidazione, denaturazione e aggregazione. Le soluzioni di immunoglobuline (comprendenti sia mAb IgG che IgM) sono generalmente meno suscettibili di altre proteine o enzimi a un pH compreso tra 3,5 e 5,5, anche se restano esposte a vari livelli. Dopo un tempo sufficiente a condizioni inattivanti, la carica virale infettiva dovrebbe essere effettivamente ridotta al minimo; tuttavia, particelle, detriti o altri contenuti virali residui non saranno stati ancora fisicamente rimossi (figura C).

Per i mAb dedicati all'inibizione delle immunoglobuline, il metodo a basso pH è quello usato con maggiore frequenza per l'inattivazione virale perché è relativamente semplice, richiede un ingombro ridotto e solitamente prevede un intervento minimo senza necessità di passaggi aggiuntivi per la rimozione, a differenza di tensioattivi o altri solventi. Eppure, le condizioni appropriate e ottimali variano a seconda delle molecole e dello spettro di eliminazione del virus richiesto. Pertanto, devono essere intrapresi degli studi per ogni molecola, in modo da caratterizzare e validare lo spazio di progettazione o i limiti operativi in cui può avere luogo l'effettiva inattivazione virale. Questi limiti e l'esito di un processo di inattivazione virale sono generalmente definiti da tutte le variabili, o almeno da una selezione di esse, oppure dai parametri critici di processo (CPP) che influenzano questo stesso risultato e quindi la qualità della sostanza farmaceutica (DS). L'identificazione e la gestione di questi fattori influenzeranno positivamente la qualità e la quantità del prodotto.

Tradizionalmente, gli studi di inattivazione virale con pH basso vengono eseguiti con un determinato volume e una certa concentrazione della soluzione di immunoglobuline all'interno di un contenitore come un becher dotato di agitatore magnetico. Dato che la maggior parte del materiale impiegato dagli studi sarà costituito da soluzioni di immunoglobuline con un pH di partenza prossimo alle condizioni fisiologiche, gli studi di inattivazione virale punteranno a chiarire i parametri dell'aggiunta di reagenti. Solitamente, si esegue una titolazione manuale con una buretta o mediante l'uso del pipettaggio e la registrazione simultanea e intermittente della misura di pH. A seguito del completamento di una procedura che prevede il mantenimento, per un dato periodo tempo e a determinate condizioni, di un pH sufficientemente basso da inattivare il contenuto del virus target, la sostanza farmaceutica (DS) o soluzione di immunoglobuline viene sottoposta a titolazione inversa fino a raggiungere un intervallo di pH fisiologicamente appropriato o leggermente basico. Si completa così l'inattivazione virale con pH basso. Tuttavia, durante lo studio di titolazione con pH basso per l'inattivazione virale, è richiesta l'estrazione del campione per l'analisi offline, che consente di documentare vari attributi di qualità come l'aggregazione o la deamidazione attraverso metodi che comprendono la cromatografia di esclusione molecolare (Size Exclusion Chromatography, SEC). Anche se scienziati esperti possono garantire l'accuratezza, il processo di inattivazione virale è generalmente laborioso e soggetto a variazioni naturali, inaccuratezze e problemi di riproducibilità delle eventuali operazioni manuali.

Sebbene la principale esigenza degli studi di inattivazione virale con pH basso nei biotrattamenti a valle sia quella di definire il livello dell'aggiunta del reagente e il tempo richiesto dal processo, la caratterizzazione della relativa cinetica e dell'impatto dei parametri nei processi concomitanti è altrettanto importante e costituisce in ultima analisi un requisito per garantire la definizione di un processo di inattivazione virale efficace e ottimizzato. Eppure, si tende spesso a trascurare il monitoraggio e il controllo della temperatura, che diventa così un parametro incontrollato durante gli studi di sviluppo dei processi per l'inattivazione virale.

Questa svista può essere in parte dovuta all'uso di sistemi pilota o persino dedicati alla produzione commerciale, che eseguono l'inattivazione virale in contenitori fissi o mobili che potrebbero registrare ma non controllare la temperatura. La rappresentatività della scala, e in particolare quella della miscelazione, è spesso un altro parametro trascurato negli studi di inattivazione virale con basso pH, come quelli eseguiti mediante piattaforme manuali controllate da piastre con agitatori magnetici. La mancanza di dati per un elemento basilare come la miscelazione rende impossibile verificare se le condizioni supposte dello studio fossero corrette e costanti. 

Il trattamento a basso pH per l'operazione di inattivazione dei virus presenta, nell'ambito del processo, un potenziale rischio di aggregazione del prodotto durante la lavorazione a valle dell'anticorpo monoclonale. Questa presentazione a cura di Hiren D. Ardeshna di GlaxoSmithKline illustra un piano fattoriale completo che mira a esaminare l'effetto di quattro parametri di processo:

• Punto finale di pH basso
• Tempo di applicazione di pH basso
• Durata della titolazione con pH basso
• Durata della titolazione di neutralizzazione

I metodi di inattivazione virale con solvente o detergente vengono comunemente impiegati contro i virus con involucro. I reagenti usati hanno di solito un impatto trascurabile sull'instabilità della proteina terapeutica o degli anticorpi che sono soggetti alle conseguenze della denaturazione o della deamidazione possibili con alcuni metodi che prevedono l'impiego di un pH basso. L'inattivazione virale con solventi o detergenti condivide diversi fattori chiave ed esigenze con i metodi che impiegano il pH basso, in particolare la definizione del livello dell'aggiunta del reagente (in questo caso un solvente o un detergente) e del tempo richiesto dal processo. Come per l'inattivazione virale con pH basso, le condizioni tra immunoglobuline o altri tipi di sostanze farmaceutiche (DS) possono variare. Pertanto, devono essere intrapresi degli studi per ogni molecola, in modo da caratterizzare e validare lo spazio di progettazione o i limiti operativi in cui può avere luogo l'effettiva inattivazione virale con solvente o detergente. Questi limiti e l'esito di un processo di inattivazione virale sono definiti allo stesso modo dai parametri critici di processo (CPP) che comprendono temperatura, contenuto di proteine, contenuto di solvente o detergente, tempo a condizioni inattivanti, oltre a miscelazione ed efficacia dell'omogeneizzazione di solvente o detergente. L'identificazione e la gestione di questi fattori influenzeranno positivamente la qualità e la quantità del prodotto.

Sebbene gli studi di inattivazione virale con detergente non richiedano lo stesso metodo di titolazione del reagente previsto con il pH basso, resta comunque necessario valutare uno spazio di progettazione dedicato alle variabili critiche. Come avviene con il pH basso, anche gli studi di inattivazione virale che impiegano solventi o detergenti prevedono di solito una caratterizzazione totalmente manuale. Il dosaggio dei reagenti e i controlli sono analogamente dipendenti dall'accuratezza di persone particolarmente esperte che eseguono simultaneamente diverse attività critiche. Gli studi di inattivazione virale con solventi o detergenti sono anch'essi soggetti a variazioni naturali, imprecisioni e problemi di riproducibilità.

I metodi di inattivazione virale che fanno affidamento su solventi o detergenti richiedono generalmente la considerazione di un ulteriore elemento non pertinente a quelli che si affidano sul pH basso. Tutti i solventi o i detergenti aggiunti devono essere rimossi dalla sostanza farmaceutica (DS) o dalla soluzione di immunoglobuline e verificati con un metodo analitico appropriato. Di solito, solventi o detergenti vengono rimossi con la cromatografia o la sostituzione delle soluzioni tampone tramite filtrazione a flusso tangenziale. La rimozione dei solventi o detergenti aggiunti è in qualche modo analoga alla finalità della titolazione inversa per il passaggio da un'inattivazione con basso pH a un intervallo fisiologicamente appropriato o leggermente basico. Su ampia scala, i metodi di sostituzione delle soluzioni tampone o cromatografici vengono impiegati come operazioni di unità continue o semi-continue quando il materiale passa da un contenitore statico attraverso una colonna o un'altra membrana appropriata per lo scambio di solvente o soluzione tampone. Nello sviluppo dei processi, l'inattivazione virale con solvente o detergente avviene verosimilmente in modo separato e distinto dalla successiva fase di purificazione o rimozione. Pertanto, con questa pratica è possibile incrementare la continuità dei dati o delle informazioni.

Diversi prodotti vaccinali vengono sottoposti a inattivazione virale, compresi quelli a base di tossoidi, proteine ricombinanti, subunità, polisaccaridi e persino alcune particelle virus-simili. Anche in questo caso, la scelta di un metodo di inattivazione virale appropriato prenderà in considerazione la natura del prodotto bioterapeutico, oltre alla gamma di virus da eliminare.

Generalmente, è necessario valutare con attenzione pratiche e metodi alternativi in grado di prevenire contaminazioni virali non essenziali per tipologie di vaccini come i virus vivi attenuati, il cui prodotto bioterapeutico è costituito da una particella virale. Specifiche metodologie per questi prodotti possono includere una o più nanofiltrazioni o processi di cromatografia per un'efficace riduzione della carica virale non pertinente nelle fonti delle rispettive materie prime. I virus inattivati o distrutti possono comunque essere sottoposti a un appropriato processo di inattivazione virale con basso pH oppure con solvente o detergente, poiché potrebbe mantenere l'effetto immunostimulatorio desiderato anche se il prodotto virale viene denaturato o eliminato in altro modo.

I metodi di inattivazione virale per tipologie di prodotti o molecole a base di oligonucleotidi non sono considerati necessari. Ciò è principalmente dovuto alla natura dei reagenti, alle condizioni di reazione e ai metodi di elaborazione, che sono costantemente sfavorevoli per i virus. Al momento, molti di questi prodotti a base di oligonucleotidi in fase di sviluppo e produzione vengono principalmente purificati, concentrati e formulati con varie sostituzioni delle soluzioni tampone tramite filtrazione a flusso tangenziale o una delle tipologie di separazione cromatografica.

A fronte della necessità della continuità dei dati e dei registri elettronici, i reattori di sintesi chimica potenziano i processi di inattivazione virale sia nella progettazione sia nell'esecuzione degli esperimenti, oltre che agevolando l'acquisizione e l'integrità dei dati. La tecnologia di analisi del processo (Process Analytical Technology, PAT) ortogonale collega diverse applicazioni e workflow, come l'inattivazione virale con lo scambio di soluzioni tampone, e modella in modo più accurato i flussi di processo di operazioni su ampia scala.

Richiedete una demo virtuale da effettuare dal vostro ufficio o studio in base ai vostri orari.

• È sufficiente premere Play: il software iC risponde dinamicamente alle condizioni all'interno del reattore. Eseguite in modo coerente le operazioni nei limiti del protocollo di inattivazione virale.
• Acquisite dati da più sensori, tra cui pH, conducibilità, potenziale di ossidoriduzione (ORP) e ossigeno disciolto.
• Integrate unità periferiche come pompe o bilance per il trasferimento gravimetrico della massa.

Le spettroscopie FTIR e Raman in-situ monitorano i componenti critici dei bioprocessi nelle operazioni delle unità a monte, a valle, di coniugazione e formulazione.

Il glucosio e i metaboliti chiave possono essere monitorati nelle applicazioni a monte, mentre nei processi a valle è possibile controllare in tempo reale la concentrazione di proteine o vaccino, stabilizzatori, eccipienti e impurità senza i ritardi o i costi associati all'analisi offline.

Ciò consente la rapida determinazione dei punti finali del processo oltre a una comprensione chiara dell'impatto di vari parametri sulla qualità del prodotto e sull'efficienza del processo stesso.