Sinteza oligonukleotidov

Oligonukleotidi ali oligosi so kratki enojni ali dvoverižni segmenti nukleinskih kislin, ki so povezani skupaj v enoverižne biološke polimere. Posamezne nukleotidne baze lahko obravnavamo kot enakovredne monomerom, ki sestavljajo klasične kemične polimere. Nukleotid je sestavljen iz treh delov: baze, ki vsebuje dušik, molekule sladkorja s petimi ogljiki (ta dva dela sta nukleozid) in ene ali več fosfatnih skupin . Druga možnost je, da so nukleotidi sestavljeni iz nenaravnih ali nekanoničnih baz. Pogosti primeri vključujejo LNA (zaklenjene nukleinske kisline), Morpholino in strukturno spremenjene baze ali hrbtenice. 

Kompleksno povezovanje nukleotidov tvori biološko kritične biomolekule RNA in DNA. V primeru RNA, ki je enoverižni biopolimer, je sladkor riboza. V DNK dvoverižna molekula vsebuje sladkorno deoksiribozo. Kratka zaporedja deoksiriobonukleinskih kislin in ribonukleinskih kislin so gradniki pomembnih oligonukleotidov. Specifične povezave teh nukleotidov ustvarjajo ciljne biomolekule, ki se uporabljajo v bioloških, medicinskih, forenzičnih in kliničnih aplikacijah. 

Oligonukleotidi se lahko tvorijo encimsko s cepitvijo večjih biomolekul ali s ciljno kemijsko sintezo. V slednjem primeru je sinteza organonukleotidov kemični proces, s katerim se sintetizirajo nukleozidni fosforamiditi - ključni monomerni element oligonukleotidov. Nukleozidni fosforamiditi (znani tudi kot nukleozidi ali amiditi) so sami derivati naravnih ali sintetičnih nukleozidov.

Nukleotidi so torej sestavljene molekule, sestavljene iz kovalentno vezanega nukleozida in fosfatne skupine. Nukleotidi so povezani v določenem zaporedju, da tvorijo želeni produkt. Tako so oligonukleotidi sestavljeni iz kratkih segmentov nukleinskih kislin, ki so povezani skupaj in tvorijo enoverižne biološke polimere ("-mers"). Ker je večina oligonukleotidov (oligos) običajno sestavljena iz do 20 povezanih nukleotidov (čeprav jih je možnih več), jih lahko obravnavamo kot majhne biofarmacevtske molekule. 

Podobno kot druge farmacevtsko pomembne majhne molekule, sinteza oligonukleotidov zahteva skrben nadzor glede na temperaturo, pH, kakovost substratov itd. Zaradi tipičnih metod, ki se uporabljajo pri sintezi oligonukleotidov, daljše in bolj zapleteno zaporedje nukleotidov, težje je doseči cilje donosa, čistosti in stroškov. Procesne analitične tehnologije (PAT) so koristne pri doseganju teh ciljev.

Oligonukleotidni primerji in sonde

Najpogostejša uporaba sintetičnih oligonukleotidov je kot relativno kratke sonde in primerji (do 30-mer) v najrazličnejših aplikacijah. To vključuje sintezo nukleotidnega zaporedja, ki je seznanjeno ali "obratno-komplementarno" z večjo, ciljno verigo DNK ali RNA (ciljno zaporedje). Kot začetni premazi se oligosi običajno uporabljajo za sprožitev encimskih reakcij, na primer za ustvarjanje milijonov do milijard kopij kratkega ali dolgega ciljnega zaporedja. Znani primeri so verižna reakcija s polimerazo (PCR) ali metoda Sangerjevega zaporedja. Aplikacije za oligozačetnike vključujejo zaporedje DNK, izražanje genov, kloniranje in molekularno diagnostiko.

Kot sonde oligosi služijo za identifikacijo in vezavo na specifično ciljno zaporedje DNK ali RNA, da se potrdi prisotnost tega zaporedja v danem materialu. Aplikacije, ki uporabljajo oligosonde, vključujejo postopke blotiranja, kot so severni blotting (za RNA) ali južni blotting (za DNK), kot fluoroforno konjugirana zaporedja v mikronizih, ki zaznavajo spremembe v izražanju genov ali se uporabljajo pri presejanju genetskih bolezni ali za identifikacijo specifičnih patogenov (molekularna diagnostika).

Oligoterapevtika / genska terapija

V terapevtskih aplikacijah antisense oligonukleotidi (ASO), običajno 20 do 30-merne vrste, izkoriščajo naravno biologijo in olajšajo zaviranje genov ali utišanje genov (uničenje) neželenih ali preveč aktivnih zaporedij RNA, kar nato blokira izražanje nekaterih poškodovanih ali prekomerno aktivnih beljakovin, ki lahko povzročajo ali olajšujejo bolezen. Raziskave o terapevtikih na osnovi oligonukleotidov so se izjemno okrepile in v zadnjih letih je bilo odobrenih več zdravil.

Prihodnja uporaba sintetičnih nukleotidov: raziskovanje načinov cepiva DNA in RNA

Čeprav po strogi definiciji niso oligonukleotid, cepiva na osnovi DNK ali RNA, kot so mRNA ali plazmidne ali vektorske nukleinske kisline, dolge več sto ali tisoče baz, predstavljajo vodilne črte razvijajočih se tehnologij sintetičnih nukleotidov.

V konceptu bi cepiva DNK ali RNA odpravila vse nepotrebne ali škodljive dele patogene bakterije ali virusa. Namesto tega bi takšno cepivo na osnovi nukleinske kisline vsebovalo kodo za le nekaj delov DNK ali RNK patogena. Te verige DNK ali RNA naročijo bolnikovemu telesu, da proizvaja posamezne antigene ali fragmente patogena in nato spodbuja imunski odziv na antigen. S sodobnim računalništvom in in silico modeliranjem je mogoče te modalitete oligonukleotidnega cepiva ustvariti v nekaj dneh ali tednih glede na ustrezno ciljno zaporedje za načrtovanje. Cepiva na osnovi nukleinskih kislin se kot platformna tehnologija zanašajo na standardne sklope gradnikov ali surovin, ki omogočajo nešteto kombinacij skoraj po želji. Kot taki so tudi razmeroma poceni in enostavni za proizvodnjo v primerjavi s tradicionalnimi načini cepiv. Vendar je to še vedno zoreča paradigma za biofarmacevtsko industrijo in nenehno se obravnavajo novi izzivi, nekateri edinstveni za oligo in dolge nukleinske kisline, nekateri pa so skupni z drugimi bioterapevtskimi modalitetami.

Sinteza oligonukleotidov je kemični proces, s katerim se nukleotidi specifično povežejo, da tvorijo želeni zaporedni produkt. Za proizvodnjo oligonukleotidov se običajno uporablja kontinuirana sinteza trdne faze z uporabo kolone s polno posteljo. V nekaterih primerih se uporablja reakcija šarže, gnojevke.

Postopek izdelave ciljnega oligomernega zaporedja traja več ciklov, ki so sestavljeni iz specifičnih sintetičnih korakov. V prvem koraku se odstrani 4,4' dimetoksitritilna zaščitna skupina na nukleotidu, podprtem s trdno fazo. Nato se aktivira fosforoamidit monomer, ki se hitro poveže skozi prosto hidroksilno skupino na nukleotidu, vezanem na trdno fazo, da se ustvari dinukleozid, ki vsebuje povezavo fosfitnega triestra. V tretjem koraku se fosfitni triester oksidira. V zadnjem koraku (prvega cikla) se vsi nereagirani podprti nukleozidi "zaprejo" z acetilacijo, da se prepreči nastanek neželenih stranskih produktov v naslednjem ciklu.

Dolžina oligonukleotida je določena s številom nukleotidov, ki sestavljajo zaporedje. Kar zadeva nomenklaturo, je zaporedje, ki je dolgo 20 nukleotidov, opredeljeno kot "20-mer". Dolžina oliga je ključnega pomena za različne aplikacije. Na primer, kratkotrajni oligosi se običajno uporabljajo v PCR, medtem ko se zelo dolga zaporedja (200 baz ali več) uporabljajo v zahtevnih aplikacijah, kot sta kloniranje ali urejanje CRISPR. Sinteza specializiranih, dolgotrajnih oligov je zahtevna in zagotavljanje čistega zaporedja zahteva učinkovit nadzor sinteze in metode čiščenja. V povprečju je večina oligos krajša od 60 mer. Ker način sinteze oligos zahteva ponavljajoče se reakcijske cikle, ki dodajajo dodatne nukleotide, daljše kot je potrebno zaporedje, večja je verjetnost nastanka neželenih stranskih produktov - kar lahko vključuje sekvence brisanja ali skrajšanja.

Uporabljajo se različne metode čiščenja, odvisno od kakovosti, količine in stroškovnih ciljev. Na primer, oligosi brez soli imajo stranske produkte kemične sinteze odstranjene, vendar ostajajo napake zaporedja. Ti desolizirani oligosi so uporabni z vidika stroškov in učinkovitosti za bolj rutinske aplikacije, kot je PCR. Za zahtevnejše aplikacije kromatografija z reverzno fazo odstrani neželene sekvence iz izdelka, vendar ne tako učinkovito kot gel elektroforeza, ki daje visoko prečiščeni zaporedni produkt, vendar običajno v omejenih količinah. Zlasti pri kliničnih pomislekih je zadrževanje donosa vedno prisotna skrb med sintezo in nadaljnjo obdelavo.

Klasična kemična sinteza v trdni fazi običajno vključuje uporabo polimernih ali specializiranih steklenih kroglic, na katere reakcijski pogoji ne vplivajo. Te kroglice so lahko v kolonah, skozi katere tečejo reaktanti, reagenti in topila. Namen kroglic je, da delujejo kot platforma, na kateri so molekule substrata kovalentno vezane in nato delujejo s kemično reakcijo. Zaščita in dezaščita določenih funkcionalnih skupin na molekuli substrata je ključnega pomena za sintezo in za zagotovitev želenega produkta. Sintezni produkt se odstrani s kemičnim prekinitvijo vezi med njim in spodnjo polimerno kroglico.

Sinteza trdne faze je učinkovita pri hitrem pridobivanju prečiščenega produkta, saj se nečistoče in nereagirani materiali izperejo v različnih fazah sinteze. Poleg tega je celotna sinteza podvržena računalniškemu nadzoru in avtomatizaciji. Sinteza trdne faze je najpogostejša metoda, ki se uporablja za proizvodnjo peptidov in oligonukleotidov po meri. V slednjem primeru so potrebni številni ponavljajoči se cikli za zaporedno dodajanje nukleotidov, da se oblikuje ciljno zaporedje.

Sinteza oligonukleotidov v trdni fazi predstavlja številne izzive, vključno z zmanjšanjem donosa s povečanjem dolžine verige. Sterična ovira se pogosto domneva kot mehanizem slabega donosa, kjer lahko ena ali več površinsko pritrjenih pramenov moti vsak zaporedni raztezek soseda.

Za reševanje teh in drugih izzivov obstajajo različne metode sinteze oligonukleotidov v tekoči fazi.

Številni osnovni koraki sinteze v tekoči fazi so podobni sintezi v trdni fazi. Glavna razlika je v tem, da sinteza poteka v raztopini ali tekoči fazi (tj. NI pritrjena na nobeno površino). Ker ta proces še vedno poteka v ciklih, obstaja več spremljevalnih metod za odstranjevanje nereagiranih reagentov ob ohranjanju podolgovatega oligonukleotidnega produkta.

Tehnika uporabe PCR za sintezo oligonukleotidov je bila vzpostavljena leta 1985. Leta 1986 je bila uvedena prva uporaba encima Taq polimeraze . Vendar pa se je industrijska sinteza oligonukleotidov trudila sprejeti encimsko sintezo oligonukleotidov iz treh ključnih razlogov:

1. Encimska sinteza zahteva predlogo, na kateri lahko deluje encim DNA polimeraze, ki razširja zaporedje. Sinteza de novo oligonukleotidov z encimom ne more delovati brez predloge . 
   
2. Številni oligoprimeri, sonde ali tarče ASO, ki bi jih lahko uporabili kot predlogo, so sami po sebi prekratki, da bi učinkovito napolnili in sprožili sintezo polimeraze.
   
3. Številni umetni terapevtski oligosi so kemično modificirani, da olajšajo podaljšano razpolovno dobo in izboljšano funkcionalnost v humoralnem krvnem obtoku, modifikacije, ki skoraj ali popolnoma prepovedujejo njihovo interakcijo z evolucijsko pridobljenimi polimerazami (to se večinoma nanaša na daljše vrste oligo , kot je mRNA).

Raziskave in razvoj se nadaljujejo za inženirsko polimerazo , ki je sposobna sinteze ASO z uporabo kemično spremenjenih nukleotidnih zalog

Kompleksna narava sinteze oligonukleotidov bi lahko imela koristi od višje stopnje opazovanja procesov, razumevanja reakcijskih mehanizmov in odstopanj ter uporabnih kontrol. Analize v realnem času s PAT lahko zmanjšajo ali odpravijo potrebo po dolgotrajnih ali počasnih analizah brez povezave.

• ReactIR in ReactRaman se lahko uporabljata za spremljanje kinetike reakcij sinteze oligonukleotidov in primerjave med vožnjami.
• Natančen nadzor temperature, mešanja in doziranja z avtomatiziranimi reaktorji za kemično sintezo EasyMax skupaj z integracijo reakcijskih trendov in mehanizmov olajša zajemanje podatkov in enostavno upravljanje s programsko opremo iC 

Zmogljivosti spremljanja in situ FTIR in Ramanove spektroskopije v realnem času za kemijo, ki se izvajajo v pogojih pretoka, so dobro dokazane in se uporabljajo v ključnih korakih sinteze oligonukleotidov.

• Sinteza modificiranih fosforamidnih in naravnih nukleotidnih monomerov za zagotovitev strukture in čistosti
• Ublažite tveganja, ki jih povzročajo mehanske težave s sintetizatorjem ali nepravilni viri raztopin
• Reakcija spajanja fosforoamidita monomera s prosto hidroksilno skupino na nukleotidu, vezanem na trdno fazo
• Sledi denaturaciji in žarjenju komplementarnih oligonukleotidov v sintezi dveh verig.
• Določite kinetiko kemijske reakcije v procesu žarjenja - identificirajte in sledite intermediatom ali neznankam
• Povežite spremembe v spektrih s ključnimi točkami v procesu
• Uporabno za SPS, šaržno in konvergentno sintezo peptidov (SPS + raztopinska faza)

Dobro nadzorovano okolje sinteze je ključnega pomena za zagotovitev izida reakcije. Avtomatizirane reaktorske platforme zagotavljajo zaupanje in doslednost pri vseh kritičnih procesnih parametrih hkrati.

• Ponovljivo okolje je temeljnega pomena za dobro znanost
• Razumevanje vpliva procesnih parametrov na kritične atribute kakovosti z združevanjem podatkov iz senzorjev in inline PAT
• Protokol in avtomatizacija zmanjšujeta ročna tveganja ali nedoslednosti
• Olajšajte iskanje in strukturirane podatke
• Zanašajte se na desetletja citatov in dokazov za povečanje
• Uporabno za SPS, šaržno in konvergentno sintezo peptidov (SPS + raztopinska faza)