Eiwitkristallisatie

Proteïne kristallisatie is de handeling en methode om gestructureerde, geordende roosters te creëren voor complexe macromoleculen. Eiwitten zijn doorgaans amorf als vaste stoffen en gevoelig voor denaturatie, terwijl eiwitten die in kristallijne roosters voorkomen, denaturatie weerstaan en een grotere stabiliteit bezitten. Eiwitten kunnen kristalliseren als ze in geschikte, gastvrije omgevingen worden geplaatst. Proteïne kristallisatie wordt zowel als een kunst als een wetenschap beschouwd, vanwege de zeer complexe interacties van variabelen die het proteïne kristallisatieproces beïnvloeden.

De meest voorkomende reden om proteïne kristallen te creëren is ter ondersteuning van structurele biologische onderzoeken, meestal via röntgendiffractie kristallografie. Onderzoekers kunnen gebieden in het raamwerk visualiseren die interactie met andere moleculen mogelijk maken door de driedimensionale structuren van eiwitten te begrijpen (bijvoorbeeld om beter te begrijpen hoe enzymen, substraten en liganden met elkaar interageren). Bovendien is kristallisatie een effectieve manier om zuivere eiwitten te creëren die vrij zijn van verontreiniging door andere eiwitten of vreemd biologisch materiaal, en biedt daarmee een alternatief voor zuivering en scheiding ten opzichte van preparatieve chromatografie. 

Kristallisatie verloopt via een reeks onderling afhankelijke mechanismen die elk uniek worden beïnvloed door de keuze van procesparameters: nucleatie, groei, olie afscheiding, agglomeratie, breuk, zaaien en polymorfe overgang.

Vaak vinden deze mechanismen gelijktijdig plaats, waardoor een effectieve kristallisatieontwerp een uitdaging is. Bij gebrek aan mechanistisch begrip vertrouwen wetenschappers op trial-and-error om procesparameters aan te passen en opbrengst, zuiverheid en kristalgrootte te optimaliseren. Door te begrijpen welke mechanismen tijdens kristallisatie optreden, kunnen wetenschappers strategieën inzetten om een kristalproduct met de gewenste eigenschappen te leveren.

Eiwitten worden steeds belangrijker als therapeutische geneesmiddelen. Het produceren van eiwitten met de benodigde stabiliteit brengt echter belangrijke uitdagingen met zich mee, waaronder productvariatie, verlies van structuur dat de werkzaamheid zou verminderen en de vorming van potentieel gevaarlijke bijproducten. Proteïne kristallisatie is een methode om zuivere, stabiele vaste doseringsvormen te produceren en een aantal geïnjecteerde en geïnfuseerde therapeutica die geassocieerd zijn met proteïne kristallen. In het verleden was proteïne kristallisatie een laboratoriumactiviteit ter ondersteuning van röntgenkristallografie, maar vanwege de exponentiële groei van eiwitgebaseerde therapeutica wordt het opschalen van proteïne kristallisaties naar productieniveaus steeds belangrijker en een gebied van intensieve focus.

Opschaling van proteïne kristallisatie is fundamenteel analoog aan kristallisatie van kleine moleculen in de vereisten om Kritische Procesparameters (CPP's) op laboratoriumschaal te optimaliseren om Kritische Kwaliteitsattributen (CQA's) van een gekristalliseerde geneesmiddelstof op commerciële schaal te bereiken. Een holistisch platform voor procesontwikkeling en opschaling van proteïne kristallisatie omvat doorgaans:

• In-situ karakterisering van het deeltjesysteem
• Spectroscopische monitoring en polymorf karakterisering
• Optimalisatie van procedure- en terugkoppelingscontrolestrategieën via geïntegreerde modules en sensoren

Er zijn belangrijke farmaceutische toepassingen verbonden aan proteïne kristallisatie: medicinale chemie via structurele biologie, ontwikkeling van eiwitgeneesmiddelen, opschaling, scheiding en zuivering, formulering en medicijnafgifte.

• Medicinale chemie via structurele biologie. Vooruitgang in proteïne kristallisatietechnieken en verbeterde röntgenkristallografie hebben geleid tot de afleiding van tienduizenden driedimensionale eiwitstructuren. Het begrijpen van interacties tussen geneesmiddel en receptor in detail is mogelijk door de structuur van deze complexe macromoleculen te bepalen en bindingsplaatsen te visualiseren. Deze informatie maakt een beter begrip op moleculair niveau mogelijk van proteïne-inhibitoren, allosterische activatoren, co-factoren en zelfs enzymatische katalytische sites of 'actieve sites' – wat resulteert in betere geneesmiddelen met verbeterde werkzaamheid. Een klassiek voorbeeld van het belang van het begrijpen van de structuur van proteïne-inhibitoren via kristallografie wordt gedemonstreerd door de grote vooruitgang in de ontwikkeling van HIV-proteases.
• Ontwikkeling, opschaling, scheiding en zuivering voor eiwitgebaseerde therapeutica. Naast het kweken van enkele proteïnekristallen voor röntgenkristallografie, heeft de farmaceutische industrie haar inspanningen opgevoerd in de ontwikkeling van op proteïnekristallen gebaseerde therapeutica. Het doel van deze toepassingen is het ontwikkelen en opschalen naar grote hoeveelheden zuivere, stabiele proteïnekristallen met de juiste deeltjesgrootte en goed gecontroleerde deeltjesgrootteverdeling. Relatief tot preparatieve chromatografie heeft proteïne kristallisatie het potentieel een kosteneffectief alternatief te zijn voor scheiding en zuivering van macromoleculen en voor isolatie van chirale moleculen. De hulpmiddelen voor het opschalen van proteïne kristallisaties zijn analoog aan die gebruikt voor het opschalen van chemische reacties met de noodzaak om CPP's en hun effect op CQA's te begrijpen.
• Formulering en medicijnafgifte. Proteïnetherapeutica worden toegediend als oplossingen en kunnen via injectie of infusie worden toegediend. Omdat hoge hoeveelheden eiwit moeten worden toegediend, worden de geïnfuseerde eiwitoplossingen verdund om viscositeit en aggregatieproblemen te voorkomen. Dit is minder handig voor de patiënt en het ziekenhuis vanwege de tijd die nodig is om de hele behandeling te infuseren, maar kan ook bijdragen aan het fenomeen van lagere therapietrouw bij elke vorm van parenteraal toediening. Het gebruik van de kristallijne vorm van eiwitten in suspensie is van groot belang, aangezien deze formuleringen minder viscositeitsproblemen hebben en bij hogere concentraties kunnen worden toegediend. Een ander belangrijk punt is dat de grootte van proteïnekristallen zorgvuldig moet worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de suspensie gemakkelijk door een injectie- of infusienaald kan passeren. Ook van belang is dat eventuele resterende kristallen die niet oplossen tijdens reconstitutie ook niet de kritische deeltjesgroottes mogen overschrijden die bijwerkingen kunnen veroorzaken door ophoping in de haarvaten, waarbij over het algemeen significante deeltjeshoeveelheden >15 µm worden geminimaliseerd. 

1. Kies een geschikt oplosmiddel. Veelvoorkomende overwegingen zijn hoeveel opgeloste stof kan worden opgelost (oplosbaarheid), hoe praktisch het oplosmiddel is in gebruik (veiligheid) en hoe het oplosmiddel de stabiliteit en vrije-energietoestanden van het peptide of eiwit beïnvloedt.
2. Bereik supersaturatie. Verhit het oplosbare peptide-/eiwitgeneesmiddel in oplosmiddel of buffer tot de maximaal toegestane tolerantie (meestal beperkt door denaturatie). De oplossing wordt supersaturaatachtig.
3. Kristalliseer het product door CPP's te beheersen. Verminder de oplosbaarheid door afkoeling, toevoeging van anti-oplosmiddel, verdamping of reactie. Naarmate de oplosbaarheid afneemt, wordt een punt bereikt waarop kristallen zullen nucleëren en vervolgens groeien. Zeer zuivere productkristallen zouden moeten groeien, hoewel motieven met hoge vrije energie alternatieve of niet-kristalstructuren kunnen vormen; het voorkomen hiervan vereist zorgvuldige CPP-beheersing indien dit praktisch is.
4. Laat het systeem evenwicht bereiken. Dit wordt gedaan om de opbrengst van vaste geneesmiddelproducten te maximaliseren.
5. Filter en droog het gezuiverde product.

Er zijn verschillende methoden die worden gebruikt om eiwitkristallen te laten groeien; de meest voorkomende zijn dampdiffusie en microbatch. De eerste methode kent twee varianten, beschreven als hanging drop en sitting drop, en beide werken fundamenteel op dezelfde manier. In een afgesloten systeem komt een druppel oplossing met het eiwit, buffer en precipitanten in evenwicht met een reservoir dat hogere concentraties opgeloste stoffen van dezelfde oplossing bevat, maar zonder het eiwit. Water uit de druppel met het eiwit verdampt en wordt aangetrokken tot de oplossing met hogere concentratie in het reservoir. Naarmate de concentratie van opgeloste stoffen in de druppel toeneemt, begint het eiwit te kristalliseren. Bij de microbatch-methode worden de eiwitten en andere reagentia geïntroduceerd en onder een dunne laag mineraalolie gehouden die diffusie van water elimineert. De microbatch is in wezen een kleine reactor die alle benodigde ingrediënten bevat in de juiste, stabiele concentraties om kristallisatie mogelijk te maken.

Aangezien het vinden van de juiste set reagentia, parameters en condities om een eiwit te kristalliseren vaak empirisch is, is de meest praktische manier voor succesvolle eiwitkristallisatie het gebruik van een variërend bereik aan experimentele condities gebaseerd op eerdere ervaringen. De gemakkelijkste manier om dit te doen is het gebruik van commercieel verkrijgbare eiwitkristal-screeningskits die voorverpakte oplossingen met buffers, precipitanten, enz. bevatten in multi-well platen. De hanging drop dampdiffusiemethode wordt toegepast om kristallen te laten groeien met deze kits. Wanneer grootschalige screening vereist is, zijn er high-throughput systemen beschikbaar die de microbatch-methode automatiseren, waardoor tijd en eentonigheid worden bespaard en tegelijkertijd de hoeveelheid gezuiverd eiwit die nodig is wordt geminimaliseerd. Voor grootschalige eiwitkristallisaties die nodig zijn voor farmaceutische of industriële toepassingen, vormen de verkregen gegevens uit screeningsproeven de basis voor toepassing in grotere geautomatiseerde reactorsystemen gekenmerkt door in-situ, realtime PAT. 

Ter ondersteuning van procesontwikkeling en productie is een van de belangrijkste eerste stappen bij het succesvol kristalliseren van eiwitten ervoor te zorgen dat er een adequate voorraad van hooggezuiverd en goed gekarakteriseerd eiwit beschikbaar is. Naast dat het eiwit zuiver moet zijn (d.w.z. vrij van verontreinigingen, zoals onzuiverheden uit fermentatiematrices), moet het eiwit homogeen en stabiel (of gestabiliseerd) zijn in oplossing met:

• Minimale aggregatie (Figuur A)
• Correcte secundaire, tertiaire en quaternaire structuur (Figuur B)
• Eventuele conjugaat- of recombinante modificaties (Figuur C)

Daarnaast moeten alle reagentia en oplosmiddelen die worden gebruikt in het eiwitkristallisatiesproces vrij zijn van verontreinigingen, aangezien deze een significante invloed kunnen hebben op nucleatie.

Net als bij kristallisatie van kleine moleculen kristalliseren eiwitten uit supersaturaatachtige oplossingen. Voor kleine moleculen die robuuste kristalroosters vormen, is temperatuurmanipulatie een primaire methode om supersaturatie te bereiken; dit is ook nuttig voor eiwitten. Er is echter een beperkter temperatuurbereik toegestaan omdat eiwitkristallen doorgaans oplosmiddel als onderdeel van de kristalstructuur bevatten, vaak temperatuurgevoelig zijn en vatbaar voor denaturatie en aggregatie.

Kleine moleculen hebben aanzienlijk minder stereoscopische vrijheidsgraad en kristalliseren daardoor veel gemakkelijker. Grote molecuulpeptiden hebben veel meer interne zure, basische, polaire, niet-polaire interacties en afstotende krachten die geordende kristallisatie tegenwerken, een fenomeen dat nog sterker is bij nog grotere eiwitten. De meeste kristallisatiemogelijke peptiden bevatten ook een aanzienlijk aantal disulfidebruggen die cruciaal zijn voor het immobiliseren van structurele motieven. De mate van intramoleculaire wanorde of mogelijke variatie in structuur is een belangrijke eigenschap die bepaalt of een peptide of eiwit ooit kan kristalliseren in plaats van precipitatie. Zelfs als het molecuul eigenschappen heeft die kristallisatie bevorderen, zijn er verschillende procesparameters die de commerciële haalbaarheid beïnvloeden en gekarakteriseerd moeten worden.

Naast temperatuur zijn er verschillende andere factoren die eiwitkristallisatie via supersaturatie beïnvloeden/ondersteunen, waaronder pH-aanpassing en de ionsterkte van een oplossing, toevoeging van zouten en precipitanten zoals PEG om de oplosbaarheid van het eiwit te verminderen, het type aanwezige ligand, enz. De sleutel is om de oplossing te supersatureren binnen een omgeving die het normale karakter van het eiwit niet verstoort. Dit benadrukt het belang van het vinden van een set variabelen en condities die resulteren in kristallen met de juiste morfologie, zuiverheid en acceptabele groeisnelheden.

Eiwitkristallisatie verloopt via een reeks onderling afhankelijke mechanismen:

1. Nucleatie
2. Groei
3. Oiling Out bij Kristallisatie
4. Agglomeratie
5. Breuk
6. Zaaiing
7. Polymorfisme Chemie

Deze mechanismen, die vaak verborgen zijn voor wetenschappers, spelen een dominante rol bij het bepalen van het resultaat van een kristallisatieproces.

Ontwikkeling en opschaling van kristallisaties voor eiwitgebaseerde therapeutica vereist een diepgaand begrip van de variabelen en omstandigheden die het kristallisatieproces beïnvloeden. Zoals bij andere kristallisaties, vereist het bereiken van de gewenste kristalvorm, vorm, deeltjesgrootte en grootteverdeling zorgvuldige controle om consistente productkwaliteit te bereiken. Elke variatie in de CQAs van eiwitkristalsuspensies zal direct de therapeutische werkzaamheid beïnvloeden. Omdat eiwitkristallen zeer gevoelig zijn voor hun groeimilieu en gemakkelijk beschadigd kunnen worden door overmatige temperatuur, verlies van oplosmiddel en andere externe spanningen of zelfs het proces van monstername, is het wenselijk om CPP's en productkwaliteit in situ te meten, dat wil zeggen zonder de kristallen uit hun oplossingsmilieu te verwijderen.

• EasyMax en Optimax geautomatiseerde chemische reactoren maken nauwkeurige controle, aanpassing en registratie van parameters mogelijk, waaronder temperatuur, pH, geleidbaarheid, roersnelheid en dosering van buffers en hulpstoffen, die van cruciaal belang zijn voor succesvolle ontwikkeling en opschaling van eiwitkristallisaties
• In-situ analytische technologietools die helpen bij monitoring, probleemoplossing en correctie van procesafwijkingen zijn ook nuttig
  • In-situ Raman spectroscopie en FTIR spectroscopie volgen reagentia concentraties, monitoren kristalstructuurgroei en meten ook de concentratie van oververzadigde oplossingen
  • ParticleTrack (met FBRM) technologie bewaakt de veranderende kristalgrootte en grootteverdeling in realtime als belangrijke segmenten van het kristallisatieproces doorgaan
  • EasyViewer maakt visualisatie en beeldanalyse van het kristallisatieproces mogelijk terwijl het vordert

Wanneer geautomatiseerde laboratoriumreactoren worden gebruikt in combinatie met realtime in-situ analyzers, kan de impact van procesparameters op kristallisatie-mechanismen zoals aggregatie, groei, agglomeratie, breuk en vormverandering worden geïdentificeerd. Nauwkeurige controle over het kristallisatieproces in combinatie met continue, in-situ monitoring van de voortgang van de kristalvorming maakt optimalisatie en opschaling feitelijk en datagedreven.

De EasyMax geautomatiseerde laboratoriumreactor is een complete werkplek voor parameteroptimalisatie in eiwitkristallisatie ter ondersteuning van ontwikkeling en opschalingsontwerp en uitvoering. Dit volledig geautomatiseerde systeem maakt nauwkeurige controle over procesparameters mogelijk.

• Beheer CPP's inclusief doseringssnelheden, temperatuur, agitatie, pH en geleidbaarheid
• Integreert gemakkelijk met in-situ analytica voor kristallisatie, waaronder ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) en EasyViewer (in-situ beeldanalyse)
• iC-software maakt geautomatiseerde uitvoering en controle van alle experimenten en randapparatuur mogelijk, evenals volledige gegevensvastlegging en archivering

ReactIR gebruikt midden-infraroodspectroscopie om de oplossingsfase te meten in kristallisatiestudies. ReactIR-metingen worden niet beïnvloed door gesuspendeerde vaste stoffen, bellen of andere deeltjesmassa.

• Volg individuele kristallisatiereagentia in situ en in realtime.
• Meet oplossingsconcentraties ter ondersteuning van oververzadigingsstudies
• Lever bruikbare data-analyses voor realtime besluitvorming en controle

ReactRaman gebruikt Raman spectroscopie om moleculaire analyse van deeltjes in oplossing te bieden

• Volg kristalgroei, structuur en morfologie niet-destructief, in situ en in realtime
• Bepaal parameter effecten en optimaliseer kristallisatiecondities en variabelen om kwaliteitsdoelstellingen te bereiken

ParticleTrack maakt gebruik van Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)-technologie en is een optisch, sonde-gebaseerd instrument dat direct in een vat wordt ingebracht om de veranderende deeltjesgrootte en -aantal in real time te volgen. ParticleTrack gebruikt Chord Length Distribution-metingen om de Crystal Size Distribution (CSD) te verkrijgen.

• Eiwitkristallen worden continu gemonitord terwijl de experimentele omstandigheden worden aangepast
• Volg batch- of continue groei tijdens kristallisatie in real time zonder dat er een monster hoeft te worden verwijderd
• Karakteriseer omstandigheden die nucleatie, aggregatie, polymorfisme en andere systeemkenmerken beïnvloeden

EasyViewer is een sonde-gebaseerd instrument dat direct in een vat wordt ingebracht om beelden van deeltjesystemen vast te leggen. EasyViewer voert beeldanalyse uit en meet het aantal deeltjes, de grootteverdeling en morfologie van tijdsafhankelijke, inline beelden van het proces, waardoor populaties in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd.

• Eiwitkristallen worden continu gemonitord terwijl de experimentele omstandigheden worden aangepast
• Volg batch- of continue groei tijdens kristallisatie in real time zonder dat er een monster hoeft te worden verwijderd
• Visualiseer kristallisatieparameters die nucleatie, aggregatie, polymorfisme en andere systeemkenmerken in real time beïnvloeden

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

De auteurs rapporteerden succes bij het ontwikkelen van een efficiënte methode voor real-time monitoring van biofarmaceutische kristallisaties. Deze procedure gebruikt ParticleTrack om de CLD te meten voor een reeks biofarmaceutische moleculen onder zowel statische als dynamische omstandigheden, en past vervolgens wiskundige modellering toe om de CLD om te zetten naar CSD. De biomoleculen die werden onderzocht hebben verschillende kristalvormen, afhankelijk van de experimentele omstandigheden van de kristallisatie. Lysozym kan tetragonale en naaldvormige kristallen produceren, rHu insuline vormt rhomboëdrische kristallen en B12 vormt polyëdrische kristallen.

De auteurs ontwikkelden modellen om CSD te bepalen voor de tetragonale, rhomboëdrische, polyëdrische kristallen met een lage aspectverhouding en naaldkristallen met een hoge aspectverhouding. De auteurs gebruikten drie verschillende modellen voor het bepalen van de kristalgrootteverdeling:

• Een model ontwikkeld door een andere onderzoeksgroep dat aannam dat kristallen als sferen konden worden voorgesteld (sferische equivalente diameter, SED) was effectief voor de kristallen met een lage aspectverhouding
• Voor kristallen met een hoge aspectverhouding ontwikkelden de auteurs in deze studie een model dat breedte-gebaseerd is
• Ten slotte ontwikkelden ze een lengte-gebaseerd model dat de aspectverhouding moest specificeren

De resultaten van de modellen die ontwikkeld zijn voor het berekenen van CSD uit de FBRM-metingen werden vervolgens vergeleken met CSD-metingen verkregen door beeldanalyse.

Het monitoren van een ondoorzichtige kristalsuspensie brengt uitdagingen met zich mee, vooral wanneer productspecificaties een nauwe deeltjesgrootteverdeling (PSD) vereisen. Voor injecteerbare eiwitkristalformuleringen kan de PSD de viscositeit sterk beïnvloeden en dient het tevens als een vroegtijdige waarschuwing voor aggregatie of andere degradatiegebeurtenissen die de formulering mogelijk kunnen aantasten. In-situ monitoring werd gebruikt in een opschalingsbatchkristallisatiestudie om de vorming en groei van menselijke groeihormoon (hGH) kristallen te karakteriseren. Real-time analyse detecteerde een afwijking van het gebruikelijke PSD-profiel veroorzaakt door verschillen in menging tussen de vaten. Dit werd bevestigd door daaropvolgende offline Beeldanalyse (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Continue kristallisatieprocessen in farmaceutische productie: een overzicht. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameterinschatting van de stochastische primaire nucleatiekinetiek via stochastische integralen met behulp van gefocuste straalreflectiemetingen. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-time monitoring van biopharmaceutische kristallisatie: chordlengteverdeling naar kristalgrootteverdeling voor lysozym, rHu insuline en vitamine B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulatie van kristallisatie in lysozym en supramoleculaire zelforganisatie in oplossing met behulp van ionische vloeistoffen. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modellering en controle van kristalvorm in continue eiwitkristallisatie. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Verbetering van de kristalproductiesnelheid en vermindering van polydispersiteit in continue eiwitkristallisatie. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Eiwitkristallen voor de toediening van biopharmaca. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301