Cristallizzazione delle proteine

La cristallizzazione delle proteine è l'atto e il metodo di creare reticoli strutturati e ordinati per macromolecole complesse. Le proteine sono tipicamente amorfe come solidi e soggette a denaturazione, mentre le proteine esistenti in reticoli cristallini resistono alla denaturazione e possiedono una maggiore stabilità. Le proteine possono cristallizzare se collocate in ambienti adatti e ospitali. La cristallizzazione delle proteine è vista tanto come un'arte quanto una scienza, a causa delle interazioni altamente complesse delle variabili che influenzano il processo di cristallizzazione delle proteine.

La ragione più comune per creare cristalli di proteine è supportare le indagini di biologia strutturale, tipicamente tramite cristallografia a diffrazione di raggi X. Gli investigatori possono visualizzare aree nel quadro che permettono l'interazione con altre molecole comprendendo le strutture tridimensionali delle proteine (ad esempio, per comprendere meglio come enzimi, substrati e ligandi interagiscono). Inoltre, la cristallizzazione è un mezzo efficace per creare proteine pure, libere da contaminazioni di altre proteine o materia biologica estranea, offrendo così un'alternativa alla purificazione e separazione tramite cromatografia preparativa. 

La cristallizzazione procede attraverso una serie di meccanismi interdipendenti, ciascuno influenzato in modo unico dalla scelta dei parametri di processo: nucleazione, crescita, fuoriuscita di olio, agglomerazione, rottura, semina e transizione polimorfa.

Spesso, questi meccanismi si verificano simultaneamente, rendendo la progettazione efficace della cristallizzazione una sfida. In assenza di una comprensione meccanicistica, gli scienziati si affidano al metodo del tentativo ed errore per regolare i parametri di processo e ottimizzare resa, purezza e dimensione dei cristalli. Comprendendo quali meccanismi si verificano durante la cristallizzazione, gli scienziati possono adottare strategie per ottenere un prodotto cristallino con le proprietà desiderate.

Le proteine sono sempre più importanti come medicinali terapeutici. Tuttavia, produrre proteine con la stabilità necessaria presenta sfide chiave, tra cui variazioni del prodotto, perdita di struttura che ridurrebbe l'efficacia e la formazione di sottoprodotti potenzialmente pericolosi. La cristallizzazione delle proteine è un metodo per produrre forme solide pure e stabili e numerosi terapeutici iniettabili e infusibili associati a cristalli proteici. In passato, la cristallizzazione delle proteine era un'attività di laboratorio per supportare la cristallografia a raggi X, ma a causa della crescita esponenziale dei terapeutici a base proteica, la scala della cristallizzazione delle proteine a livelli produttivi è sempre più importante ed è un'area di intenso interesse.

La scala della cristallizzazione delle proteine è fondamentalmente analoga a quella della cristallizzazione di piccole molecole nei suoi requisiti di ottimizzare i Parametri Critici di Processo (CPP) a livello di laboratorio per raggiungere gli Attributi Critici di Qualità (CQA) di una sostanza farmaceutica cristallizzata a livello commerciale. Una piattaforma olistica per lo sviluppo del processo di cristallizzazione delle proteine e la sua scala tipicamente comprende:

• Caratterizzazione in situ del sistema particellare
• Monitoraggio spettroscopico e caratterizzazione dei polimorfi
• Ottimizzazione della procedura e strategie di controllo a retroazione tramite moduli e sensori integrati

Esistono importanti applicazioni farmaceutiche associate alla cristallizzazione delle proteine: chimica medicinale tramite biologia strutturale, sviluppo di farmaci proteici, scala, separazione e purificazione, formulazione e somministrazione del farmaco.

• Chimica medicinale tramite biologia strutturale. I progressi nelle tecniche di cristallizzazione delle proteine e la cristallografia a raggi X migliorata hanno portato alla deduzione di decine di migliaia di strutture tridimensionali delle proteine. Comprendere in dettaglio le interazioni farmaco-recettore è possibile determinando la struttura di queste macromolecole complesse e visualizzando i siti di legame. Queste informazioni consentono una maggiore comprensione a livello molecolare di inibitori proteici, attivatori allosterici, cofattori e persino siti catalitici degli enzimi o 'siti attivi' – risultando in farmaci migliori con efficacia migliorata. Un esempio classico dell'importanza di comprendere la struttura proteina-inibitore tramite cristallografia è dimostrato dai grandi progressi nello sviluppo delle proteasi HIV.
• Sviluppo, scala, separazione e purificazione per terapeutici a base proteica. Oltre alla crescita di singoli cristalli proteici per la cristallografia a raggi X, l'industria farmaceutica ha aumentato gli sforzi nello sviluppo di terapeutici basati su cristalli proteici. L'obiettivo di queste applicazioni è sviluppare e scalare grandi quantità di cristalli proteici puri e stabili che abbiano la dimensione particellare corretta e una distribuzione della dimensione delle particelle ben controllata. Rispetto alla cromatografia preparativa, la cristallizzazione delle proteine ha il potenziale di essere un mezzo alternativo economico per la separazione e purificazione di macromolecole e per l'isolamento di molecole chirali. Gli strumenti per la scala della cristallizzazione delle proteine sono analoghi a quelli usati per la scala delle reazioni chimiche con la necessità di comprendere i CPP e il loro effetto sui CQA.
• Formulazione e somministrazione del farmaco. I terapeutici proteici sono somministrati come soluzioni e possono essere somministrati tramite iniezione o infusione. Poiché devono essere somministrate elevate quantità di proteine, le soluzioni proteiche infuse sono diluite per evitare problemi di viscosità e aggregazione. Questo è meno conveniente per il paziente e l'ospedale a causa del tempo richiesto per infondere l'intero trattamento, ma può anche contribuire al fenomeno della minore compliance del paziente con qualsiasi forma di somministrazione parenterale. L'uso della forma cristallina delle proteine in sospensione è di grande interesse, poiché queste formulazioni presentano meno problemi di viscosità e possono essere somministrate a concentrazioni più elevate. Un altro punto chiave è che la dimensione dei cristalli proteici deve essere attentamente controllata per garantire che la sospensione possa passare facilmente attraverso un ago per iniezione o infusione. Inoltre, è importante che eventuali cristalli residui che non si dissolvono durante la ricostituzione non superino dimensioni critiche delle particelle che potrebbero causare effetti collaterali avversi dovuti all'accumulo capillare nella vascolarizzazione, minimizzando generalmente quantità significative di particelle >15 µm. 

1. Scegliere un solvente appropriato. Le considerazioni comuni includono la quantità di soluto che può essere disciolta (solubilità), la praticità di gestione del solvente (sicurezza) e come il solvente influenzerà la stabilità e gli stati di energia libera del peptide o della proteina.
2. Raggiungere la supersaturazione. Riscaldare la sostanza farmaceutica peptidica/proteica solubile in solvente o tampone fino a una tolleranza massima consentita (di solito limitata dalla denaturazione). La soluzione diventerà supersatura.
3. Cristallizzare il prodotto controllando i CPP. Ridurre la solubilità raffreddando, aggiungendo anti-solvente, evaporando o tramite reazione. Man mano che la solubilità diminuisce, si raggiunge un punto in cui i cristalli nucleano e poi crescono. Dovrebbero crescere cristalli di prodotto altamente puro, anche se motivi con alta energia libera possono formare strutture alternative o non cristalline; prevenire ciò richiede un attento controllo dei CPP se è anche praticabile.
4. Consentire al sistema di raggiungere l'equilibrio. Questo viene fatto per massimizzare la resa del solido del prodotto farmaceutico.
5. Filtrare e asciugare il prodotto purificato.

Esistono diversi metodi impiegati per far crescere cristalli di proteine; tra i più comuni vi sono la diffusione di vapore e il microbatch. Il primo metodo ha due varianti, descritte come hanging drop e sitting drop, e entrambe funzionano fondamentalmente allo stesso modo. In un sistema sigillato, una goccia di soluzione contenente la proteina, il tampone e il precipitante si equilibra con un serbatoio contenente concentrazioni più elevate di soluto della stessa soluzione, ma senza la proteina. L'acqua dalla goccia contenente la proteina evapora ed è attratta dalla soluzione a concentrazione più elevata nel serbatoio. Man mano che la concentrazione di soluti nella goccia aumenta, la proteina inizia a cristallizzare. Nel metodo microbatch, le proteine e gli altri reagenti sono introdotti e contenuti sotto uno strato sottile di olio minerale che elimina la diffusione dell'acqua. Il microbatch è essenzialmente un piccolo reattore contenente tutti gli ingredienti necessari alle concentrazioni corrette e stabili per consentire la cristallizzazione.

Poiché trovare il set corretto di reagenti, parametri e condizioni necessari per cristallizzare una proteina è spesso empirico, il mezzo più pratico per una cristallizzazione proteica di successo è utilizzare una gamma variabile di condizioni sperimentali basate su esperienze precedenti. Il modo più semplice per farlo è utilizzare kit commerciali per lo screening di cristalli di proteine che contengono soluzioni preconfezionate con tamponi, precipitanti, ecc., contenuti in piastre multi-pozzetto. Il metodo di diffusione di vapore hanging drop viene applicato per far crescere cristalli con questi kit. Quando è richiesto uno screening su larga scala, sono disponibili sistemi ad alta produttività che automatizzano il metodo microbatch, risparmiando tempo e fatica e minimizzando contemporaneamente la quantità di proteina purificata richiesta. Per le cristallizzazioni proteiche su larga scala necessarie per applicazioni farmaceutiche o industriali, le informazioni ottenute negli esperimenti di screening costituiscono la base per l'applicazione in sistemi di reattori automatizzati su larga scala caratterizzati da PAT in situ e in tempo reale. 

A supporto dello sviluppo del processo e della produzione, uno dei passaggi iniziali più importanti per cristallizzare con successo le proteine è garantire una fornitura adeguata di proteina altamente purificata e ben caratterizzata. Oltre a che la proteina sia pura (cioè priva di contaminanti, come impurità da matrici di fermentazione), la proteina dovrebbe essere omogenea e stabile (o stabilizzata) in soluzione con:

• Aggregazione minima (Figura A)
• Struttura secondaria, terziaria e quaternaria corretta (Figura B)
• Eventuali modifiche coniugate o ricombinanti (Figura C)

Inoltre, tutti i reagenti e i solventi utilizzati nel processo di cristallizzazione delle proteine devono essere privi di contaminanti, poiché questi possono avere un effetto significativo sulla nucleazione.

Similmente alla cristallizzazione di piccole molecole, le proteine cristallizzano da soluzioni supersature. Per le piccole molecole che formano reticoli cristallini robusti, manipolare la temperatura è un mezzo primario per raggiungere la supersaturazione; questo è utile anche per le proteine. Tuttavia, è consentito un intervallo di temperatura ridotto poiché i cristalli proteici tipicamente contengono solvente come parte della struttura cristallina, sono frequentemente sensibili alla temperatura e inclini alla denaturazione e all'aggregazione.

Le piccole molecole hanno significativamente meno gradi di libertà stereoscopica e cristallizzano molto più facilmente di conseguenza. I peptidi di grandi dimensioni hanno molte più interazioni interne acide, basiche, polari, non polari e forze repulsive che resistono alla cristallizzazione ordinata, un fenomeno che è esacerbato per proteine ancora più grandi. La maggior parte dei peptidi compatibili con la cristallizzazione contiene anche un numero significativo di legami disolfuro che sono cruciali per immobilizzare i motivi strutturali. L'entità del disordine intramolecolare o della possibile variazione nella struttura è un attributo importante che determina se un peptide o una proteina potrebbe mai cristallizzare piuttosto che precipitare. Anche se la molecola è predisposta con attributi favorevoli alla cristallizzazione, ci sono diversi parametri di processo influenti che incidono sulla viabilità commerciale del processo e che devono essere caratterizzati.

Oltre alla temperatura, diversi altri fattori influenzano/aiutano la cristallizzazione delle proteine tramite supersaturazione, inclusi l'aggiustamento del pH e la forza ionica di una soluzione, l'aggiunta di sali e precipitanti come PEG per aiutare a ridurre la solubilità della proteina, il tipo di ligando presente, ecc. La chiave è supersaturare la soluzione in un ambiente che non disturbi il carattere normale della proteina. Ciò implica l'importanza di trovare un set di variabili e condizioni che producano cristalli con la morfologia corretta, purezza e tassi di crescita accettabili.

La cristallizzazione delle proteine procede attraverso una serie di meccanismi interdipendenti:

1. Nucleazione
2. Crescita
3. Separazione dell'olio nella Cristallizzazione
4. Agglomerazione
5. Rottura
6. Semina
7. Chimica del Polimorfismo

Questi meccanismi, spesso nascosti agli scienziati, giocano un ruolo dominante nel definire l'esito di un processo di cristallizzazione.

Lo sviluppo e la scalabilità delle cristallizzazioni per terapeutici a base proteica richiedono una comprensione approfondita delle variabili e delle condizioni che influenzano il processo di cristallizzazione. Come in altre cristallizzazioni, ottenere la forma cristallina desiderata, la forma, la dimensione delle particelle e la distribuzione delle dimensioni richiede un controllo accurato per garantire una qualità del prodotto costante. Qualsiasi variazione nei CQA delle sospensioni di cristalli proteici influenzerà direttamente l'efficacia terapeutica. Poiché i cristalli proteici sono altamente sensibili all'ambiente di crescita e possono essere facilmente danneggiati da temperature eccessive, perdita di solvente e altri stress esterni o anche dal processo di campionamento, è auspicabile misurare i CPP e la qualità del prodotto in situ, cioè senza rimuovere i cristalli dal loro ambiente di soluzione.

• I reattori chimici automatizzati EasyMax e OptiMax consentono un controllo preciso, la regolazione e la registrazione dei parametri, inclusi temperatura, pH, conducibilità, velocità di agitazione e dosaggio di tamponi ed eccipienti, che sono critici per lo sviluppo e la scalabilità di successo delle cristallizzazioni proteiche
• Gli strumenti tecnologici analitici in situ che aiutano nel monitoraggio, nella risoluzione dei problemi e nella correzione delle deviazioni di processo sono anche utili
  • Spettroscopia Raman in situ e spettroscopia FTIR monitorano le concentrazioni dei reagenti, la crescita della struttura cristallina e misurano anche la concentrazione di soluzioni supersature
  • Tecnologia ParticleTrack (con FBRM) monitora in tempo reale la variazione della dimensione e della distribuzione delle dimensioni dei cristalli come segmenti chiave del processo di cristallizzazione
  • EasyViewer consente la visualizzazione e l'analisi delle immagini del processo di cristallizzazione mentre procede

Quando i reattori di laboratorio automatizzati sono utilizzati in associazione con analizzatori in situ in tempo reale, l'impatto dei parametri di processo sui meccanismi di cristallizzazione come aggregazione, crescita, agglomerazione, rottura e cambiamento di forma può essere identificato. Il controllo preciso del processo di cristallizzazione in associazione con il monitoraggio continuo e in situ del progresso della formazione dei cristalli consente che l'ottimizzazione e la scalabilità siano basate su fatti e guidate dai dati.

Il reattore di laboratorio automatizzato EasyMax è una postazione completa per l'ottimizzazione dei parametri nella cristallizzazione delle proteine a supporto dello sviluppo e della progettazione e esecuzione della scalabilità. Questo sistema completamente automatizzato consente un controllo preciso sui parametri di processo.

• Gestione dei CPP inclusi i tassi di dosaggio, temperatura, agitazione, pH e conducibilità
• Si integra facilmente con analitiche in situ per la cristallizzazione tra cui ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) e EasyViewer (analisi delle immagini in situ)
• Il software iC consente l'esecuzione automatizzata e il controllo di tutti gli esperimenti e delle apparecchiature periferiche nonché la completa acquisizione dei dati e la registrazione

ReactIR utilizza la spettroscopia nell'infrarosso medio per misurare la fase in soluzione negli studi di cristallizzazione. Le misurazioni ReactIR non sono influenzate da solidi sospesi, bolle o altra massa particellare.

• Monitorare i singoli soluti della cristallizzazione in situ e in tempo reale.
• Misurare le concentrazioni in soluzione a supporto degli studi di supersaturazione
• Fornire analisi dati utilizzabili per decisioni e controlli in tempo reale

ReactRaman utilizza la spettroscopia Raman per fornire un'analisi molecolare delle particelle in soluzione

• Monitorare la crescita, la struttura e la morfologia dei cristalli in modo non distruttivo, in situ e in tempo reale
• Determinare gli effetti dei parametri e ottimizzare le condizioni e le variabili di cristallizzazione per raggiungere gli obiettivi di qualità

ParticleTrack utilizza la tecnologia Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) ed è uno strumento ottico basato su sonda che viene inserito direttamente in un recipiente per monitorare in tempo reale la variazione della dimensione e del conteggio delle particelle. ParticleTrack utilizza misurazioni della Distribuzione della Lunghezza del Corda per ottenere la Distribuzione delle Dimensioni dei Cristalli (CSD).

• I cristalli proteici sono monitorati continuamente, mentre le condizioni sperimentali variano
• Segui la crescita batch o continua durante la cristallizzazione in tempo reale senza necessità di prelievo del campione
• Caratterizza le condizioni che influenzano la nucleazione, l’aggregazione, il polimorfismo e altri attributi del sistema

EasyViewer è uno strumento basato su sonda che viene inserito direttamente in un recipiente per catturare immagini dei sistemi particellari. EasyViewer esegue l’analisi delle immagini e misura il conteggio delle particelle, la distribuzione delle dimensioni e la morfologia da immagini inline a risoluzione temporale del processo, permettendo di tracciare l’andamento delle popolazioni nel tempo.

• I cristalli proteici sono monitorati continuamente, mentre le condizioni sperimentali variano
• Segui la crescita batch o continua durante la cristallizzazione in tempo reale senza necessità di prelievo del campione
• Visualizza in tempo reale i parametri di cristallizzazione che influenzano la nucleazione, l’aggregazione, il polimorfismo e altri attributi del sistema

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitoraggio in Tempo Reale della Cristallizzazione Biofarmaceutica: Distribuzione della Lunghezza del Corda a Distribuzione delle Dimensioni dei Cristalli per Lisozima, rHu Insulina e Vitamina B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Gli autori hanno riportato il successo nello sviluppo di un approccio efficiente per il monitoraggio in tempo reale delle cristallizzazioni biofarmaceutiche. Questa procedura utilizza ParticleTrack per misurare la CLD per una serie di molecole biofarmaceutiche in condizioni sia statiche che dinamiche, applicando poi la modellazione matematica per convertire la CLD in CSD. Le biomolecole investigate presentano diverse forme cristalline, dipendenti dalle condizioni sperimentali della cristallizzazione. Il lisozima può produrre cristalli tetragonali e a forma di ago, l’insulina rHu forma cristalli romboedrici e la B12 cristalli poliedrici.

Gli autori hanno sviluppato modelli per determinare la CSD per cristalli tetragonali a basso rapporto d’aspetto, romboedrici, poliedrici e cristalli ad alto rapporto d’aspetto a forma di ago. Gli autori hanno utilizzato tre modelli differenti per determinare la distribuzione delle dimensioni dei cristalli:

• Un modello sviluppato da un altro gruppo di ricerca che assumeva che i cristalli potessero essere rappresentati come sfere (diametro equivalente sferico, SED) è stato efficace per i cristalli a basso rapporto d’aspetto
• Per i cristalli ad alto rapporto d’aspetto, gli autori di questo studio hanno sviluppato un modello basato sulla larghezza
• Infine, hanno sviluppato un modello basato sulla lunghezza che richiedeva la specifica del rapporto d’aspetto

I risultati dei modelli sviluppati per calcolare la CSD dalle misurazioni FBRM sono stati poi confrontati con le misurazioni CSD ottenute tramite analisi delle immagini.

Monitorare una sospensione opaca di cristalli presenta sfide, specialmente quando le specifiche di produzione richiedono una distribuzione delle dimensioni delle particelle (PSD) stretta. Per le formulazioni iniettabili di cristalli proteici, la PSD può influenzare notevolmente la viscosità oltre a fungere da segnale precoce per aggregazione o altri eventi di degradazione che possono potenzialmente compromettere la formulazione. Il monitoraggio in situ è stato utilizzato in uno studio di cristallizzazione batch in scala per caratterizzare la formazione e la crescita dei cristalli dell’ormone della crescita umano (hGH). L’analisi in tempo reale ha rilevato una deviazione dal profilo PSD abituale causata da differenze di miscelazione tra i recipienti. Ciò è stato confermato da successive analisi offline delle immagini (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Processi di cristallizzazione continua nella produzione farmaceutica: una revisione. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Stima dei parametri della cinetica di nucleazione primaria stocastica tramite integrali stocastici usando misurazioni con fascio riflesso focalizzato. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitoraggio in tempo reale della cristallizzazione biofarmaceutica: distribuzione della lunghezza della corda alla distribuzione della dimensione dei cristalli per lisozima, rHu insulina e vitamina B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipolazione della cristallizzazione nel lisozima e dell'auto-organizzazione supramolecolare in soluzione usando liquidi ionici. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modellazione e controllo della forma dei cristalli nella cristallizzazione continua delle proteine. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Incremento della velocità di produzione dei cristalli e riduzione della polidispersità nella cristallizzazione continua delle proteine. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Cristalli proteici per la somministrazione di biofarmaci. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301