什麼是生物製藥下游加工 （DSP）？
下游加工（DSP）是完成細胞生長和擴增，以及完成原料藥或其他成分的生產或合成後的一系列單元操作。下游加工旨在從散裝生長基質中分離、純化和濃縮先前合成的原料藥 （DS） 或其他產品。 從歷史上看，投資是為了提高上游的產量和滴度，使生物製劑開發更加經濟。前幾年，下游流程沒有在同一層級解決，現在需要進一步優化。
生物製藥下游加工是指從天然來源（例如動物或細菌細胞）中回收和純化原料藥。生物製藥DSP適用於單株抗體（mAb）或蛋白質製程以及 寡核苷酸、多醣、各種疫苗、生物偶聯物、基因療法和細胞治療產品的製造。
下游加工可能包括初始配方活動，標誌著從 DS 到藥品 （DP） 的過渡。 重要的考慮因素包括管理和測量產品品質屬性、多個製程參數、雜質的來源和數量、廢物流和生物危害。
DSP 活動在實驗室規模的工藝開發、中試和製造規模上進行，並得到製程分析技術 （PAT） 和製造科學與技術 （MSAT） 團隊的 協助，專注於製程優化、擴大和故障排除。 在發現生物學規模或高通量靶標篩選的早期階段進行類似的下游處理並不常見，儘管可以類似地執行， 原則上。
下游生物製程的 6 種創新技術
本指南討論了科學家如何利用過程分析技術 （PAT） 來改變日常工作流程並顯著改善下游流程。主題包括：
- 蛋白質濃度監測
- 緩衝區交換流程優化
- 疫苗佐劑的組成、分佈和形態
- 病毒滅活自動化
- 生物偶聯工藝開發
與下游處理相關的步驟和工具是什麼？
1. 收穫：預處理、離心和過濾
- 預處理：
表面活性劑裂解、有機相吸收： 裂解產品分離通常追求一個基本目標：有效破壞含有原料藥或產品的螯合結構，並在任何碎片、雜質和原料藥之間建立物理分離。酸或表面活性劑裂解幾乎完全用於細菌或酵母培養物。同樣，產物的有機相吸收和捕獲在細菌表達和生產系統中最常見，偶爾也用於酵母系統。
絮凝和沉澱： 這些是主動粒子系統操縱以達到分離目標的方法。 絮凝 通常用作過濾或離心前的製備方法。應用絮凝可確保過濾裝置上的高質量通量，以及高效且經濟高效地從上清液中分離細胞材料。可能需要額外的絮凝劑去除方法和驗證協議。沉澱是一種主動粒子操縱，由改變參數（例如溶劑和離子強度）觸發，以降低溶解度。 - 離心： 離心被廣泛採用為生物製程中的一種分離方法，是一種常見且主要的技術，用於根據質量或分子量作為轉鼓速度、填充和排放速率的函數來不加區別地分離顆粒碎片。常見的工業離心機可去除小至 5μm 的粒徑的大量顆粒物（高達 99%），有時可去除 1μm 的高度優化製程。儘管有這種效率，離心機仍然可以將有問題數量的微粒，尤其是奈米顆粒，傳遞到需要進一步處理的下游操作中。由於生物製程通常實現高到非常高的總生物質（微粒和奈米顆粒）和可變的最終活細胞密度，固定離心能力也會限制製程通量，並且被廣泛認為不適用於連續生物製程。
- 深度過濾、中空纖維： 根據產品和製程的性質，收穫方法通常包括深度過濾（圖1-1）或中空纖維過濾器 （圖1-2）。通過深度過濾， 含顆粒的混合物被泵入膜或其他界面，以將碎片與液體懸浮液中的產品分離。中空纖維過濾器用於連續生物加工操作，以去除上清液表達的原料藥 （DS），同時在用逆流介質反沖洗之前暫時將一部分生物質捕獲在中空纖維中。聲場流分離是目前主要在開發環境中發現的另一種新興技術。透過各種操作和配置模式，結果可以：
- 調節無細胞或顆粒分離（圖 1-3a）
- 選擇從進料流中分離細胞或顆粒到新的捕獲流中，並轉移或分離第二個顆粒群（圖 1-3b）
- 將整個粒子系統重新定位到新的流和/或流體的重新分配中，可能在再循環中（圖 1-3c）
- 流體動力學相互作用，其中可能會發生顆粒選擇和流體交換的調製混合物（圖 1-3d）
眾所周知，粒徑分佈 （PSD） 是影響過濾能力的關鍵製程參數 （CPP），其影響比單獨的濁度和壓力大得多。PSD 可以隨著時間的推移進行集成，以將顆粒堆積映射到過濾器（過濾器上方的探頭）並預測故障。還可以在過濾器下方測量 PSD，以觀察痕量顆粒突破並識別類似事件。
線上粒徑分析儀，例如 採用 FBRM® 技術的 ParticleTrack ™，可測量進入或逸出過濾器的細胞肉湯進料的顆粒累積和尺寸分佈，並提供容量相關性或回饋控制，以最大限度地減少製程中斷。 EasyViewer™ 與 Image2Chords™ 執行 影像分析，並從製程的時間分辨線上影像中提取顆粒累積、尺寸分佈和形態。EasyViewer 放置在過濾器上方或下方，可以提供容量相關性或反饋控制，但在應用於根本原因分析、表徵和形態學時最有價值。
2. 捕獲
捕獲的方法和策略根據目標分子的性質而略有變化。抗體由親和樹脂（例如蛋白 A 和蛋白 G）以及其他一些選擇性工程方法捕獲。非抗體蛋白和寡核苷酸通常通過離子交換層析法 （IEX） 捕獲。多醣和複雜聚醣結構等產物通常通過疏水相互作用層析（HIC）或反相層析（RPC）捕獲。
層析過程中的主要測量目標包括最大限度地提高產物與管柱的結合能力，測量為裝載到管柱上的產物質量（管柱負荷量），減去從管柱出口逸出的產物質量（稱為「突破」）。UV 是最常見的產品測量方法，廣泛用於蛋白質和 DNA 測量。產品和非產品測量的替代方法也是可能的。 線上 FTIR 光譜 可用於定量和鑑別成分，例如表面活性劑、常見糖或胺基酸緩衝液、脂質、偶聯產物，甚至具有可變構象結構的產品，例如單克隆抗體的片段、單體或聚集體形式的產物。當僅紫外線無法測量重要的非蛋白質/非核酸成分時，除了紫外線之外，最常使用 FTIR。
- 親和層析（蛋白A/G） 是一種首過層析方法（通常稱為蛋白A或ProA），透過特定的結合相互作用（圖a）可逆地結合或保留目標蛋白到管柱 上，而其他成分則透過管柱「洗脫」（圖b），將目標產物（通常是mAb）與其他可溶性物質分離並濃縮。選擇性洗脫遵循一系列洗滌步驟，然後釋放目標分子（圖 c）。
- 離子交換層析（IEX） 根據與固相材料的靜電相互作用強度， 將目標分子可逆地結合或保留到管柱上，將目標產物（蛋白質、寡核苷酸等）與其他可溶性材料分離和濃縮（圖2d），而其他組分則通過管柱“洗脫”。IEX 通常用作附加或替代純化方法，因此不限於捕獲應用。
ReactIR™ 等原位FTIR光譜儀的取樣速度和檢測限（LoD）有利於初級捕獲層析，可記錄快速洗脫的波峰或餾分內 的多個測量點，同時定量區分多種成分。在線 FTIR 光譜使用戶能夠監控可變進料輸入以及樹脂質量和使用壽命性能，識別和指紋洗脫組件，並消除接收分析結果的延遲，從而實時做出數據驅動的決策。
3. 緩衝液交換和濃度上升
超濾 （UF） 經常用於下游生物工藝，以濃縮稀產品流。超濾根據膜孔徑或截留分子量分離溶液中的分子。洗濾 （DF） 最常用於將產品交換成所需的緩衝液（例如，從洗脫緩衝液到最終配方緩衝液）。
超濾和洗濾（統稱為緩衝液交換）通常使用切向流過濾 （TFF），其中進料平行於膜表面流動，而不是垂直於表面（圖 3）。緩衝區交換仍然是一項高度手動的操作，很少得到最佳化。產物濃度通常通過一種紫外光譜法進行分析，可以是獨立的，可以作為 HPLC 的檢測器，也可以作為可變光程方法。
緩衝區交換過程中會出現幾個挑戰：
- 準確追蹤交易量
- 從非代表性抓取樣品中進行可靠的過程預測
- 離線測量的延遲或瓶頸響應時間
- 萃取取樣的累積產品損失
- 離線UV和HPLC測量樣品製備過程中的誤差傳播
原位紅外 和拉曼光譜 使多個組件能夠同時分析，具有更高的精度和動態範圍，並且沒有與離線分析相關的延遲。使用 ReactIR 的原位 FTIR 光譜可以在緩衝液交換過程中提供許多好處：
- 同時即時定量多種賦形劑和原料藥 （DS） 種類
- 控制緩衝區使用量
- 監測膜效應
- 使用直接原位濃度而不是直徑體積近似值
- 濃度準確度從 +/-5% 提高到 +/-2%
- 消除分析延遲
EasyMax™ 等自動化反應器透過擷取實驗資料、精確控制所有關鍵製程參數 （CPP） 以及整合生物物理感測器，包括 pH、電導率、氧化還原和溶解氧 （DO），將製程開發速度加快高達 80%。
4. 淨化（以及污染物或雜質清除）
有幾種按順序採用的方法用於提高原料藥 （DS） 的純度。從早期澄清和萃取步驟開始，然後是適當的捕獲方法和首先進行批量分離，然後是純化的中間和最後階段，後者包括拋光層析、奈米/無菌過濾、 結晶和病毒清除（圖 4）。
透過消除與離線分析相關的延遲，原位 FTIR 測量在中間純化步驟中提供即時回饋來定量和特定餾分成分，包括緩衝液、原料藥和雜質，從而改善拋光層析步驟。這可以改善餾分切割、聚集體或片段區分以及即時總濃度。
為了清除病毒，混合和半純化的治療懸浮液中存在的任何病毒都會被故意破壞或突然畸形為非致病性形式，通常是通過改變病毒周圍的環境。控制和完善這些關鍵製程參數 （CPP） 是透過具有整合生物物理感測器的 自動化反應器平台 實現的。 在線過程分析技術 （PAT） 可用於表徵純化後期階段的雜質，因為濃度通常較高，並且更容易區分半純化基質中的產物。
5. 生物偶聯（分子依賴性）
生物偶聯物分子旨在通過兩種或多種不同治療類型分子的組合功能來提高療效。生物偶聯物化學需要詳細的製程表徵和最佳化。微量離心管、燒杯、熱板、磁力攪拌棒和轉移移液器等傳統工具不再能夠滿足 pH 值、溫度、劑量、混合和其他參數的再現性要求。
生物偶聯化學依賴於一系列控制良好的步驟，其中可能包括官能團還原、活化、API 連接子與主要生物製劑的偶聯，以及任意數量的洗滌、溶劑或緩衝液交換步驟（圖 5）。生物製藥科學家正在採用已經廣泛用於小分子研發的技術，例如 EasyMax 自動化合成反應器。EasyMax提供了一個內聚的架構，以便精確控制包括pH、電導率、氧化還原、溫度、攪拌、劑量等在內的相關工藝參數，並準確捕獲實驗數據。生物偶聯化學的自動化提供了數據集成、過程事件相關性、實驗完整性和 實驗設計 （DoE） 放大參數。
EasyMax 能夠對 DoE 空間進行快速評估和精細的 CPP 控制，包括混合條件、溫度控制、劑量策略和速率。消除與離線、手動方法和不良的關鍵製程參數控制相關的實驗變異性。原 位 FTIR 和拉曼光譜 可以 即時提供詳細的機理信息，消除離線延遲和採樣不準確。
6. 配方
配方的目標是將產品分子從用於合成產品的環境、溶劑或其他物理狀態轉變為人體臨床給藥可接受的形式（圖 6）。產品分子是根據最終產品將如何通過吸入、注射或口服給藥的使用來配製的。評估產品和相關賦形劑的長期穩定性，以確保測量的劑量和臨界質量屬性 （CQA） 在加工、儲存和運輸後符合規格。除了無菌之外，確保去除雜質和內毒素並防止藥品 （DP） 降解對於在蛋白質治療藥物的製造和長期儲存過程中保持安全性和有效性至關重要。
配製的藥品包括蛋白質（特別是單克隆抗體）、多醣、奈米顆粒系統、有機物、寡核苷酸、基因療法和多種類型的疫苗。某些疫苗將使用佐劑配製，通常是鋁基顆粒或有機乳液。 尤其是疫苗配方 和佐劑合成，是有利於自動化並聯反應器工作站、工作流程數位化和正交 過程分析技術 （PAT） 的工作流程 整合。透過即時 PAT，可以獲得更多有關流程的知識，而不僅僅是分析起點和終點。
EasyMax 等 並行反應器系統控制所有關鍵製程參數，並整合 ReactIR、ReactRaman™、 ParticleTrack、 EasyViewer 等生物物理感測器等 內聯 PAT 工具。這些技術經常用於配方中，以表徵原料藥和藥品的穩定性、最終濃度、佐劑合成、 聚合、封裝、吸附和其他顆粒事件。
其他資源
相關產品
引文和參考文獻
專題出版物：氯化鋅沉澱捕獲重組抗體
EasyMax 和 ParticleTrack 支援純化
杜特拉，G.、科穆茨基，D.、榮格鮑爾，A. 和薩澤爾，P. （2020）。通過不含聚乙二醇的 ZnCl2 沉澱連續 捕獲重組抗體。 生命科學工程， 20（7）， 265–274。https://doi.org/10.1002/elsc.201900160
作者報告了使用二價陽離子，特別是 ZnCl2，以基於沉澱的方法捕獲和純化單克隆抗體。 由於二價陽離子的交聯性質和消除 PEG，上清液和再溶解稀釋因子的粘度非常低。
通過保持 ZnCl2 濃度靜止並使用 EasyMax 自動化實驗室反應器改變 pH 值，作者量化了 pH 值對產量的影響。使用 ParticleTrack FBRM 探針監測沉澱，並在不同 pH 值下測量蛋白質簇的大小分佈。他們發現，降水的最佳 pH 值在 pH 6 和 7 左右，並且 pH 值對沉澱物簇的大小有很大影響，最大的簇與更好的產量相關。他們指出，FBRM 在線監測可用於估計所得產量，而無需離線測量降水期間的實際濃度。
特色出版物：磷酸鋁佐劑的物理化學研究
EasyMax 平台整合了原位光譜學和顆粒表徵
Mei， C.、Deshmukh， SS、Cronin， JT、Cong， S.、Chapman， DP、Lazaris， N.、Sampaleanu， L.、Schacht， U.、Drolet-Vives， K.、Ore， MO、Morin， S.、Carpick， B.、Balmer， MT 和 Kirkitadze， M. （2019）。磷酸鋁疫苗佐劑：使用離線和在線工具分析成分和尺寸。 計算與結構生物技術雜誌， 17， 1184–1194。https://doi.org/10.1016/j.csbj.2019.08.003
由於抗原和佐劑之間的相互作用對疫苗免疫原性很重要，因此作者研究了佐劑（在本例中為 AlPO4）的理化性質，例如粒徑和化學成分。他們使用 了傅立葉變換紅外線 （FTIR） 和 拉曼光譜、X 射線光電子能譜 （XPS）、雷射衍射等離線技術，以及包括原位 ATR-FTIR 光譜 （ReactIR）、拉曼光譜 （ReactRaman） 和 聚焦光束反射率測量 （FBRM、ParticleTrack） 等離線技術.在線上測量方面，通過FBRM檢查磷酸鋁和吸附蛋白的粒徑分佈，並使用原位ATR探針進行磷酸鋁的成分分析。
作者得出結論，在線 PAT 可有效監測佐劑製造各個階段的粒徑和化學成分。 類似的方法也可用於幫助評估批次間的一致性。他們表示，內聯 PAT 的使用支援先進的製造策略，例如即時產品放行測試。
同行評審出版物中的下游處理
以下是生物技術和生物製藥行業下游加工的最新出版物的精選。
- 加格，M. 和拉索爾，AS （2023）。PAT在藥品製造中的應用：基於模型的反溶劑輔助結晶中粒徑分佈控制。 化學技術與生物技術雜誌， 98（12）， 2806–2811。https://doi.org/10.1002/jctb.7497
- 杜特拉，G.、科穆茨基，D.、榮格鮑爾，A. 和薩澤爾，P. （2020）。通過 ZnCl2 沉澱連續捕獲重組抗體，無需聚乙二醇。 生命科學工程， 20（7）， 265–274。https://doi.org/10.1002/elsc.201900160
- Wasalathanthri， DP、Rehmann， MS、Song， Y.、Gu， Y.、Luo， M.、Shao， C.、Chemmalil， L.、Lee， J.、Ghose， S.、Borys， M.、Ding， J. 和 Li， ZJ （2020）。生物製藥開發中實時質量屬性和工藝參數監測的技術展望——綜述。 生物技術與生物工程， 117（10）， 3182–3198。https://doi.org/10.1002/bit.27461
- Mei， C.、Deshmukh， SS、Cronin， JT、Cong， S.、Chapman， DP、Lazaris， N.、Sampaleanu， L.、Schacht， U.、Drolet-Vives， K.、Ore， MO、Morin， S.、Carpick， B.、Balmer， MT 和 Kirkitadze， M. （2019）。磷酸鋁疫苗佐劑：使用離線和在線工具分析成分和尺寸。 計算與結構生物技術雜誌， 17， 1184–1194。https://doi.org/10.1016/j.csbj.2019.08.003
- Kager， J.、Berezhinskiy， V.、Zimmerleiter， R.、Brandstetter， M. 和 Herwig， C. （2019）。使用侵入性和非侵入性紅外測量擴展用於生物過程狀態估計的粒子過濾器。在 計算機輔助化學工程 中（第 1417-1422 頁）。https://doi.org/10.1016/b978-0-12-818634-3.50237-x
- 布倫納，M.，布羅西格，P.，洛辛，M.，昆澤爾曼，M.，卡爾維特，A.，斯蒂菲爾，F.，貝希曼，J.，昂索爾德，A.，和肖布，J.（2019）。邁向穩健的細胞培養過程 — 透過光譜線上監測揭示培養基製備的影響。 生命科學工程， 19（10）， 666–680。https://doi.org/10.1002/elsc.201900050
- Deshors， M.、Guais， O.、Neugnot‐Roux， V.、Cameleyre， X.、Fillaudeau， L. 和 François， J. （2019）。結合原位物理和異位生化方法，研究動物營養中使用的酶混合物對脫澱粉麥麩的體外解構。 生物工程和生物技術前沿， 7。https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00158
- 格羅尚斯，S.，呂特，M.，桑登，A.，布雷斯特里希，N.，摩根斯特恩，J.，海斯勒，S.，和哈布赫，J.（2018）。在線傅立葉變換紅外光譜是一種用於製備蛋白質層析的多功能過程分析技術。色譜雜誌 A，1547 年，37-44。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.03.005
- Lemoine， A.、Delvigne， F.、Bockisch， A.、Neubauer， P. 和 Junne， S. （2017）。用於確定由不均勻栽培條件引起的種群異質性的工具。 生物技術雜誌， 251， 84-93。https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.03.020
- 德克森，A.，戴維斯，KA，柯林斯，J.，巴塔查里亞，K.，芬尼曼，JI，佩平，EL，Ryczek，JS，布朗，P.，韋爾伯恩，WB，曼加拉蒂拉姆，R.，埃文斯，B.，波佐，MJ，和芬恩，RF（2017）。FGF21 蛋白-抗體偶聯物的工藝開發。 勝肽科學， 110（1）。https://doi.org/10.1002/bip.23042
- 科赫，C.，波施，AE，赫維格，C. 和倫德爾，B. （2016）。用於在線發酵監測的光纖和導管衰減全反射 （ATR） 傅立葉變換紅外 （FT-IR） 設置的比較。 應用光譜學， 70（12），1965-1973。https://doi.org/10.1177/0003702816662618
- 薩拉查，A.、布萊夫斯，J.、西蒙，A.、舒斯勒，S.、庫斯根，M.、斯坦凱維奇，NR 和馮哈根，J. （2016）。化學成分確定的細胞培養基的壓實通過增加溶劑可及表面積來提高其溶解率。 粉末技術， 301， 110–117。https://doi.org/10.1016/j.powtec.2016.05.065
- Lopez-Exposito， P.， Suárez， Á.B.，和內格羅，C.（2015）。根據弦長分佈數據估計萊茵衣原體生物量濃度。 應用藻類學雜誌， 28（4）， 2315–2322。https://doi.org/10.1007/s10811-015-0749-4
- 西布利斯特，C.、詹茲施，M. 和波爾沙伊特，M. （2015）。設備表徵以降低細胞培養製造過程轉移過程中的風險。 細胞技術， 68（4）， 1381–1401。https://doi.org/10.1007/s10616-015-9899-0
- Fagaschewski， J.、Sellin， D.、Wiedenhöfer， C.、Bohne， S.、Trieu， HK 和 Hilterhaus， L. （2015）。使用微流體系統和 FT-IR 光譜作為生物催化工藝開發的工具，對反應進度進行空間解析原位測定。 生物過程與生物系統工程， 38（7）， 1399–1405。https://doi.org/10.1007/s00449-015-1381-z
- Wu， H.、Read， EK、White， M.、Chavez， B.、Brorson， K.、Agarabi， C. 和 Khan， MA （2015）。通過傅立葉變換紅外光譜實時監測生物反應器 mAb IgG3 細胞培養過程動態：對實現細胞培養過程分析技術的影響。 化學科學與工程前沿， 9（3）， 386–406。https://doi.org/10.1007/s11705-015-1533-3
- 科赫，C.，波施，AE，戈伊科切亞，HC，赫維格，C.，和倫德爾，B.（2014）。通過傅立葉變換紅外光譜通過偏最小二乘回歸和多變量曲線分辨率對生物過程中的多分析物進行定量。 Analytica ChimicaActa，807， 103–110。https://doi.org/10.1016/j.aca.2013.10.042
- 瓦爾特，C.、梅耶爾，S.、榮格鮑爾，A. 和杜勞爾，A. （2014）。為 PAT 做好準備：擴大和在線監測 Npro 融合蛋白的蛋白質重折疊。 過程生物化學， 49（7）， 1113–1121。https://doi.org/10.1016/j.procbio.2014.03.022
- Tscheließnig， A.、Satzer， P.、Hammerschmidt， N.、Schulz， H.、Helk， B. 和 Jungbauer， A. （2014）。乙醇沉澱用於純化重組抗體。生物技術雜誌，188,17-28。 https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.07.436
- 薩格邁斯特，P.，克門特，M.，韋克塞爾伯格，P.，梅茨，A.，蘭格曼，T.，和赫維格，C.（2013）。軟傳感器輔助混合飼料生物過程的動態研究。 過程生物化學， 48（12），1839-1847。https://doi.org/10.1016/j.procbio.2013.09.018
- 薩格邁斯特，P.、蘭格曼，T.、韋克塞爾伯格，P.、梅茨，A. 和赫維格，C. （2013）。一種研究誘導狀態代謝能力隨溫度變化的動態方法。 微生物細胞工廠， 12（1）。https://doi.org/10.1186/1475-2859-12-94
- 達爾巴卡，J.，基維哈爾朱，K.，埃里凱寧，T.，和法格維克，K.（2012）。使用 FTIR/ATR 光譜和基於庫類型數據的定量模型監測 Streptomyces peucetius 栽培。 生物技術快報， 35（3）， 337–343。https://doi.org/10.1007/s10529-012-1093-2
- 達爾巴卡，J.，維加爾，J.，馮·韋馬恩，N.，法格維克，K.（2012）。使用 FT-IR/ATR 在線測量畢赤酵母發酵中的底物濃度。 生物技術快報， 34（6）， 1009–1017。https://doi.org/10.1007/s10529-012-0868-9
- 蘭德格里布，D.、哈克，C.、霍普夫納，T.、博特爾，S.、希茨曼，B.、謝珀，T.、里爾，M.和里爾登，KF （2010）。用於生物過程監測的在線紅外光譜。 應用微生物學與生物技術， 88（1）， 11-22。https://doi.org/10.1007/s00253-010-2743-8
- 達布羅斯，M.，舒勒，MM 和馬里森，IW （2010）。基於增強的生物質在線測量，簡單控制生物技術補料分批工藝中的特定生長率。 生物過程和生物系統工程， 33（9）， 1109–1118。https://doi.org/10.1007/s00449-010-0438-2
- Müller， J.、Neumann， M.、Scholl， P.、Hilterhaus， L.、Eckstein， M.、Thum， O. 和 Liese， A. （2010）。通過 FT-IR 和化學計量學在線監測高粘度多相系統中的生物轉化。 分析化學， 82（14）， 6008–6014。https://doi.org/10.1021/ac100469t