Kristalizacija beljakovin

Protein kristalizacija je dejanje in metoda ustvarjanja strukturiranih, urejenih rešetk za kompleksne makromolekule. Proteini so običajno amorfni kot trdni snovi in so dovzetni za denaturacijo, medtem ko proteini, ki obstajajo v kristalnih rešetkah, odporno prenašajo denaturacijo in imajo večjo stabilnost. Proteini se lahko kristalizirajo, če so postavljeni v primerna, ugodna okolja. Protein kristalizacija se smatra tako kot umetnost kot tudi znanost, zaradi zelo zapletenih interakcij spremenljivk, ki vplivajo na proces kristalizacije proteinov.

Najpogostejši razlog za ustvarjanje protein kristalov je podpora raziskavam strukturne biologije, običajno preko rentgenske difrakcijske kristalografije. Raziskovalci lahko vizualizirajo območja v okviru, ki omogočajo interakcijo z drugimi molekulami, s tem ko razumejo tridimenzionalne strukture proteinov (na primer, za boljše razumevanje, kako encimi, substrati in ligandi medsebojno delujejo). Poleg tega je kristalizacija učinkovit način ustvarjanja čistih proteinov, ki so brez kontaminacije z drugimi proteini ali tujo biološko snovjo, s čimer ponuja alternativen način čiščenja in ločevanja v primerjavi s preparativno kromatografijo. 

Kristalizacija poteka skozi vrsto medsebojno povezanih mehanizmov, ki jih vsak posebej edinstveno vpliva izbira procesnih parametrov: nukleacija, rast, oljevanje, aglomeracija, lomljenje, sejanje in prehod polimorfov.

Ti mehanizmi pogosto potekajo sočasno, zaradi česar je učinkovito načrtovanje kristalizacije izziv. V odsotnosti mehanističnega razumevanja znanstveniki uporabljajo metodo poskusov in napak za prilagajanje procesnih parametrov ter optimizacijo donosa, čistosti in velikosti kristalov. Z razumevanjem, kateri mehanizmi se pojavljajo med kristalizacijo, lahko znanstveniki uporabijo strategije za dosego kristalnega produkta z želenimi lastnostmi.

Proteini postajajo vse pomembnejši kot terapevtska zdravila. Vendar pa proizvodnja proteinov z potrebno stabilnostjo predstavlja ključne izzive, vključno z variabilnostjo produkta, izgubo strukture, ki bi zmanjšala učinkovitost, in tvorbo potencialno nevarnih stranskih produktov. Protein kristalizacija je metoda za proizvodnjo čistih, stabilnih trdnih oblik odmerkov in številnih injiciranih in infuzijskih terapevtikov, povezanih s protein kristali. V preteklosti je bila protein kristalizacija laboratorijska dejavnost za podporo rentgenski kristalografiji, vendar zaradi eksponentne rasti proteinov kot terapevtikov postaja povečanje obsega protein kristalizacije na proizvodne ravni vse pomembnejše in področje intenzivnega osredotočanja.

Povečanje obsega protein kristalizacije je v osnovi analogno kristalizaciji majhnih molekul glede na zahteve po optimizaciji kritičnih procesnih parametrov (CPP) na laboratorijski ravni za dosego kritičnih kakovostnih atributov (CQA) kristalizirane zdravilne snovi na komercialni ravni. Celovita platforma za razvoj procesa protein kristalizacije in povečanje obsega običajno vključuje:

• In-situ karakterizacijo delcev sistema
• Spektroskopsko spremljanje in karakterizacijo polimorfov
• Optimizacijo postopka in strategij povratnega nadzora preko integriranih modulov in senzorjev

Obstajajo pomembne farmacevtske aplikacije povezane s protein kristalizacijo: medicinska kemija preko strukturne biologije, razvoj protein zdravil, povečanje obsega, ločevanje in čiščenje, formulacija in dostava zdravil.

• Medicinska kemija preko strukturne biologije. Napredki v tehnikah protein kristalizacije in izboljšana rentgenska kristalografija so omogočili določitev deset tisoč tridimenzionalnih struktur proteinov. Razumevanje interakcij med zdravilom in receptorjem v velikih podrobnostih je mogoče z določitvijo strukture teh kompleksnih makromolekul in vizualizacijo vezavnih mest. Te informacije omogočajo boljše molekularno razumevanje protein inhibitorjev, alosteričnih aktivatorjev, kofaktorjev in celo katalitskih mest encimov ali 'aktivnih mest' – kar vodi do boljših zdravil z izboljšano učinkovitostjo. Klasičen primer pomembnosti razumevanja strukture protein-inhibitor preko kristalografije je prikazan z velikimi napredki pri razvoju HIV proteaz.
• Razvoj, povečanje obsega, ločevanje in čiščenje za terapevtike na osnovi proteinov. Poleg rasti posameznih protein kristalov za rentgensko kristalografijo je farmacevtska industrija povečala prizadevanja za razvoj terapevtikov na osnovi protein kristalov. Cilj teh aplikacij je razviti in povečati obseg do velikih količin čistih, stabilnih protein kristalov, ki imajo pravilno velikost delcev in dobro nadzorovano porazdelitev velikosti delcev. V primerjavi s preparativno kromatografijo ima protein kristalizacija potencial, da postane stroškovno učinkovita alternativa za ločevanje in čiščenje makromolekul ter za izolacijo kiralnih molekul. Orodja za povečanje obsega protein kristalizacije so analogna tistim, ki se uporabljajo za povečanje obsega kemičnih reakcij, z nujnostjo razumevanja CPP in njihovega vpliva na CQA.
• Formulacija in dostava zdravil. Protein terapevtiki se dajejo kot raztopine in se lahko dostavijo z injekcijo ali infuzijo. Ker je treba dostaviti velike količine proteinov, se infundirane protein raztopine redčijo, da se izognejo težavam z viskoznostjo in agregacijo. To je manj priročno za pacienta in bolnišnico zaradi časa, potrebnega za infundiranje celotnega zdravljenja, lahko pa tudi prispeva k fenomenu nižje pacientove skladnosti z vsako obliko parenteralne aplikacije. Uporaba kristalne oblike proteinov v suspenziji je zelo zanimiva, saj imajo te formulacije manj težav z viskoznostjo in jih je mogoče dostaviti v večjih koncentracijah. Pomembno je tudi, da mora biti velikost protein kristalov skrbno nadzorovana, da se zagotovi, da suspenzija lahko enostavno prehaja skozi injekcijsko ali infuzijsko iglo. Prav tako je pomembno, da morebitni preostali kristali, ki se med rekonstitucijo ne raztopijo, ne presegajo kritičnih velikosti delcev, ki bi lahko povzročile neželene stranske učinke zaradi kapilarne akumulacije v žilju, kar na splošno minimizira pomembne količine delcev >15 µm. 

1. Izberite ustrezen topilo. Pogoste premisleke vključujejo, koliko topila se lahko raztopi (topnost), kako praktično je rokovanje s topilom (varnost) in kako bo topilo vplivalo na stabilnost in proste energijske stanje peptida ali proteina.
2. Dosezite presežek nasičenosti. Segrejte topno peptidno/proteinsko zdravilno snov v topilu ali puferju do največje dovoljene tolerance (običajno omejeno z denaturacijo). Raztopina bo postala presežno nasičena.
3. Kristalizirajte izdelek z nadzorom CPP-jev. Zmanjšajte topnost s hlajenjem, dodajanjem anti-topila, izhlapevanjem ali reakcijo. Ko se topnost zmanjša, se doseže točka, kjer se kristali začnejo tvoriti in nato rasti. Rast naj bi imeli zelo čisti kristali izdelka, čeprav se lahko motifi z visoko prosto energijo oblikujejo v alternativne ali nekristalne strukture; preprečevanje tega zahteva natančen nadzor CPP-jev, če je to sploh praktično.
4. Dovolite sistemu, da doseže ravnovesje. To se naredi za maksimiranje pridelka trdnega zdravilnega izdelka.
5. Filtrirajte in posušite prečiščen izdelek.

Obstaja več metod za rast proteinovih kristalov; med najpogostejšimi sta difuzija pare in mikroserija. Prva metoda ima dve različici, opisani kot viseči kapljični in sedeči kapljični način, obe pa delujeta na enak temeljni način. V zaprtem sistemu se kapljica raztopine, ki vsebuje protein, pufer in precipitante, izenači z rezervoarjem, ki vsebuje višje koncentracije topila iste raztopine, vendar brez proteina. Voda iz kapljice, ki vsebuje protein, izhlapi in je privlačena k raztopini z višjo koncentracijo v rezervoarju. Ko se koncentracija topil v kapljici poveča, se protein začne kristalizirati. Pri metodi mikroserije so proteini in drugi reagenti uvedeni in zadržani pod tanko plastjo mineralnega olja, ki preprečuje difuzijo vode. Mikroserija je v bistvu majhen reaktor, ki vsebuje vse potrebne sestavine v pravih, stabilnih koncentracijah, da omogoči kristalizacijo.

Ker je iskanje pravilnega nabora reagentov, parametrov in pogojev za kristalizacijo proteina pogosto empirično, je najpraktičnejši način za uspešno kristalizacijo proteinov uporaba raznolikih eksperimentalnih pogojev, ki temeljijo na prejšnjih izkušnjah. Najlažji način za to je uporaba komercialno dostopnih kompletov za presejanje proteinovih kristalov, ki vsebujejo vnaprej pripravljene raztopine s puferji, precipitanti itd., shranjene v večjamčnih ploščah. Metoda difuzije pare z visečo kapljico se uporablja za rast kristalov s temi kompleti. Ko je potrebna obsežna presejalna analiza, so na voljo sistemi za visoko prepustnost, ki avtomatizirajo metodo mikroserije, pri čemer prihranijo čas in trud ter hkrati zmanjšajo količino potrebnega prečiščenega proteina. Za velike kristalizacije proteinov, potrebne za farmacevtske ali industrijske aplikacije, informacije, pridobljene v presejalnih eksperimentih, tvorijo osnovo za uporabo v večjih avtomatiziranih reaktorskih sistemih, ki jih odlikuje in-situ, realnočasni PAT. 

V podporo razvoju procesa in proizvodnji je eden najpomembnejših začetnih korakov za uspešno kristalizacijo proteinov zagotoviti zadostno zalogo visoko prečiščenega in dobro karakteriziranega proteina. Poleg tega, da je protein čist (tj. brez kontaminantov, kot so nečistoče iz fermentacijskih matrik), mora biti protein homogena in stabilna (ali stabilizirana) v raztopini z:

• Minimalno agregacijo (Slika A)
• Pravilno sekundarno, terciarno in kvartarno strukturo (Slika B)
• Kakršne koli konjugirane ali rekombinantne modifikacije (Slika C)

Poleg tega morajo biti vsi reagentni in topila, uporabljeni v procesu kristalizacije proteinov, brez kontaminantov, saj ti lahko pomembno vplivajo na nukleacijo.

Podobno kot pri kristalizaciji majhnih molekul se proteini kristalizirajo iz presežno nasičenih raztopin. Pri majhnih molekulah, ki tvorijo robustne kristalne mreže, je manipulacija temperature glavni način za dosego presežne nasičenosti; to je uporabno tudi za proteine. Vendar je dovoljen ožji temperaturni razpon, saj imajo proteinski kristali običajno topilo kot del kristalne strukture, so pogosto temperaturno občutljivi in nagnjeni k denaturaciji in agregaciji.

Majhne molekule imajo bistveno manj stereoskopske svobode in se zato lažje kristalizirajo. Velike molekule peptidov imajo veliko več notranjih kislih, baznih, polarnih, nepolarnih interakcij in odbojnih sil, ki upirajo urejeni kristalizaciji, kar je še posebej izrazito pri večjih proteinih. Večina peptidov, združljivih s kristalizacijo, vsebuje tudi znatno število disulfidnih vezi, ki so ključne za fiksacijo strukturnih motivov. Obseg intramolekularnega nereda ali možne variacije v strukturi je pomembna lastnost, ki določa, ali se bo peptid ali protein kdaj kristaliziral namesto da precipitira. Tudi če ima molekula lastnosti, ki so primerne za kristalizacijo, obstaja več parametrov procesa, ki vplivajo na komercialno izvedljivost procesa in jih je treba karakterizirati.

Poleg temperature vpliva na kristalizacijo proteinov preko presežne nasičenosti več drugih dejavnikov, vključno z uravnavanjem pH in ionske moči raztopine, dodajanjem soli in precipitanti, kot je PEG, za zmanjšanje topnosti proteinov, vrsto prisotnega liganda itd. Ključno je presežiti nasičenost raztopine v okolju, ki ne moti običajnega značaja proteina. To poudarja pomen iskanja nabora spremenljivk in pogojev, ki rezultirajo v kristalih s pravilno morfologijo, čistostjo in sprejemljivimi stopnjami rasti.

Kristalizacija beljakovin poteka skozi vrsto medsebojno povezanih mehanizmov:

1. Nukleacija
2. Rast
3. Oljena faza pri kristalizaciji
4. Aglomeracija
5. Razbitje
6. Sejanje
7. Polimorfizem v kemiji

Ti mehanizmi, ki so pogosto skriti pred znanstveniki, igrajo prevladujočo vlogo pri določanju izida procesa kristalizacije.

Razvoj in povečanje obsega kristalizacij za terapevtike na osnovi beljakovin zahteva poglobljeno razumevanje spremenljivk in pogojev, ki vplivajo na proces kristalizacije. Tako kot pri drugih kristalizacijah, je za dosego želene oblike kristala, oblike, velikosti delcev in porazdelitve velikosti potrebna skrbna kontrola za zagotavljanje dosledne kakovosti izdelka. Vsaka variacija v CQA suspenzij beljakovinskih kristalov bo neposredno vplivala na terapevtsko učinkovitost. Ker so beljakovinski kristali zelo občutljivi na okolje rasti in jih lahko enostavno poškoduje prekomerna temperatura, izguba topila in drugi zunanji stres ali celo proces vzorčenja, je zaželeno meriti CPP in kakovost izdelka in situ, tj. brez odstranitve kristalov iz njihovega okolja raztopine.

• EasyMax in Optimax avtomatizirani kemijski reaktorji omogočajo natančen nadzor, prilagoditev in beleženje parametrov, vključno s temperaturo, pH, prevodnostjo, hitrostjo mešanja in doziranjem puferjev in pomožnih snovi, ki so ključnega pomena za uspešen razvoj in povečanje obsega kristalizacij beljakovin
• Orodja za analitično tehnologijo in situ, ki pomagajo pri spremljanju, odpravljanju težav in popravljanju odstopanj procesa, so prav tako uporabna
  • In situ Ramanova spektroskopija in FTIR spektroskopija spremljata koncentracije reagentov, nadzorujeta rast strukture kristala in merita koncentracijo presežnih raztopin
  • ParticleTrack (s FBRM) tehnologija spremlja spreminjanje velikosti kristalov in porazdelitev velikosti v realnem času kot ključne segmente procesa kristalizacije
  • EasyViewer omogoča vizualizacijo in analizo slik procesa kristalizacije med njegovim potekom

Kadar se avtomatizirani laboratorijski reaktorji uporabljajo v povezavi z analizatorji in situ v realnem času, je mogoče prepoznati vpliv parametrov procesa na mehanizme kristalizacije, kot so agregacija, rast, aglomeracija, razbitje in sprememba oblike. Natančen nadzor nad procesom kristalizacije v povezavi s kontinuiranim spremljanjem poteka tvorbe kristalov in situ omogoča optimizacijo in povečanje obsega na podlagi dejstev in podatkov.

EasyMax avtomatizirani laboratorijski reaktor je popolna delovna postaja za optimizacijo parametrov pri kristalizaciji beljakovin za podporo razvoju in načrtovanju povečanja obsega ter izvedbo. Ta popolnoma avtomatiziran sistem omogoča natančen nadzor nad procesnimi parametri.

• Upravljanje CPP, vključno s hitrostmi doziranja, temperaturo, mešanjem, pH in prevodnostjo
• Enostavna integracija z in situ analitiko za kristalizacijo, vključno z ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FFE) in EasyViewer (analiza slik in situ)
• iC programska oprema omogoča avtomatizirano izvajanje in nadzor vseh poskusov in perifernih naprav ter popolno zajemanje podatkov in vodenje zapisov

ReactIR uporablja srednje infrardečo spektroskopijo za merjenje faze raztopine v študijah kristalizacije. Meritve ReactIR niso vplivane z suspendiranimi trdnimi snovmi, mehurčki ali drugo delno maso.

• Spremljajte posamezne kristalizacijske raztopine in situ in v realnem času.
• Merite koncentracije raztopin v podporo študijam presežene nasičenosti
• Omogočite uporabne analize podatkov za odločanje in nadzor v realnem času

ReactRaman uporablja Ramanovo spektroskopijo za molekularno analizo delcev v raztopini

• Spremljajte rast kristalov, strukturo in morfologijo nepoškodovano, in situ in v realnem času
• Določite vplive parametrov in optimizirajte pogoje in spremenljivke kristalizacije za dosego kakovostnih ciljev

ParticleTrack uporablja tehnologijo Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) in je optični instrument na osnovi sonde, ki se neposredno vstavi v posodo za spremljanje spreminjanja velikosti delcev in števila v realnem času. ParticleTrack uporablja meritve porazdelitve dolžin chord za pridobitev porazdelitve velikosti kristalov (CSD).

• Kristali beljakovin se neprekinjeno spremljajo, ko se eksperimentalni pogoji spreminjajo
• Spremljajte rast serije ali kontinuirano rast med kristalizacijo v realnem času brez potrebe po odvzemu vzorca
• Označite pogoje, ki vplivajo na nukleacijo, agregacijo, polimorfizem in druge lastnosti sistema

EasyViewer je instrument na osnovi sonde, ki se neposredno vstavi v posodo za zajem slik delčnih sistemov. EasyViewer izvaja analizo slik in meri število delcev, porazdelitev velikosti in morfologijo iz časovno razporejenih, v liniji zajetih slik procesa, kar omogoča spremljanje populacij skozi čas.

• Kristali beljakovin se neprekinjeno spremljajo, ko se eksperimentalni pogoji spreminjajo
• Spremljajte rast serije ali kontinuirano rast med kristalizacijo v realnem času brez potrebe po odvzemu vzorca
• Vizualizirajte parametre kristalizacije, ki vplivajo na nukleacijo, agregacijo, polimorfizem in druge lastnosti sistema v realnem času

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Spremljanje biološke farmacevtske kristalizacije v realnem času: porazdelitev dolžin chord do porazdelitve velikosti kristalov za lizozim, rHu insulin in vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Avtorji so poročali o uspehu pri razvoju učinkovitega pristopa za spremljanje biološke farmacevtske kristalizacije v realnem času. Ta postopek uporablja ParticleTrack za merjenje CLD za vrsto bioloških farmacevtskih molekul pod statičnimi in dinamičnimi pogoji ter nato uporabi matematično modeliranje za pretvorbo CLD v CSD. Biomolekule, ki so bile preučene, imajo različne kristalne oblike, ki so odvisne od eksperimentalnih pogojev kristalizacije. Lizozim lahko tvori tetragonalne in igličaste kristale, rHu insulin tvori romboedrične kristale, B12 pa polihedralne kristale.

Avtorji so razvili modele za določanje CSD za tetragonalne kristale z nizkim razmerjem stranic, romboedrične, polihedralne kristale in kristale z visokim razmerjem stranic v obliki igel. Avtorji so uporabili tri različne modele za določanje porazdelitve velikosti kristalov:

• Model, ki ga je razvil drug raziskovalni skupina in je predpostavljal, da je mogoče kristale predstaviti kot krogle (sferični ekvivalentni premer, SED), je bil učinkovit za kristale z nizkim razmerjem stranic
• Za kristale z visokim razmerjem stranic so avtorji v tej študiji razvili model, ki temelji na širini
• Na koncu so razvili model, ki temelji na dolžini in zahteva določitev razmerja stranic

Rezultati modelov, razvitih za izračun CSD iz meritev FBRM, so bili nato primerjani z meritvami CSD, pridobljenimi z analizo slik.

Spremljanje neprosojne kristalne suspenzije predstavlja izzive, zlasti kadar proizvodne specifikacije zahtevajo ozko porazdelitev velikosti delcev (PSD). Za injekcijske formulacije beljakovinskih kristalov lahko PSD močno vpliva na viskoznost ter služi kot zgodnje opozorilo za agregacijo ali druge razgradne dogodke, ki lahko potencialno ogrozijo formulacijo. In-situ spremljanje je bilo uporabljeno v študiji serijske kristalizacije za povečanje obsega za karakterizacijo tvorbe in rasti kristalov človeškega rastnega hormona (hGH). Analiza v realnem času je zaznala odstopanje od običajnega profila PSD, ki ga je povzročila razlika v mešanju med posodami. To je bilo potrjeno z nadaljnjo offline analizo slik (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Neprekinjeni procesi kristalizacije v farmacevtski proizvodnji: pregled. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Ocena parametrov stohastične primarne nukleacije s pomočjo stohastičnih integralov z uporabo meritev z usmerjenim žarkom. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Spremljanje kristalizacije biofarmacevtikov v realnem času: distribucija dolžin chord do distribucije velikosti kristalov za lizoim, rHu insulin in vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulacija kristalizacije lizoima in supramolekularne samoorganizacije v raztopini z uporabo ionskih tekočin. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modeliranje in nadzor oblike kristalov v neprekinjeni kristalizaciji beljakovin. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Povečanje hitrosti proizvodnje kristalov in zmanjšanje polidisperznosti v neprekinjeni kristalizaciji beljakovin. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Beljakovinski kristali za dostavo biofarmacevtikov. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301