Cristallisation des protéines

La cristallisation des protéines désigne le processus et la méthode permettant de créer des réseaux structurés et ordonnés pour des macromolécules complexes. À l'état solide, les protéines sont généralement amorphes et sensibles à la dénaturation, tandis que celles qui se trouvent dans des réseaux cristallins résistent à la dénaturation et présentent une plus grande stabilité. Les protéines peuvent se cristalliser si elles sont placées dans des environnements adaptés et favorables. La cristallisation des protéines est considérée autant comme un art que comme une science, en raison des interactions très complexes entre les variables qui influencent le processus de cristallisation.

La raison la plus courante pour créer des cristaux de protéines est de soutenir les recherches en biologie structurale, généralement par le biais de la cristallographie par diffraction des rayons X. Les chercheurs peuvent visualiser les zones de la structure qui permettent une interaction avec d'autres molécules en comprenant les structures tridimensionnelles des protéines (par exemple, pour mieux comprendre comment les enzymes, les substrats et les ligands interagissent). De plus, la cristallisation est un moyen efficace de produire des protéines pures, exemptes de toute contamination par d'autres protéines ou par des matières biologiques étrangères, offrant ainsi une alternative à la chromatographie préparative pour la purification et la séparation.

La cristallisation se déroule selon une série de mécanismes interdépendants, chacun étant influencé de manière spécifique par le choix des paramètres du procédé : nucléation, croissance, exsudation, agglomération, rupture, ensemencement et transition polymorphe.

Souvent, ces mécanismes se produisent simultanément, ce qui rend difficile la conception d'un processus de cristallisation efficace. En l'absence de compréhension mécanistique, les scientifiques s'appuient sur des essais et des erreurs pour ajuster les paramètres du processus et optimiser le rendement, la pureté et la taille des cristaux. En comprenant quels mécanismes interviennent pendant la cristallisation, les scientifiques peuvent mettre en œuvre des stratégies permettant d'obtenir un produit cristallin présentant les propriétés souhaitées.

Les protéines jouent un rôle de plus en plus important en tant que médicaments thérapeutiques. Cependant, la production de protéines présentant la stabilité requise pose des défis majeurs, notamment la variabilité du produit, la perte de structure susceptible de réduire l'efficacité et la formation de sous-produits potentiellement dangereux. La cristallisation des protéines est une méthode permettant de produire des formes galéniques solides pures et stables, ainsi qu'un certain nombre de produits thérapeutiques injectables et perfusables associés à des cristaux de protéines. Par le passé, la cristallisation des protéines était une activité de laboratoire destinée à soutenir la cristallographie aux rayons X, mais en raison de la croissance exponentielle des produits thérapeutiques à base de protéines, la mise à l'échelle de la cristallisation des protéines à des niveaux de production devient de plus en plus importante et fait l'objet d'une attention particulière.

La mise à l'échelle de la cristallisation des protéines est fondamentalement analogue à celle des petites molécules en ce qui concerne la nécessité d'optimiser les paramètres critiques du processus (CPP) à l'échelle du laboratoire afin d'atteindre les attributs critiques de qualité (CQA) d'une substance médicamenteuse cristallisée à l'échelle commerciale. Une plateforme holistique pour le développement et la mise à l'échelle du processus de cristallisation des protéines englobe généralement :

• La caractérisation in situ du système de particules
• La surveillance spectroscopique et la caractérisation des polymorphes
• L'optimisation des procédures et des stratégies de contrôle par rétroaction grâce à des modules et des capteurs intégrés

La cristallisation des protéines trouve des applications pharmaceutiques majeures : la chimie médicinale via la biologie structurale, le développement de médicaments à base de protéines, la mise à l'échelle, la séparation et la purification, la formulation et l'administration des médicaments.

• La chimie médicinale via la biologie structurale. Les progrès des techniques de cristallisation des protéines et l'amélioration de la cristallographie aux rayons X ont permis de déterminer des dizaines de milliers de structures protéiques en 3D. Il est possible de comprendre en détail les interactions entre les médicaments et leurs récepteurs en déterminant la structure de ces macromolécules complexes et en visualisant les sites de liaison. Ces informations permettent une meilleure compréhension au niveau moléculaire des inhibiteurs de protéines, des activateurs allostériques, des cofacteurs et même des sites catalytiques enzymatiques ou « sites actifs », ce qui se traduit par de meilleurs médicaments dotés d’une efficacité accrue. Les progrès considérables réalisés dans le développement des protéases du VIH illustrent parfaitement l’importance de la compréhension de la structure des inhibiteurs de protéines par la cristallographie.
• Développement, mise à l'échelle, séparation et purification pour les thérapies à base de protéines. Outre la culture de cristaux de protéines uniques pour la cristallographie aux rayons X, l'industrie pharmaceutique a intensifié ses efforts dans le développement de thérapies à base de cristaux de protéines. L'objectif de ces applications est de développer et de produire à grande échelle des quantités importantes de cristaux de protéines purs et stables, présentant une taille de particules correcte et une distribution granulométrique bien contrôlée. Par rapport à la chromatographie préparative, la cristallisation des protéines a le potentiel de constituer un moyen alternatif rentable de séparation et de purification des macromolécules, ainsi que pour l'isolement de molécules chirales. Les outils permettant de passer à l'échelle supérieure la cristallisation des protéines sont analogues à ceux utilisés pour la mise à l'échelle des réactions chimiques, avec la nécessité de comprendre les CPP et leur effet sur les CQA.
• Formulation et administration des médicaments. Les thérapies protéiques sont administrées sous forme de solutions et peuvent être administrées par injection ou perfusion. Comme de grandes quantités de protéines doivent être administrées, les solutions protéiques perfusées sont diluées pour éviter les problèmes de viscosité et d'agrégation. Cela est moins pratique pour le patient et l'hôpital en raison du temps nécessaire pour perfuser l'ensemble du traitement, mais peut également contribuer à une moindre observance du patient vis-à-vis de toute forme d'administration parentérale. L'utilisation de la forme cristalline des protéines en suspension présente un grand intérêt, car ces formulations posent moins de problèmes de viscosité et peuvent être administrées à des concentrations plus élevées. Un autre point essentiel est que la taille des cristaux de protéines doit être soigneusement contrôlée pour garantir que la suspension puisse passer facilement à travers une aiguille d'injection ou de perfusion. Il est également important que les cristaux résiduels qui ne se dissolvent pas lors de la reconstitution ne dépassent pas des tailles de particules critiques susceptibles de provoquer des effets indésirables dus à une accumulation capillaire dans le système vasculaire, ce qui implique généralement de minimiser les quantités significatives de particules > 15 µm.

1. Choisissez un solvant approprié. Les critères à prendre en compte sont notamment la quantité de soluté pouvant être dissoute (solubilité), la facilité de manipulation du solvant (sécurité) et l'influence du solvant sur la stabilité et l'énergie libre du peptide ou de la protéine.
2. Obtenir une sursaturation. Chauffer la substance médicamenteuse peptidique/protéique soluble dans le solvant ou le tampon jusqu'à la tolérance maximale autorisée (généralement limitée par la dénaturation). La solution deviendra sursaturée.
3. Cristalliser le produit en contrôlant les CPP. Réduire la solubilité par refroidissement, ajout d'un antisolvant, évaporation ou réaction. À mesure que la solubilité diminue, un point est atteint où les cristaux vont s'amorcer puis croître. Des cristaux de produit de haute pureté devraient se former, bien que des motifs à haute énergie libre puissent former des structures alternatives ou non cristallines ; pour éviter cela, un contrôle minutieux des CPP est nécessaire, si cela est même possible.
4. Laisser le système atteindre l'équilibre. Cette étape vise à maximiser le rendement en produit pharmaceutique solide.
5. Filtrer et sécher le produit purifié.

Il existe plusieurs méthodes utilisées pour faire croître des cristaux de protéines ; parmi les plus courantes, on trouve la diffusion de vapeur et la méthode des micro-lots. La première méthode comporte deux variantes, appelées « goutte suspendue » et « goutte posée », qui fonctionnent toutes deux fondamentalement de la même manière. Dans un système fermé, une goutte de solution contenant la protéine, un tampon et un précipitant s’équilibre avec un réservoir contenant des concentrations plus élevées en soluté de la même solution, mais sans la protéine. L'eau contenue dans la goutte contenant la protéine s'évapore et est attirée vers la solution à plus forte concentration dans le réservoir. À mesure que la concentration en solutés dans la goutte augmente, la protéine commence à se cristalliser. Dans la méthode du micro-batch, les protéines et les autres réactifs sont introduits et contenus sous une fine couche d'huile minérale qui empêche la diffusion de l'eau. Le micro-batch est essentiellement un petit réacteur contenant tous les ingrédients nécessaires aux concentrations correctes et stables pour permettre la cristallisation.

Comme la détermination de l'ensemble correct de réactifs, de paramètres et de conditions nécessaires à la cristallisation d'une protéine est souvent empirique, le moyen le plus pratique pour réussir la cristallisation des protéines consiste à utiliser une gamme variée de conditions expérimentales basées sur l'expérience antérieure. La manière la plus simple d'y parvenir est d'utiliser des kits de criblage de cristaux de protéines disponibles dans le commerce, qui contiennent des solutions préemballées avec des tampons, des précipitants, etc., dans des plaques multipuits. La méthode de diffusion de vapeur en goutte suspendue est appliquée pour faire croître des cristaux avec ces kits. Lorsqu'un criblage à grande échelle est nécessaire, il existe des systèmes à haut débit qui automatisent la méthode des micro-lots, ce qui permet de gagner du temps et d'éviter les tâches fastidieuses tout en minimisant la quantité de protéine purifiée requise. Pour les cristallisations de protéines à grande échelle requises pour des applications pharmaceutiques ou industrielles, les informations obtenues lors des expériences de criblage constituent la base pour une application dans des systèmes de réacteurs automatisés à plus grande échelle caractérisés par une PAT in situ et en temps réel.

Dans le cadre du développement de procédés et de la fabrication, l'une des premières étapes essentielles pour réussir la cristallisation des protéines consiste à s'assurer de disposer d'un approvisionnement suffisant en protéines hautement purifiées et bien caractérisées. Outre la pureté de la protéine (c'est-à-dire l'absence de contaminants, tels que les impuretés issues des matrices de fermentation), celle-ci doit être homogène et stable (ou stabilisée) en solution, avec :

• Une agrégation minimale (Figure A)
• Une structure secondaire, tertiaire et quaternaire correcte (Figure B)
• Toute modification par conjugaison ou recombinaison (Figure C)

De plus, tous les réactifs et solvants utilisés dans le processus de cristallisation des protéines doivent être exempts de contaminants, car ceux-ci peuvent avoir un effet significatif sur la nucléation.

Tout comme pour la cristallisation des petites molécules, les protéines se cristallisent à partir de solutions sursaturées. Pour les petites molécules qui forment des réseaux cristallins robustes, le contrôle de la température est le principal moyen d’obtenir une sursaturation ; cette méthode est également utile pour les protéines. Cependant, la plage de températures admissibles est plus restreinte, car les cristaux de protéines contiennent généralement du solvant dans leur structure cristalline, sont souvent sensibles à la température et ont tendance à se dénaturer et à s’agréger.

Les petites molécules ont nettement moins de degrés de liberté stéréoscopique et se cristallisent donc beaucoup plus facilement. Les peptides, qui sont des molécules de grande taille, présentent beaucoup plus d'interactions internes acides, basiques, polaires et non polaires, ainsi que des forces répulsives qui s'opposent à une cristallisation ordonnée, un phénomène qui s'accentue encore davantage pour les protéines de plus grande taille. La plupart des peptides compatibles avec la cristallisation contiennent également un nombre important de liaisons disulfure, qui sont cruciales pour l'immobilisation des motifs structurels. L'ampleur du désordre intramoléculaire ou des variations possibles de la structure est un attribut important qui détermine si un peptide ou une protéine pourra cristalliser plutôt que de précipiter. Même si la molécule présente des caractéristiques propices à la cristallisation, il existe un certain nombre de paramètres de procédé qui influencent la viabilité commerciale du processus et doivent être caractérisés.

Au-delà de la température, un certain nombre d'autres facteurs affectent ou favorisent la cristallisation des protéines par sursaturation, notamment l'ajustement du pH et la force ionique d'une solution, l'ajout de sels et de précipitants tels que le PEG pour aider à réduire la solubilité des protéines, le type de ligand présent, etc. La clé consiste à sursaturer la solution dans un environnement qui ne perturbe pas le caractère normal de la protéine. Cela souligne l'importance de trouver un ensemble de variables et de conditions permettant d'obtenir des cristaux présentant une morphologie et une pureté correctes, ainsi que des vitesses de croissance acceptables.

La cristallisation des protéines s'effectue à travers une série de mécanismes interdépendants :

1. Nucléation
2. Croissance
3. Exclusion de l'huile lors de la cristallisation
4. Agglomération
5. Rupture
6. Ensemencement
7. Chimie du polymorphisme

Ces mécanismes, qui échappent souvent aux scientifiques, jouent un rôle prépondérant dans le résultat d'un processus de cristallisation.

Le développement et la mise à l'échelle des procédés de cristallisation pour les thérapies à base de protéines exigent une compréhension approfondie des variables et des conditions qui influencent le processus de cristallisation. Comme pour toute cristallisation, l'obtention de la forme cristalline, de la configuration, de la taille des particules et de la distribution granulométrique souhaitées nécessite un contrôle rigoureux afin de garantir une qualité constante du produit. Toute variation des CQA des suspensions de cristaux de protéines affectera directement l'efficacité thérapeutique. Les cristaux de protéines étant très sensibles à leur environnement de croissance et pouvant être facilement endommagés par une température excessive, une perte de solvant et d'autres contraintes externes, voire par le processus d'échantillonnage, il est souhaitable de mesurer les CPP et la qualité du produit in situ, c'est-à-dire sans retirer les cristaux de leur milieu en solution.

• Les réacteurs chimiques automatisés EasyMax et Optimax permettent un contrôle, un réglage et un enregistrement précis des paramètres, notamment la température, le pH, la conductivité, la vitesse d'agitation et le dosage des tampons et des excipients, qui sont d'une importance cruciale pour le succès du développement et de la mise à l'échelle des cristallisations de protéines
• Les outils de technologie analytique in situ qui facilitent la surveillance, le dépannage et la correction des écarts de processus sont également utiles
  • La spectroscopie Raman in situ et la spectroscopie FTIR permettent de suivre les concentrations en réactifs, de surveiller la croissance de la structure cristalline et de mesurer la concentration des solutions sursaturées
  • La technologie ParticleTrack (avec FBRM) surveille en temps réel l'évolution de la taille des cristaux et de leur distribution granulométrique au fur et à mesure que les étapes clés du processus de cristallisation se déroulent
  • EasyViewer permet la visualisation et l'analyse d'images du processus de cristallisation au fur et à mesure de son déroulement

Lorsque des réacteurs de laboratoire automatisés sont utilisés en association avec des analyseurs in situ en temps réel, l'impact des paramètres de processus sur les mécanismes de cristallisation tels que l'agrégation, la croissance, l'agglomération, la rupture et le changement de forme peut être identifié. Un contrôle précis du processus de cristallisation, associé à une surveillance continue et in situ de la progression de la formation cristalline, permet une optimisation et une mise à l'échelle fondées sur des faits et guidées par les données.

Le réacteur de laboratoire automatisé EasyMax est une station de travail complète destinée à l'optimisation des paramètres de cristallisation des protéines, afin de faciliter la conception et la mise en œuvre du développement et de la mise à l'échelle. Ce système entièrement automatisé permet un contrôle précis des paramètres de processus.

• Gérer les paramètres de processus (CPP), notamment les débits de dosage, la température, l'agitation, le pH et la conductivité
• S'intègre facilement aux analyses in situ pour la cristallisation, notamment ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) et EasyViewer (analyse d'images in situ)
• Le logiciel iC permet l'exécution et le contrôle automatisés de toutes les expériences et de l'équipement périphérique, ainsi que la saisie complète des données et la tenue des registres

ReactIR utilise la spectroscopie dans l'infrarouge moyen pour mesurer la phase en solution dans le cadre d'études de cristallisation. Les mesures ReactIR ne sont pas affectées par les solides en suspension, les bulles ou d'autres particules.ReactRaman utilise la spectroscopie Raman pour fournir une analyse moléculaire des particules en solution

• Suivre in situ et en temps réel les solutés individuels en cours de cristallisation.
• Mesurez les concentrations en solution pour étayer les études de sursaturation
• Fournissez des analyses de données exploitables pour la prise de décision et le contrôle en temps réel

• Suivez la croissance, la structure et la morphologie des cristaux de manière non destructive, in situ et en temps réel
• Déterminez les effets des paramètres et optimisez les conditions et variables de cristallisation pour atteindre les objectifs de qualité

ParticleTrack utilise la technologie FBRM (Focused Beam Reflectance Measurement). Il s'agit d'un instrument optique à sonde qui s'insère directement dans un récipient pour suivre en temps réel l'évolution de la taille et du nombre de particules. ParticleTrack utilise des mesures de la distribution de la longueur de corde pour obtenir la distribution granulométrique (CSD).

• Les cristaux de protéines sont surveillés en continu, à mesure que les conditions expérimentales varient
• Suivez la croissance par lots ou en continu pendant la cristallisation en temps réel, sans qu'il soit nécessaire de prélever d'échantillon
• Caractérisez les conditions qui affectent la nucléation, l'agrégation, le polymorphisme et d'autres attributs du système

EasyViewer est un instrument à sonde qui s'insère directement dans un récipient pour capturer des images de systèmes de particules. EasyViewer effectue une analyse d'images et mesure le nombre de particules, la distribution granulométrique et la morphologie à partir d'images en ligne et résolues dans le temps du processus, ce qui permet de suivre l'évolution des populations au fil du temps.

• Les cristaux de protéines sont surveillés en continu, à mesure que les conditions expérimentales varient
• Suivez en temps réel la croissance par lots ou en continu pendant la cristallisation, sans qu'il soit nécessaire de prélever des échantillons
• Visualisez en temps réel les paramètres de cristallisation qui influent sur la nucléation, l'agrégation, le polymorphisme et d'autres caractéristiques du système

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018).

Surveillance en temps réel de la cristallisation des produits biopharmaceutiques : de la distribution de la longueur de corde à la distribution de la taille des cristaux pour le lysozyme, l’insuline rHu et la vitamine B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Les auteurs ont rapporté avoir réussi à développer une approche efficace pour la surveillance en temps réel des cristallisations biopharmaceutiques. Cette procédure utilise ParticleTrack pour mesurer la CLD d’une série de molécules biopharmaceutiques dans des conditions statiques et dynamiques, puis applique une modélisation mathématique pour convertir la CLD en CSD. Les biomolécules étudiées présentent différentes formes cristallines, qui dépendent des conditions expérimentales de la cristallisation. Le lysozyme peut produire des cristaux tétragonaux et en forme d’aiguille, l’insuline rHu forme des cristaux rhomboédriques et la vitamine B12 forme des cristaux polyédriques.

Les auteurs ont développé des modèles pour déterminer la CSD des cristaux tétragonaux, rhomboédriques et polyédriques à faible rapport d'aspect, ainsi que des cristaux en forme d'aiguille à rapport d'aspect élevé. Les auteurs ont utilisé trois modèles différents pour déterminer la distribution granulométrique :

• Un modèle développé par un autre groupe de recherche, qui supposait que les cristaux pouvaient être représentés comme des sphères (diamètre équivalent sphérique, SED), s'est avéré efficace pour les cristaux à faible rapport d'aspect
• Pour les cristaux à rapport d'aspect élevé, les auteurs de cette étude ont développé un modèle basé sur la largeur
• Enfin, ils ont développé un modèle basé sur la longueur, qui nécessitait de spécifier le rapport d'aspect

Les résultats des modèles développés pour calculer la CSD à partir des mesures FBRM ont ensuite été comparés aux mesures de la CSD obtenues par analyse d'images.

La surveillance d'une suspension cristalline opaque pose des défis, en particulier lorsque les spécifications de fabrication exigent une distribution granulométrique (PSD) étroite. Pour les formulations de protéines cristallines injectables, la PSD peut fortement influencer la viscosité et servir d'alerte précoce en cas d'agrégation ou d'autres phénomènes de dégradation susceptibles de compromettre la formulation. La surveillance in situ a été utilisée dans une étude de cristallisation par lots à l'échelle industrielle afin de caractériser la formation et la croissance des cristaux d'hormone de croissance humaine (hGH). L'analyse en temps réel a détecté un écart par rapport au profil PSD habituel, causé par des différences de mélange entre les cuves. Ce résultat a été confirmé par une analyse d'images (IA) hors ligne réalisée par la suite.

Vous trouverez ci-dessous une sélection d'articles de revues consacrés à la cristallisation des protéines.

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Continuous Crystallization Processes in Pharmaceutical Manufacturing: A Review. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Estimation des paramètres de la cinétique stochastique de nucléation primaire par des intégrales stochastiques à l'aide de mesures de réflectance par faisceau focalisé. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Surveillance en temps réel de la cristallisation biopharmaceutique : de la distribution de la longueur des cordes à la distribution de la taille des cristaux pour le lysozyme, l'insuline rHu et la vitamine B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulation de la cristallisation du lysozyme et de l'auto-assemblage supramoléculaire en solution à l'aide de liquides ioniques. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modélisation et contrôle de la forme cristalline dans la cristallisation continue des protéines. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Amélioration du taux de production de cristaux et réduction de la polydispersité dans la cristallisation continue des protéines. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Cristaux de protéines pour l'administration de produits biopharmaceutiques. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301