Inactivación viral en el bioprocesamiento,

La inactivación viral es el primero de los dos pasos específicos que se suelen destinar a aumentar la seguridad de los productos bioterapéuticos. Durante la inactivación, cualquier virus presente en la suspensión terapéutica agrupada y semipurificada se destruye de forma intencionada o se transforma repentinamente en no patógeno, normalmente mediante la modificación del entorno del virus, lo que provocar la alteración y desnaturalización de la estructura vírica.

Esto se suele llevar a cabo mediante la modificación del entorno del virus, lo que provocar la alteración y desnaturalización de la estructura vírica,  es decir, mediante métodos químicos, físicos o incluso energéticos. La eliminación viral es independiente y diferente de la inactivación viral, ya que esta consiste en un proceso complementario para aumentar aún más la seguridad vírica eliminando o depurando el virus de las proteínas o productos de interés.

Muchos productos bioterapéuticos contienen virus o pueden contaminarse de estos durante su producción o procesamiento. En estas modalidades, la patogenicidad y la carga vírica o cantidad de virus se tienen que eliminar o depurar mediante la inactivación o eliminación para evitar provocar daños al paciente; por lo general, ninguno de estos procesos por sí solo es suficiente. Hay disponibles varios métodos de inactivación y eliminación viral, en función de las características específicas del virus y del tipo de producto bioterapéutico. Muchos flujos de procesamiento de productos bioterapéuticos emplean una combinación de métodos complementarios para aumentar el espectro de virus, que se pueden eliminar adecuadamente.

Inactivación
Existen varios métodos de inactivación viral: Los más comunes son:

• Métodos basados en un pH bajo , sobre todo para productos bioterapéuticos como los anticuerpos monoclonales (mAbs)
• Métodos basados en disolventes o tensoactivos, normalmente para polisacáridos

Entre los métodos de inactivación viral usados con menor frecuencia se encuentran la pasteurización, el calor en seco y el calor a vapor, sobre todo para productos basados en sangre y suero.

Eliminación viral
Entre los métodos bien documentados para la eliminación viral se encuentran la precipitación, la cromatografía y la nanofiltración.

La selección de los métodos que se emplearán para la inactivación y eliminación virales depende del tamaño, tipo y labilidad del producto bioterapéutico que se vaya a preparar, del método o los métodos de purificación que el fabricante prefiera usar y de la naturaleza y título de los virus en cuestión. La estructura y función de las sustancias medicamentosas (DS, por sus siglas en inglés) son atributos de calidad tan importantes como la seguridad vírica, por lo que deben evaluarse y mantenerse bajo control en todo momento. Cualquier método de inactivación viral, de pH bajo o de tensoactivos, se beneficia del control preciso y simultáneo de los distintos parámetros esenciales del proceso (CPP, por sus siglas en inglés); una capacidad que se requiere para entender de forma eficaz el proceso en sí mismo y el efecto de la sustancia medicamentosa. Los reactores de síntesis química permiten el mapeado de un proceso moderno y una operación coherente dentro de un espacio de parámetros definidos, así como la creación de modelos para la transferencia y el escalado de los métodos.

Se tiene constancia de que la inactivación viral de pH bajo de productos bioterapéuticos se ve influenciada por el pH, el tiempo, la temperatura y el contenido de proteínas y solutos o contenido de la solución tampón. Muchos virus se desnaturalizan de forma irreversible y se destruyen eficazmente a un pH de 5,0-5,5. En función del alcance de los virus objeto de la inactivación y depuración, este rango puede ser suficiente. Sin embargo, varios virus con envoltura se inactivan de forma eficaz solo a un rango de pH de 3,5-4.

Muchos productos bioterapéuticos de mAb requieren una depuración con un espectro especialmente amplio para muchos tipos de virus, de forma que se suele establecer un objetivo de pH “bajo” de 3,5-4 (figura A). No obstante, la exposición prolongada a este rango de pH puede dañar o inactivar algunos productos bioterapéuticos, sobre todo las proteínas o enzimas como las proteínas sanguíneas y la insulina (figura B). Con una exposición prolongada al estrés del pH, las proteínas y las enzimas están sujetas a una desamidación, desnaturalización y agregación significativas. Las soluciones de inmunoglobulina (incluidas tanto las IgG como las IgM mAbs) suelen ser menos susceptibles que otras proteínas o enzimas a un pH de 3,5-5.5, aunque siguen siendo susceptibles a varios grados. Después de un tiempo suficiente en condiciones de inactivación viral, la carga vírica infecciosa debería minimizarse eficazmente. Sin embargo, las partículas virales residuales, los deshechos u otro contenido no se eliminarán físicamente (figura C).

Para los productos de inmunoglobulina de mAb, el pH bajo es el método que se usa con mayor frecuencia para la inactivación viral, dada su relativa sencillez, dimensiones reducidas, escasa intervención y ausencia de pasos adicionales para su eliminación, a diferencia de los tensoactivos u otros disolventes. Aun así, las condiciones apropiadas y óptimas pueden variar entre las moléculas, así como el espectro que se requiere para la depuración vírica. Por tanto, deben llevarse a cabo estudios para cada molécula a fin de caracterizar y validar el espacio de diseño o los límites operativos en los que puede tener lugar una inactivación viral eficaz. Estos límites y el resultado del proceso de inactivación viral suelen venir definidos por todas las variables o los parámetros especiales del proceso, o al menos una selección de estos, que influyen en el resultado de la inactivación viral y, por tanto, en la calidad de la sustancia medicamentosa. La identificación y la navegación por estos factores afectará positivamente a la calidad y cantidad del producto.

Los estudios de inactivación viral de pH bajo se han realizado tradicionalmente con un volumen y una concentración establecidos de solución de inmunoglobulina, en un recipiente como un vaso con agitado magnético. Como para la mayoría de materiales de los estudios se emplean soluciones de inmunoglobulina con un pH inicial cercano a las condiciones fisiológicas, los estudios de inactivación viral tratarán de dilucidar los parámetros de la adición de reactivos. Normalmente, se lleva a cabo una valoración manual mediante una bureta o pipeta, al tiempo que se registra intermitentemente la medición de pH. Una vez transcurrido el tiempo indicado y mantenidos los otros parámetros a unas condiciones de pH lo suficientemente bajas como para inactivar el contenido vírico objetivo, la sustancia medicamentosa o la solución de inmunoglobulina se someterá a una valoración inversa desde el rango de pH bajo hasta el rango adecuado desde el punto de vista fisiológico o el rango ligeramente básico. Con ello, se completa la inactivación viral mediante el mantenimiento de un pH bajo. Sin embargo, durante el estudio de valoración con pH bajo para la inactivación viral, se precisa la extracción de muestras para documentar, mediante el análisis fuera de línea, distintos atributos de calidad, como la agregación o la desamidación, mediante métodos como la cromatografía de intercambio por tamaños (SEC, por sus siglas en inglés). Aunque los científicos cualificados puede asegurar la precisión, la inactivación viral suele ser un proceso laborioso que presenta variaciones naturales, inexactitudes y problemas de reproducibilidad de cualquier proceso manual.

Si bien la necesidad principal de los estudios de inactivación viral con pH bajo en el bioprocesamiento posterior consiste en definir el alcance de la adición de reactivos y el tiempo necesario para el proceso, la caracterización de la cinética del proceso y el impacto de los parámetros del proceso de composición también son importantes y, en última instancia, constituyen un requisito para asegurar el diseño de un proceso de inactivación viral que sea sólido y esté optimizado. No obstante, la supervisión y el control de la temperatura son parámetros que se suelen pasar por alto y, por tanto, se descontrolan durante los estudios de desarrollo de procesos para la inactivación viral.

Este descuido puede deberse, en parte al uso de sistemas piloto o incluso básculas de fabricación comercial, que llevan a cabo la inactivación viral en recipientes de transferencia o retención que pueden registrar, pero no controlar la temperatura. La representatividad de la báscula, en concreto la representatividad de la mezcla, es otro parámetro que se suele pasar por alto fácilmente en los estudios de inactivación viral con pH bajo, como los realizados mediante plataformas manuales controladas por placas de agitación magnética. La falta de captura de datos para algo tan simple como el mezclado imposibilita la verificación de si las condiciones previstas del estudio eran correctas y coherentes. 

El tratamiento de pH bajo para la operación unitaria de la inactivación viral presenta un riesgo potencial para la agregación de productos en el proceso durante el procesamiento posterior de un anticuerpo monoclonal. En esta presentación, a cargo de Hiren D. Ardeshna de GlaxoSmithKline, se tratará el diseño experimental y completamente factorial para investigar el efecto de cuatro parámetros del proceso:

• Punto final de pH bajo
• Tiempo de espera de pH bajo
• Duración de la valoración de pH bajo
• Neutralización de la duración de la valoración

Los métodos de inactivación viral con disolvente o detergente son los más empleados para los virus con envoltura. Los reactivos que se suelen emplear tienen un impacto insignificante en la labilidad de la proteína o los anticuerpos terapéuticos, que están sujetos a los problemas de la desnaturalización o desamidación posibles con algunos métodos de pH bajo. Los métodos de tratamiento con disolventes o detergentes para la inactivación viral presentan muchas de las necesidades y factores determinantes de los métodos de pH bajo; principalmente para definir el alcance de la adición de reactivos (en este caso un disolvente o un detergente) y el tiempo necesario para el proceso. Al igual que con la inactivación viral con pH bajo, las condiciones varía entre las inmunoglobulinas u otros tipos de sustancias medicamentosas. Por tanto, deben llevarse a cabo estudios para cada molécula a fin de caracterizar y validar el espacio de diseño o los límites operativos en los que puede tener lugar una inactivación viral con disolvente o detergente eficaz. Estos límites y el resultado del proceso de inactivación viral se definen de forma similar mediante los parámetros esenciales del proceso, incluidos la temperatura, el contenido de proteínas o detergente y el tiempo en condiciones de inactivación, además del mezclado y la eficacia de la homogeneización del disolvente o detergente. La identificación y la navegación por estos factores afectará positivamente a la calidad y cantidad del producto.

Aunque los estudios de inactivación viral con detergentes no requieren la misma forma de valoración de reactivos que los estudios con pH bajo, sigue siendo necesaria la evaluación del espacio de diseño de las variables críticas. Al igual que con el pH bajo, los estudios de inactivación viral que usan disolventes o detergentes caracterizan tradicionalmente el proceso de forma completamente manual. La dosificación y los controles de los reactivos dependen tanto de la exactitud como la precisión de las personas altamente cualificadas que realizan varias tareas críticas de forma simultánea. Los estudios de inactivación viral con disolventes o detergentes también están sujetos a las variaciones naturales, las inexactitudes y los problemas de reproducibilidad.

Los métodos de inactivación viral que dependen de disolventes o detergentes requieren a menudo la consideración de otro factor que no suele ser relevante en los métodos de pH bajo. Cualquier disolvente o detergente que se añada debe eliminarse de la solución de inmunoglobulina o de la sustancia medicamentosa y tiene que verificarse con el método analítico apropiado. Los disolventes o detergentes se suelen eliminar mediante la cromatografía o el intercambio de soluciones tampón a través de la filtración de flujo tangencial. La eliminación de los disolventes o detergentes añadidos es, en cierto modo, similar a la finalidad de la valoración de pH inversa a partir de una inactivación con pH bajo hasta un rango fisiológico apropiado o ligeramente básico. A escala, los métodos de intercambio de soluciones tampón o de cromatografía tendrían lugar, probablemente, como operaciones unitarias continuas o semicontinuas a medida que el material se transfiere desde un recipiente de retención a través de una columna u otra membrana apropiada para el intercambio de disolventes o soluciones tampón. En el desarrollo de procesos, es probable que la inactivación viral con disolvente o detergente se produzca de forma independiente y diferente a siguiente etapa de purificación o eliminación. Por ello, esta práctica puede afectar a la continuidad de los datos o la información.

Los productos de vacunas que se someten a la inactivación viral son diversos, como el toxoide, la proteína recombinante, la subunidad, el polisacárido e incluso algunas vacunas de partículas similares a virus. De nuevo, para seleccionar un método de inactivación viral adecuado se debe considerar la naturaleza del producto bioterapéutico, así como la magnitud de los virus que deben depurarse eficazmente.

Por lo general, se deben tener muy en cuenta los métodos o prácticas alternativos que impiden la contaminación vírica externa de determinados tipos de vacunas, como las de virus vivos atenuados, en las que el producto bioterapéutico es una partícula viral. Las metodologías específicas para estos productos pueden incluir uno o más procesos de nanofiltración o cromatografía para reducir de forma eficaz la carga vírica externa en las respectivas fuentes de materia prima. Los virus que se inactivan o destruyen pueden someterse a un proceso adecuado de inactivación viral basado en disolventes o detergentes, o con un pH bajo, ya que con ello se puede mantener el efecto inmunoestimulador deseado, incluso si el producto vírico ha sido desnaturalizado o alterado de alguna u otra manera.

Por lo general, los métodos de inactivación viral no se consideran necesarios para los productos oligonucleótidos ni para distintos tipos de moléculas. Principalmente, esto se debe a la naturaleza de los reactivos, las condiciones de reacción y los métodos de procesamiento que resultan desfavorables en gran medida para los virus. En la actualidad, muchos de estos productos oligonucleótidos en desarrollo y producción se purifican, concentran y formulan principalmente mediante distintos intercambios de soluciones tampón, a través de la filtración de flujo tangencial o mediante uno de los diversos tipos de separación cromatográfica.

Dada la necesidad de la continuidad de los datos y los registros electrónicos de lotes, los reactores de síntesis química funcionan como un multiplicador de la fuerza en los procesos de inactivación viral, tanto por el diseño y la ejecución de los experimentos como por la facilitación de la captura e integridad de los datos. La tecnología analítica de procesos ortogonales (PAT, por sus siglas en inglés) sirve de puente para varias aplicaciones y flujos de trabajo, como la inactivación viral con intercambio de soluciones tampón, y para elabora los flujos de procesos de las operaciones a gran escala con mayor exactitud.

Visualice una demostración on-line en directo desde su puesto de trabajo o desde casa según su horario.

• Pulse el botón de reproducción y desaparezca; el software iC responderá dinámicamente a las condiciones que se den en el reactor. Ejecute las operaciones de forma coherente dentro de los límites del protocolo de inactivación viral.
• Capture los datos de varios sensores, incluidos el pH, la conductividad, potencial redox de oxidación(ORP, por sus siglas en inglés) y el oxígeno disuelto.
• Integre unidades periféricas como bombas o balanzas para la transferencia de masa gravimétrica.

La FTIR in situ y la espectroscopia Raman realizan el seguimiento de los componentes esenciales de los bioprocesos a lo largo de las operaciones unitarias anteriores, posteriores, de conjugación y de formulación.

La glucosa y los metabolitos principales pueden supervisarse en las aplicaciones de flujo ascendente, mientras que, en los procesos posteriores, la concentración de proteínas o vacunas, los estabilizadores, los excipientes y las impurezas pueden controlarse en tiempo real. sin el retraso ni los costes relacionados con el análisis fuera de línea.

Esto permite determinar rápidamente los puntos finales de los procesos, así como comprender de forma clara los efectos que tienen distintos parámetros de los procesos en la eficacia de estos y en la calidad de los productos.