Biyoterapötik ürünlerin düşük pH metoduyla viral olarak inaktivasyonunun pH, süre, sıcaklık, protein içeriği ve çözünmüş madde veya tampon içeriği tarafından etkilendiği bilinmektedir. Birçok virüs; 5,0-5,5 pH aralığında geri dönülmez şekilde denatüre olur ve etkin şekilde imha edilir. İnaktivasyonu ve yok edilmesi hedeflenen virüslerin çeşitlerine bağlı olarak bu aralık yeterli gelebilir. Bununla birlikte, birçok zarflı virüs ancak 3,5-4 pH aralığında etkin bir şekilde inaktive edilir.
Pek çok mAb biyoterapötik ürünü, birden çok virüs türünün özellikle geniş bir spektrumda uzaklaştırılmasını gerektirir. Bu amaçla; 3,5-4'lük bir "düşük" pH hedefi yaygın biçimde kullanılır (Şekil A). Öte yandan, bu pH aralığına uzun süre maruz bırakılması bazı biyoterapötik ürünlerin zarar görmesine veya inaktive olmasına da yol açabilir. Bunlar özellikle kan proteinleri, insülin vb. proteinler veya enzimlerdir (Şekil B). pH stresine uzun süreli maruziyet durumunda, proteinler ve enzimler önemli ölçüde deamidasyon, doğal yapının bozulması ve kümeleşme olgularıyla karşılaşır. İmmünoglobulin çözeltileri (hem IgG hem de IgM mAbs dâhil olmak üzere); 3,5-5,5 pH aralığında diğer protein ve enzimlere göre genellikle daha az duyarlıdır. Yine de, çeşitli derecelerde duyarlılıklarını korurlar. Viral inaktivasyon koşulları altında yeterince uzun kalınması bulaşıcı virüs yükünün etkin şekilde azaltılmasını sağlasa da geriye kalan viral parçacıklar, kalıntılar veya diğer içerik henüz fiziksel olarak ayrıştırılmamıştır (Şekil C).
Görece olarak kolay olması, az yer kaplaması ve genellikle yüzey etkin maddelerin veya diğer çözücülerin aksine ayrıştırılması için çok az müdahaleye ya da ek adıma ihtiyaç duyması nedeniyle, immünoglobulin mAb ürünlerinde viral inaktivasyon için en yaygın kullanılan metot düşük pH metodudur. Yine de, uygun ve ideal koşullar, moleküllere ve uzaklaştırılması gereken virüs çeşitlerine göre değişiklik gösterir. Bu nedenle; her molekül için etkin viral inaktivasyon gerçekleşebileceği tasarım uzayını ya da işlem sınırlarını tanımlamak ve doğrulamak üzere çalışmalar yürütülmesi gerekir. Bu sınırlar ve viral inaktivasyon prosesinin neticesi, viral inaktivasyon neticesini ve dolayısıyla İlaç Maddesi (DS) kalitesini etkileyen değişkenlerin veya Kritik Proses Parametreleri'nin (CPP'ler) genellikle tümü veya en azından bir bölümü tarafından tanımlanır. Bu faktörlerin tanımlanması ve yönetilmesi, ürün kalitesini ve miktarını olumlu yönde etkiler.
Geleneksel olarak; düşük pH metoduyla viral inaktivasyon çalışmaları, manyetik olarak karıştırılan beher kabı gibi bir kabın içindeki belirli bir hacim ve konsantrasyondaki immünoglobulin çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilir. Çalışma materyalinin büyük bölümü fizyolojik koşullara yakın bir başlangıç pH değerine sahip immünoglobulin çözeltilerini kullandığından, viral inaktivasyon çalışmaları reaktif ekleme parametrelerini açıklığa kavuşturmayı hedefleyecektir. Normal olarak, ara ara pH ölçümlerini kaydederek bir büret veya pipetleme yardımıyla manuel titrasyon gerçekleştirilir. Belirlenen sürenin ve hedeflenen virüs içeriğinin inaktivasyonuna yeterli gelen düşük pH koşullarında tutulan diğer parametrelerin tamamlanmasının ardından, İlaç Maddesi (DS) veya immünoglobulin çözeltisi ters titrasyon yoluyla düşük pH aralığından uygun fizyolojik ya da hafifçe bazik bir aralığa çıkartılır. Böylece, düşük pH seviyesinde tutma metoduyla viral inaktivasyon tamamlanmış olur. Bununla birlikte, viral inaktivasyon için düşük pH titrasyonu çalışması boyunca, kümeleşme veya deamidasyon gibi çeşitli kalite özelliklerini Boyut Değişim Kromatografisi (SEC) gibi metotlar vasıtasıyla belgelemek üzere offline analizlerin yapılabilmesi için örnek ekstraksiyonuna ihtiyaç duyulur. Vasıflı bilim insanları gerekli hassasiyeti gösterseler de viral inaktivasyon prosesi normal olarak zahmetlidir ve her manuel proses gibi doğal değişimlerden, hatalardan ve tekrarlanabilirlik zorluklarından muzdariptir.
