Proteinkristallisation

Proteinkristallisation ist der Akt und die Methode zur Schaffung strukturierter, geordneter Gitter für komplexe Makromoleküle. Proteine sind typischerweise als Feststoffe amorph und neigen zur Denaturierung, während Proteine, die in kristallinen Gittern vorliegen, der Denaturierung widerstehen und eine größere Stabilität besitzen. Proteine können kristallisieren, wenn sie in geeignete, förderliche Umgebungen gebracht werden. Die Proteinkristallisation wird sowohl als Kunst als auch als Wissenschaft betrachtet, aufgrund der hochkomplexen Wechselwirkungen der Variablen, die den Proteinkristallisationsprozess beeinflussen.

Der häufigste Grund für die Herstellung von Proteinkristallen ist die Unterstützung struktureller biologischer Untersuchungen, typischerweise mittels Röntgenbeugungskristallographie. Untersuchende können Bereiche im Gerüst visualisieren, die die Interaktion mit anderen Molekülen ermöglichen, indem sie die dreidimensionalen Strukturen von Proteinen verstehen (zum Beispiel, um besser zu verstehen, wie Enzyme, Substrate und Liganden interagieren). Darüber hinaus ist Kristallisation ein effektives Mittel zur Herstellung reiner Proteine, die frei von Kontaminationen durch andere Proteine oder fremdes biologisches Material sind, und bietet somit eine alternative Methode zur Reinigung und Trennung gegenüber der präparativen Chromatographie. 

Die Kristallisation verläuft durch eine Reihe voneinander abhängiger Mechanismen, die jeweils einzigartig durch die Wahl der Prozessparameter beeinflusst werden: Keimbildung, Wachstum, Ölabscheidung, Agglomeration, Bruch, Beimpfung und Polymorph-Übergang.

Oft treten diese Mechanismen gleichzeitig auf, was die effektive Gestaltung der Kristallisation zu einer Herausforderung macht. Ohne mechanistisches Verständnis verlassen sich Wissenschaftler auf Versuch und Irrtum, um Prozessparameter anzupassen und Ausbeute, Reinheit und Kristallgröße zu optimieren. Durch das Verständnis, welche Mechanismen während der Kristallisation auftreten, können Wissenschaftler Strategien einsetzen, um ein Kristallprodukt mit den gewünschten Eigenschaften zu liefern.

Proteine gewinnen als therapeutische Arzneimittel zunehmend an Bedeutung. Die Herstellung von Proteinen mit der notwendigen Stabilität stellt jedoch zentrale Herausforderungen dar, darunter Produktvariationen, Strukturverluste, die die Wirksamkeit reduzieren würden, und die Bildung potenziell gefährlicher Nebenprodukte. Die Proteinkristallisation ist eine Methode zur Herstellung reiner, stabiler fester Darreichungsformen sowie zahlreicher injizierter und infundierter Therapeutika, die mit Proteinkristallen verbunden sind. In der Vergangenheit war die Proteinkristallisation eine Laboraktivität zur Unterstützung der Röntgenkristallographie, aber aufgrund des exponentiellen Wachstums proteinbasierter Therapeutika gewinnt die Hochskalierung von Proteinkristallisationen auf Produktionsebene zunehmend an Bedeutung und ist ein Schwerpunkt intensiver Forschung.

Die Hochskalierung der Proteinkristallisation ist grundlegend analog zur Kristallisation kleiner Moleküle in Bezug auf die Anforderungen zur Optimierung der Kritischen Prozessparameter (CPPs) im Labormaßstab, um Kritische Qualitätsmerkmale (CQAs) eines kristallisierten Wirkstoffs im kommerziellen Maßstab zu erreichen. Eine ganzheitliche Plattform für die Entwicklung und Hochskalierung von Proteinkristallisationsprozessen umfasst typischerweise:

• In-situ-Partikelsystemcharakterisierung
• Spektroskopische Überwachung und Polymorphcharakterisierung
• Optimierung von Verfahren und Rückkopplungssteuerungsstrategien durch integrierte Module und Sensoren

Es gibt wesentliche pharmazeutische Anwendungen im Zusammenhang mit der Proteinkristallisation: medizinische Chemie über strukturelle Biologie, Entwicklung proteinbasierter Arzneimittel, Hochskalierung, Trennung und Reinigung, Formulierung und Arzneimittelabgabe.

• Medizinische Chemie über strukturelle Biologie. Fortschritte in den Proteinkristallisationstechniken und verbesserte Röntgenkristallographie haben zur Ableitung von Zehntausenden dreidimensionaler Proteinstrukturen geführt. Das Verständnis von Wirkstoff-Rezeptor-Wechselwirkungen im Detail ist möglich, indem die Struktur dieser komplexen Makromoleküle bestimmt und Bindungsstellen visualisiert werden. Diese Informationen ermöglichen ein tieferes molekulares Verständnis von Proteininhibitoren, allosterischen Aktivatoren, Co-Faktoren und sogar katalytischen Stellen von Enzymen oder „aktiven Stellen“ – was zu besseren Arzneimitteln mit verbesserter Wirksamkeit führt. Ein klassisches Beispiel für die Bedeutung des Verständnisses der Protein-Inhibitor-Struktur mittels Kristallographie zeigt sich in den großen Fortschritten bei der Entwicklung von HIV-Proteasen.
• Entwicklung, Hochskalierung, Trennung und Reinigung für proteinbasierte Therapeutika. Neben dem Wachstum einzelner Proteinkristalle für die Röntgenkristallographie hat die Pharmaindustrie ihre Bemühungen bei der Entwicklung proteinbasierter kristalliner Therapeutika verstärkt. Ziel dieser Anwendungen ist es, große Mengen reiner, stabiler Proteinkristalle mit der richtigen Partikelgröße und gut kontrollierter Partikelgrößenverteilung zu entwickeln und hochzuskalieren. Im Vergleich zur präparativen Chromatographie hat die Proteinkristallisation das Potenzial, eine kosteneffektive alternative Methode zur Trennung und Reinigung von Makromolekülen und zur Isolierung chiraler Moleküle zu sein. Die Werkzeuge zur Hochskalierung von Proteinkristallisationen sind analog zu denen, die für die Hochskalierung chemischer Reaktionen verwendet werden, mit dem Bedarf, CPPs und deren Einfluss auf CQAs zu verstehen.
• Formulierung und Arzneimittelabgabe. Proteintherapeutika werden als Lösungen verabreicht und können durch Injektion oder Infusion verabreicht werden. Da hohe Proteinmengen verabreicht werden müssen, werden die infundierten Proteinlösungen verdünnt, um Viskositäts- und Aggregationsprobleme zu vermeiden. Dies ist für den Patienten und das Krankenhaus aufgrund der benötigten Zeit für die gesamte Behandlung weniger bequem, kann aber auch zum Phänomen der geringeren Patienten-Compliance bei jeglicher Form der parenteralen Verabreichung beitragen. Die Verwendung der kristallinen Form von Proteinen in Suspension ist von großem Interesse, da diese Formulierungen weniger Viskositätsprobleme aufweisen und in höheren Konzentrationen verabreicht werden können. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Größe der Proteinkristalle sorgfältig kontrolliert werden muss, um sicherzustellen, dass die Suspension leicht durch eine Injektions- oder Infusionsnadel passieren kann. Ebenfalls wichtig ist, dass verbleibende Kristalle, die sich während der Rekonstitution nicht auflösen, ebenfalls keine kritischen Partikelgrößen überschreiten dürfen, die aufgrund kapillärer Ansammlungen in der Gefäßstruktur unerwünschte Nebenwirkungen verursachen könnten, wobei generell signifikante Partikelmengen >15 µm minimiert werden müssen. 

1. Wählen Sie ein geeignetes Lösungsmittel. Übliche Überlegungen umfassen, wie viel gelöster Stoff gelöst werden kann (Löslichkeit), wie praktisch das Lösungsmittel im Umgang ist (Sicherheit) und wie das Lösungsmittel die Stabilität und die freien Energiezustände des Peptids oder Proteins beeinflusst.
2. Erreichen Sie Übersättigung. Erhitzen Sie die lösliche Peptid-/Protein-Wirkstoffsubstanz in Lösungsmittel oder Puffer bis zur maximal zulässigen Toleranz (in der Regel durch Denaturierung begrenzt). Die Lösung wird übersättigt.
3. Kristallisieren Sie das Produkt durch Kontrolle der CPPs. Verringern Sie die Löslichkeit durch Abkühlung, Zugabe von Antilösungsmitteln, Verdampfung oder Reaktion. Wenn die Löslichkeit reduziert wird, wird ein Punkt erreicht, an dem Kristalle keimen und wachsen. Hochreine Produktkristalle sollten wachsen, obwohl Motive mit hoher freier Energie alternative oder nicht-kristalline Strukturen bilden können; dies zu verhindern erfordert eine sorgfältige CPP-Kontrolle, falls dies überhaupt praktikabel ist.
4. Lassen Sie das System das Gleichgewicht erreichen. Dies geschieht, um die Ausbeute des festen Arzneimittelprodukts zu maximieren.
5. Filtern und trocknen Sie das gereinigte Produkt.

Es gibt mehrere Methoden, die verwendet werden, um Proteinkristalle zu züchten; zu den gebräuchlichsten gehören die Dampfdiffusion und die Mikro-Batch-Methode. Die erstgenannte Methode hat zwei Varianten, die als hängender Tropfen und sitzender Tropfen beschrieben werden, und beide funktionieren grundsätzlich auf die gleiche Weise. In einem geschlossenen System gleicht ein Tropfen Lösung, der das Protein, den Puffer und den Präzipitator enthält, sich mit einem Reservoir aus, das höhere Konzentrationen desselben Lösungsmittels, jedoch ohne Protein, enthält. Wasser aus dem Tropfen mit dem Protein verdampft und wird von der höher konzentrierten Lösung im Reservoir angezogen. Wenn die Konzentration der gelösten Stoffe im Tropfen zunimmt, beginnt das Protein zu kristallisieren. In der Mikro-Batch-Methode werden die Proteine und andere Reagenzien unter einer dünnen Schicht Mineralöl eingebracht und enthalten, die die Diffusion von Wasser verhindert. Die Mikro-Batch-Methode ist im Wesentlichen ein kleiner Reaktor, der alle notwendigen Zutaten in den korrekten, stabilen Konzentrationen enthält, um die Kristallisation zu ermöglichen.

Da das Finden der richtigen Kombination von Reagenzien, Parametern und Bedingungen zur Kristallisation eines Proteins oft empirisch ist, ist der praktischste Weg für eine erfolgreiche Proteinkristallisation die Verwendung eines variierenden Bereichs experimenteller Bedingungen, die auf früheren Erfahrungen basieren. Der einfachste Weg hierfür ist die Verwendung kommerziell erhältlicher Protein-Kristall-Screening-Kits, die vorverpackte Lösungen mit Puffern, Präzipitatoren usw. in Multi-Well-Platten enthalten. Die Methode der hängenden Tropfen-Dampfdiffusion wird angewandt, um mit diesen Kits Kristalle zu züchten. Wenn ein groß angelegtes Screening erforderlich ist, gibt es Hochdurchsatzsysteme, die die Mikro-Batch-Methode automatisieren, Zeit und Mühe sparen und gleichzeitig die Menge des benötigten gereinigten Proteins minimieren. Für groß angelegte Proteinkristallisationen, die für pharmazeutische oder industrielle Anwendungen erforderlich sind, bilden die in Screening-Experimenten gewonnenen Informationen die Grundlage für die Anwendung in größeren automatisierten Reaktorsystemen, die durch in-situ, Echtzeit-PAT gekennzeichnet sind. 

Zur Unterstützung der Prozessentwicklung und Herstellung ist einer der wichtigsten ersten Schritte für eine erfolgreiche Proteinkristallisation sicherzustellen, dass eine ausreichende Versorgung mit hochreinem und gut charakterisiertem Protein verfügbar ist. Zusätzlich dazu, dass das Protein rein ist (d.h. frei von Kontaminanten wie Verunreinigungen aus Fermentationsmatrizen), sollte das Protein homogen und stabil (oder stabilisiert) in Lösung sein mit:

• Minimaler Aggregation (Abbildung A)
• Korrekter sekundärer, tertiärer und quartärer Struktur (Abbildung B)
• Jeglichen Konjugat- oder rekombinanten Modifikationen (Abbildung C)

Zusätzlich müssen alle Reagenzien und Lösungsmittel, die im Proteinkristallisationsprozess verwendet werden, frei von Kontaminanten sein, da diese einen erheblichen Einfluss auf die Keimbildung haben können.

Ähnlich wie bei der Kristallisation kleiner Moleküle kristallisieren Proteine aus übersättigten Lösungen. Für kleine Moleküle, die robuste Kristallgitter bilden, ist die Temperaturmanipulation ein primäres Mittel, um Übersättigung zu erreichen; dies ist auch für Proteine nützlich. Allerdings ist ein reduzierter Temperaturbereich zulässig, da Proteinkristalle typischerweise Lösungsmittel als Teil der Kristallstruktur enthalten, häufig temperaturempfindlich sind und zu Denaturierung und Aggregation neigen.

Kleine Moleküle haben deutlich weniger stereoskopische Freiheitsgrade und kristallisieren daher viel leichter. Große Molekülpeptide haben viele mehr interne saure, basische, polare, unpolare Wechselwirkungen und abstoßende Kräfte, die eine geordnete Kristallisation erschweren, ein Phänomen, das bei noch größeren Proteinen verstärkt wird. Die meisten kristallisationskompatiblen Peptide enthalten auch eine erhebliche Anzahl von Disulfidbrücken, die entscheidend sind, um strukturelle Motive zu immobilisieren. Das Ausmaß der intramolekularen Unordnung oder möglichen Variationen in der Struktur ist ein wichtiges Merkmal, das bestimmt, ob ein Peptid oder Protein überhaupt kristallisieren kann, anstatt zu präzipitieren. Selbst wenn das Molekül Eigenschaften aufweist, die eine Kristallisation begünstigen, gibt es eine Reihe von beeinflussenden Prozessparametern, die die kommerzielle Machbarkeit des Prozesses beeinflussen und charakterisiert werden müssen.

Über die Temperatur hinaus gibt es eine Reihe weiterer Faktoren, die die Proteinkristallisation durch Übersättigung beeinflussen/unterstützen, darunter pH-Anpassung und die Ionenstärke einer Lösung, Zugabe von Salzen und Präzipitatoren wie PEG zur Verringerung der Proteinlöslichkeit, Art des vorhandenen Liganden usw. Der Schlüssel ist, die Lösung in einer Umgebung zu übersättigen, die den normalen Charakter des Proteins nicht stört. Dies unterstreicht die Bedeutung, eine Reihe von Variablen und Bedingungen zu finden, die Kristalle mit der richtigen Morphologie, Reinheit und akzeptablen Wachstumsraten ergeben.

Die Proteinkristallisation verläuft durch eine Reihe voneinander abhängiger Mechanismen:

1. Keimbildung
2. Wachstum
3. Ausölung bei der Kristallisation
4. Agglomeration
5. Bruch
6. Beimpfung
7. Polymorphismus Chemie

Diese Mechanismen, die Wissenschaftlern oft verborgen bleiben, spielen eine dominierende Rolle bei der Bestimmung des Ergebnisses eines Kristallisationsprozesses.

Die Entwicklung und Skalierung von Kristallisationen für proteinbasierte Therapeutika erfordert ein tiefgehendes Verständnis der Variablen und Bedingungen, die den Kristallisationsprozess beeinflussen. Wie bei anderen Kristallisationen erfordert das Erreichen der gewünschten Kristallform, -gestalt, Partikelgröße und Größeverteilung eine sorgfältige Kontrolle, um eine gleichbleibende Produktqualität zu gewährleisten. Jede Variation der CQAs von Protein-Kristallsuspensionen wirkt sich direkt auf die therapeutische Wirksamkeit aus. Da Proteinkristalle sehr empfindlich auf ihre Wachstumsumgebung reagieren und leicht durch übermäßige Temperatur, Lösungsmittelverlust und andere äußere Belastungen oder sogar durch den Probenahmeprozess beschädigt werden können, ist es wünschenswert, CPPs und Produktqualität in situ zu messen, d. h. ohne Entfernung der Kristalle aus ihrer Lösungsmittelumgebung.

• EasyMax und Optimax automatisierte chemische Reaktoren ermöglichen eine präzise Steuerung, Anpassung und Aufzeichnung von Parametern, einschließlich Temperatur, pH, Leitfähigkeit, Rührgeschwindigkeit sowie Dosierung von Puffern und Hilfsstoffen, die für die erfolgreiche Entwicklung und Skalierung von Proteinkristallisationen von entscheidender Bedeutung sind
• In-situ analytische Technologien, die bei der Überwachung, Fehlerbehebung und Korrektur von Prozessabweichungen helfen, sind ebenfalls nützlich
  • In-situ Raman-Spektroskopie und FTIR-Spektroskopie verfolgen Reagenzienkonzentrationen, überwachen das Kristallstrukturwachstum und messen auch die Konzentration übersättigter Lösungen
  • ParticleTrack (mit FBRM)-Technologie überwacht die sich ändernde Kristallgröße und Größeverteilung in Echtzeit als Schlüsselabschnitte des Kristallisationsprozesses
  • EasyViewer ermöglicht die Visualisierung und Bildanalyse des Kristallisationsprozesses während dessen Fortschritt

Wenn automatisierte Laborreaktoren in Verbindung mit Echtzeit-In-situ-Analysatoren eingesetzt werden, kann der Einfluss von Prozessparametern auf Kristallisationsmechanismen wie Aggregation, Wachstum, Agglomeration, Bruch und Formänderung identifiziert werden. Präzise Kontrolle über den Kristallisationsprozess in Verbindung mit kontinuierlicher, in-situ Überwachung des Kristallbildungsfortschritts ermöglicht eine faktenbasierte und datengetriebene Optimierung und Skalierung.

Der EasyMax automatisierte Laborreaktor ist eine vollständige Arbeitsstation zur Parameteroptimierung bei der Proteinkristallisation zur Unterstützung von Entwicklungs- und Skalierungsplanung und -durchführung. Dieses vollautomatische System ermöglicht eine präzise Steuerung der Prozessparameter.

• Verwaltung von CPPs einschließlich Dosierungsraten, Temperatur, Rühren, pH und Leitfähigkeit
• Leicht integrierbar mit In-situ-Analytik für Kristallisationen einschließlich ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) und EasyViewer (In-situ-Bildanalyse)
• iC-Software ermöglicht die automatisierte Durchführung und Steuerung aller Experimente und Peripheriegeräte sowie die vollständige Datenerfassung und Dokumentation

ReactIR verwendet die mittlere Infrarotspektroskopie zur Messung der Lösungsmittelphase in Kristallisationsstudien. ReactIR-Messungen werden nicht durch suspendierte Feststoffe, Blasen oder andere partikuläre Massen beeinflusst.

• Verfolgen Sie einzelne Kristallisationslösungsmittel in situ und in Echtzeit.
• Messen Sie Lösungskonzentrationen zur Unterstützung von Übersättigungsstudien
• Bieten Sie umsetzbare Datenanalysen für Echtzeit-Entscheidungen und Steuerung

ReactRaman verwendet Raman-Spektroskopie zur molekularen Analyse von Partikeln in Lösung

• Verfolgen Sie Kristallwachstum, Struktur und Morphologie zerstörungsfrei, in situ und in Echtzeit
• Bestimmen Sie Parametereffekte und optimieren Sie Kristallisationsbedingungen und Variablen, um Qualitätsziele zu erreichen

ParticleTrack verwendet die Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)-Technologie und ist ein optisches, sondengestütztes Instrument, das direkt in ein Gefäß eingeführt wird, um die sich ändernde Partikelgröße und -anzahl in Echtzeit zu verfolgen. ParticleTrack nutzt Messungen der Chord-Length-Verteilung, um die Kristallgrößenverteilung (CSD) zu erhalten.

• Proteinkristalle werden kontinuierlich überwacht, während die experimentellen Bedingungen variiert werden
• Verfolgen Sie das Chargen- oder kontinuierliche Wachstum während der Kristallisation in Echtzeit, ohne dass eine Probenentnahme erforderlich ist
• Charakterisieren Sie Bedingungen, die Nukleation, Aggregation, Polymorphismus und andere Systemattribute beeinflussen

EasyViewer ist ein sondengestütztes Instrument, das direkt in ein Gefäß eingeführt wird, um Bilder von Partikelsystemen aufzunehmen. EasyViewer führt Bildanalysen durch und misst Partikelanzahl, Größenverteilung und Morphologie anhand zeitaufgelöster Inline-Bilder des Prozesses, wodurch Populationen im Zeitverlauf verfolgt werden können.

• Proteinkristalle werden kontinuierlich überwacht, während die experimentellen Bedingungen variiert werden
• Verfolgen Sie das Chargen- oder kontinuierliche Wachstum während der Kristallisation in Echtzeit, ohne dass eine Probenentnahme erforderlich ist
• Visualisieren Sie Kristallisationsparameter, die Nukleation, Aggregation, Polymorphismus und andere Systemattribute in Echtzeit beeinflussen

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Echtzeitüberwachung der biopharmazeutischen Kristallisation: Chord Length Distribution zur Kristallgrößenverteilung für Lysozym, rHu-Insulin und Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Die Autoren berichteten über den Erfolg bei der Entwicklung eines effizienten Verfahrens zur Echtzeitüberwachung biopharmazeutischer Kristallisationen. Dieses Verfahren verwendet ParticleTrack, um die CLD für eine Reihe biopharmazeutischer Moleküle unter statischen und dynamischen Bedingungen zu messen, und wendet dann mathematische Modellierung an, um die CLD in CSD umzuwandeln. Die untersuchten Biomoleküle weisen unterschiedliche Kristallformen auf, die von den experimentellen Bedingungen der Kristallisation abhängen. Lysozym kann tetragonale und nadelförmige Kristalle bilden, rHu-Insulin bildet rhomboedrische Kristalle und B12 bildet polyedrische Kristalle.

Die Autoren entwickelten Modelle zur Bestimmung der CSD für die Kristalle mit niedrigem Aspektverhältnis (tetragonal, rhomboedrisch, polyedrisch) und für die Kristalle mit hohem Aspektverhältnis (nadelförmig). Die Autoren verwendeten drei verschiedene Modelle zur Bestimmung der Kristallgrößenverteilung:

• Ein von einer anderen Forschungsgruppe entwickeltes Modell, das annahm, dass Kristalle als Kugeln dargestellt werden können (sphärischer äquivalenter Durchmesser, SED), war für die Kristalle mit niedrigem Aspektverhältnis effektiv
• Für Kristalle mit hohem Aspektverhältnis entwickelten die Autoren dieser Studie ein Modell, das auf der Breite basiert
• Schließlich entwickelten sie ein Modell, das auf der Länge basiert und das Aspektverhältnis spezifizieren muss

Die Ergebnisse der entwickelten Modelle zur Berechnung der CSD aus den FBRM-Messungen wurden dann mit CSD-Messungen verglichen, die durch Bildanalyse erhalten wurden.

Die Überwachung einer undurchsichtigen Kristallsuspension stellt eine Herausforderung dar, insbesondere wenn die Herstellerspezifikationen eine enge Partikelgrößenverteilung (PSD) verlangen. Für injizierbare Proteinkristallformulierungen kann die PSD die Viskosität stark beeinflussen und dient zudem als Frühwarnsystem für Aggregation oder andere Abbauprozesse, die die Formulierung potenziell beeinträchtigen können. Die In-situ-Überwachung wurde in einer Skalierungs-Chargen-Kristallisationsstudie eingesetzt, um die Bildung und das Wachstum von Humanwachstumshormon-(hGH)-Kristallen zu charakterisieren. Die Echtzeitanalyse erkannte eine Abweichung vom üblichen PSD-Profil, verursacht durch Unterschiede im Mischen zwischen den Gefäßen. Dies wurde durch anschließende Offline-Bildanalyse (IA) bestätigt.

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Kontinuierliche Kristallisationsprozesse in der pharmazeutischen Herstellung: Ein Überblick. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameterschätzung der stochastischen primären Nukleationskinetik mittels stochastischer Integrale anhand von fokussierten Strahlreflektanzmessungen. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Echtzeitüberwachung der biopharmazeutischen Kristallisation: Chordlängenverteilung zur Kristallgrößenverteilung für Lysozym, rHu Insulin und Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Beeinflussung der Kristallisation von Lysozym und supramolekularer Selbstanordnung in Lösung durch ionische Flüssigkeiten. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modellierung und Steuerung der Kristallform bei kontinuierlicher Protein-Kristallisation. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Steigerung der Kristallproduktionsrate und Verringerung der Polydispersität bei kontinuierlicher Protein-Kristallisation. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Proteinkristalle für die Abgabe von Biopharmazeutika. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301