Cristalização de Proteínas

A cristalização de proteínas é o ato e método de criar redes estruturadas e ordenadas para macromoléculas complexas. As proteínas são tipicamente amorfas como sólidos e propensas à desnaturação, enquanto as proteínas existentes em redes cristalinas resistem à desnaturação e possuem maior estabilidade. As proteínas podem cristalizar se colocadas em ambientes adequados e propícios. A cristalização de proteínas é vista tanto como uma arte quanto uma ciência, devido às interações altamente complexas das variáveis que influenciam o processo de cristalização de proteínas.

A razão mais comum para criar cristais de proteínas é apoiar investigações em biologia estrutural, tipicamente via cristalografia por difração de raios X. Os pesquisadores podem visualizar áreas na estrutura que permitem interação com outras moléculas ao entender as estruturas tridimensionais das proteínas (por exemplo, para compreender melhor como enzimas, substratos e ligantes interagem). Além disso, a cristalização é um meio eficaz de criar proteínas puras, livres de contaminação por outras proteínas ou matéria biológica extrínseca, oferecendo assim um meio alternativo de purificação e separação à cromatografia preparativa. 

A cristalização ocorre por meio de uma série de mecanismos interdependentes que são influenciados de forma única pela escolha dos parâmetros do processo: nucleação, crescimento, exsudação, aglomeração, quebra, semeadura e transição polimórfica.

Frequentemente, esses mecanismos ocorrem simultaneamente, tornando o design eficaz da cristalização um desafio. Na ausência de compreensão mecanicista, os cientistas dependem de tentativa e erro para ajustar os parâmetros do processo e otimizar o rendimento, a pureza e o tamanho dos cristais. Ao entender quais mecanismos ocorrem durante a cristalização, os cientistas podem implementar estratégias para obter um produto cristalino com as propriedades desejadas.

As proteínas são cada vez mais importantes como medicamentos terapêuticos. No entanto, produzir proteínas com a estabilidade necessária apresenta desafios-chave, incluindo variação do produto, perda de estrutura que reduziria a eficácia e a formação de subprodutos potencialmente perigosos. A cristalização de proteínas é um método para produzir formas sólidas puras e estáveis de dosagem e vários medicamentos injetáveis e infundidos associados a cristais de proteínas. No passado, a cristalização de proteínas era uma atividade de laboratório para apoiar a cristalografia de raios X, mas devido ao crescimento exponencial dos medicamentos baseados em proteínas, a ampliação da cristalização de proteínas para níveis de produção é cada vez mais importante e uma área de foco intensivo.

A ampliação da cristalização de proteínas é fundamentalmente análoga à cristalização de pequenas moléculas em seus requisitos para otimizar os Parâmetros Críticos do Processo (CPPs) em escala laboratorial para alcançar os Atributos Críticos de Qualidade (CQAs) de uma substância farmacêutica cristalizada em escalas comerciais. Uma plataforma holística para o desenvolvimento e ampliação do processo de cristalização de proteínas normalmente abrange:

• Caracterização in situ do sistema de partículas
• Monitoramento espectroscópico e caracterização de polimorfos
• Otimização do procedimento e estratégias de controle por feedback através de módulos e sensores integrados

Existem aplicações farmacêuticas importantes associadas à cristalização de proteínas: química medicinal via biologia estrutural, desenvolvimento de medicamentos proteicos, ampliação, separação e purificação, formulação e administração de medicamentos.

• Química medicinal via biologia estrutural. Avanços nas técnicas de cristalização de proteínas e melhorias na cristalografia de raios X levaram à dedução de dezenas de milhares de estruturas tridimensionais de proteínas. Compreender as interações droga-receptor em grande detalhe é possível ao determinar a estrutura dessas macromoléculas complexas e visualizar os sítios de ligação. Essa informação permite um entendimento maior em nível molecular de inibidores de proteínas, ativadores alostéricos, cofatores e até sítios catalíticos de enzimas ou 'sítios ativos' – resultando em medicamentos melhores com eficácia aprimorada. Um exemplo clássico da importância de compreender a estrutura proteína-inibidor via cristalografia é demonstrado pelos grandes avanços no desenvolvimento de proteases do HIV.
• Desenvolvimento, ampliação, separação e purificação para terapêuticos baseados em proteínas. Além de cultivar cristais únicos de proteínas para cristalografia de raios X, a indústria farmacêutica aumentou os esforços no desenvolvimento de terapêuticos baseados em cristais de proteínas. O objetivo dessas aplicações é desenvolver e ampliar para grandes quantidades de cristais de proteínas puros e estáveis que tenham o tamanho de partícula correto e distribuição de tamanho de partícula bem controlada. Em relação à cromatografia preparativa, a cristalização de proteínas tem o potencial de ser um meio alternativo econômico de separação e purificação de macromoléculas e para isolamento de moléculas quirais. As ferramentas para ampliar cristalizações de proteínas são análogas às usadas para ampliar reações químicas, com a necessidade de entender os CPPs e seu efeito nos CQAs.
• Formulação e administração de medicamentos. Os terapêuticos proteicos são administrados como soluções e podem ser entregues via injeção ou infusão. Como é necessário administrar grandes quantidades de proteína, as soluções proteicas infundidas são diluídas para evitar problemas de viscosidade e agregação. Isso é menos conveniente para o paciente e para o hospital devido ao tempo necessário para infundir todo o tratamento, mas também pode contribuir para o fenômeno da menor adesão do paciente a qualquer forma de administração parenteral. O uso da forma cristalina das proteínas em suspensão é de grande interesse, pois essas formulações apresentam menos problemas de viscosidade e podem ser administradas em concentrações mais altas. Outro ponto importante é que o tamanho dos cristais de proteínas deve ser cuidadosamente controlado para garantir que a suspensão possa passar facilmente por uma agulha de injeção ou infusão. Também é importante que quaisquer cristais residuais que não se dissolvam durante a reconstituição não excedam tamanhos críticos de partículas que possam causar efeitos colaterais adversos devido ao acúmulo capilar na vasculatura, minimizando geralmente quantidades significativas de partículas >15 µm. 

1. Escolha um solvente apropriado. Considerações comuns incluem quanto soluto pode ser dissolvido (solubilidade), quão prático é o manuseio do solvente (segurança) e como o solvente afetará a estabilidade e os estados de energia livre do peptídeo ou proteína.
2. Alcance a supersaturação. Aqueça a substância solúvel do fármaco peptídeo/proteína em solvente ou solução de buffer até a tolerância máxima permitida (geralmente limitada pela desnaturação). A solução se tornará supersaturada.
3. Cristalize o produto controlando os CPPs. Reduza a solubilidade por resfriamento, adição de anti-solvente, evaporação ou reação. À medida que a solubilidade é reduzida, um ponto é alcançado onde os cristais nucleiam e então crescem. Cristais de produto altamente puro devem crescer, embora motivos com alta energia livre possam formar estruturas alternativas ou não cristalinas; prevenir isso requer controle cuidadoso dos CPPs, se isso for mesmo prático.
4. Permita que o sistema alcance o equilíbrio. Isso é feito para maximizar o rendimento do sólido do produto farmacêutico.
5. Filtre e seque o produto purificado.

Existem vários métodos empregados para cultivar cristais de proteínas; entre os mais comuns estão a difusão de vapor e o microbatch. O primeiro método tem duas variações, descritas como gota pendurada e gota sentada, e ambos funcionam fundamentalmente da mesma maneira. Em um sistema selado, uma gota de solução que contém a proteína, solução de buffer e precipitante equilibra-se com um reservatório contendo concentrações maiores de soluto da mesma solução, mas sem a proteína. A água da gota contendo a proteína vaporiza e é atraída para a solução de maior concentração no reservatório. À medida que a concentração de solutos na gota aumenta, a proteína começa a cristalizar. No método microbatch, as proteínas e outros reagentes são introduzidos e contidos sob uma fina camada de óleo mineral que elimina a difusão da água. O microbatch é essencialmente um pequeno reator contendo todos os ingredientes necessários nas concentrações corretas e estáveis para permitir que a cristalização ocorra.

Como encontrar o conjunto correto de reagentes, parâmetros e condições necessários para cristalizar uma proteína é frequentemente empírico, o meio mais prático para a cristalização bem-sucedida de proteínas é usar uma gama variável de condições experimentais baseadas em experiências anteriores. A maneira mais fácil de fazer isso é usar kits comerciais de triagem de cristais de proteínas que contêm soluções pré-embaladas com buffers, precipitantes, etc., contidos em placas multi-poços. O método de difusão de vapor por gota pendurada é aplicado para cultivar cristais com esses kits. Quando é necessária uma triagem em grande escala, existem sistemas de alto rendimento disponíveis que automatizam o método microbatch, economizando tempo e tédio enquanto minimizam simultaneamente a quantidade de proteína purificada necessária. Para cristalizações de proteínas em grande escala exigidas para aplicações farmacêuticas ou industriais, as informações obtidas em experimentos de triagem formam a base para aplicação em sistemas automatizados de reatores em maior escala caracterizados por PAT em tempo real e in-situ. 

Em apoio ao desenvolvimento de processos e fabricação, um dos passos iniciais mais importantes para cristalizar proteínas com sucesso é garantir que haja um suprimento adequado de proteína altamente purificada e bem caracterizada disponível. Além de a proteína ser pura (ou seja, livre de contaminantes, como impurezas de matrizes de fermentação), a proteína deve ser homogênea e estável (ou estabilizada) em solução com:

• Agregação mínima (Figura A)
• Estrutura secundária, terciária e quaternária correta (Figura B)
• Quaisquer modificações conjugadas ou recombinantes (Figura C)

Além disso, todos os reagentes e solventes usados no processo de cristalização de proteínas precisam estar livres de contaminantes, pois estes podem ter efeito significativo na nucleação.

Semelhante à cristalização de pequenas moléculas, proteínas cristalizam a partir de soluções supersaturadas. Para pequenas moléculas que formam redes cristalinas robustas, manipular a temperatura é um meio primário para alcançar a supersaturação; isso também é útil para proteínas. No entanto, uma faixa de temperatura reduzida é permissível, pois cristais de proteínas tipicamente têm solvente como parte da estrutura cristalina, são frequentemente sensíveis à temperatura e propensos à desnaturação e agregação.

Pequenas moléculas têm significativamente menos graus de liberdade estereoscópica e cristalizam muito mais facilmente como resultado. Peptídeos de moléculas grandes têm muitas mais interações internas ácidas, básicas, polares, não polares e forças repulsivas que resistem à cristalização ordenada, fenômeno que é exacerbado para proteínas ainda maiores. A maioria dos peptídeos compatíveis com cristalização também contém um número significativo de ligações dissulfeto, que são cruciais para imobilizar motivos estruturais. A extensão da desordem intramolecular ou possível variação na estrutura é um atributo importante que determina se um peptídeo ou proteína poderia cristalizar em vez de precipitar. Mesmo que a molécula tenha atributos predispostos que sejam adequados para cristalização, há vários parâmetros de processo influentes que afetam a viabilidade comercial do processo e precisam ser caracterizados.

Além da temperatura, vários outros fatores que afetam/auxiliam a cristalização de proteínas via supersaturação incluem ajuste de pH e força iônica da solução, adição de sais e precipitantes como PEG para ajudar a reduzir a solubilidade da proteína, tipo de ligante presente, etc. A chave é supersaturar a solução dentro de um ambiente que não perturbe o caráter normal da proteína. Isso implica a importância de encontrar um conjunto de variáveis e condições que resultem em cristais com morfologia correta, pureza e taxas de crescimento aceitáveis.

A cristalização de proteínas ocorre através de uma série de mecanismos interdependentes:

1. Nucleação
2. Crescimento
3. Separação por óleo na Cristalização
4. Aglomeramento
5. Quebra
6. Inoculação
7. Química do Polimorfismo

Esses mecanismos, que muitas vezes são ocultos para os cientistas, desempenham um papel dominante na definição do resultado de um processo de cristalização.

O desenvolvimento e a ampliação da escala de cristalizações para terapêuticos baseados em proteínas requerem uma compreensão profunda das variáveis e condições que afetam o processo de cristalização. Como em outras cristalizações, alcançar a forma cristalina desejada, forma, tamanho das partículas e distribuição de tamanho requer controle cuidadoso para garantir qualidade consistente do produto. Qualquer variação nas CQAs das suspensões de cristais de proteínas afetará diretamente a eficácia terapêutica. Como os cristais de proteínas são altamente sensíveis ao ambiente de crescimento e podem ser facilmente danificados por temperatura excessiva, perda de solvente e outros estresses externos ou até mesmo pelo processo de amostragem, é desejável medir os CPPs e a qualidade do produto in situ, ou seja, sem remoção dos cristais do seu ambiente de solução.

• Os reatores químicos automatizados EasyMax e Optimax permitem controle preciso, ajuste e registro de parâmetros, incluindo temperatura, pH, condutividade, taxa de agitação e dosagem de buffers e excipientes, que são criticamente importantes para o desenvolvimento bem-sucedido e ampliação da escala de cristalizações de proteínas
• Ferramentas de tecnologia analítica in situ que auxiliam no monitoramento, solução de problemas e correção de desvios do processo também são úteis
  • Espectroscopia Raman in situ e Espectroscopia FTIR acompanham as concentrações de reagentes, monitoram o crescimento da estrutura cristalina e também medem a concentração de soluções supersaturadas
  • Tecnologia ParticleTrack (com FBRM) monitora em tempo real o tamanho e a distribuição do tamanho dos cristais conforme segmentos chave do processo de cristalização avançam
  • EasyViewer permite a visualização e análise de imagens do processo de cristalização conforme ele progride

Quando reatores laboratoriais automatizados são usados em associação com analisadores in situ em tempo real, o impacto dos parâmetros do processo em mecanismos de cristalização como agregação, crescimento, aglomeração, quebra e alteração de forma pode ser identificado. O controle preciso do processo de cristalização em associação com monitoramento contínuo e in situ do progresso da formação dos cristais permite que a otimização e ampliação da escala sejam baseadas em fatos e orientadas por dados.

O reator laboratorial automatizado EasyMax é uma estação de trabalho completa para otimização de parâmetros na cristalização de proteínas para apoiar o desenvolvimento e a execução do design de ampliação da escala. Este sistema totalmente automatizado permite controle preciso sobre os parâmetros do processo.

• Gerencie CPPs incluindo taxas de dosagem, temperatura, agitação, pH e condutividade
• Integra-se facilmente com análises in situ para cristalização incluindo ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FFE), e EasyViewer (análise de imagem in situ)
• O software iC permite a execução automatizada e controle de todos os experimentos e equipamentos periféricos, bem como captura completa de dados e manutenção de registros

ReactIR utiliza espectroscopia no infravermelho médio para medir a fase da solução em estudos de cristalização. As medições do ReactIR não são afetadas por sólidos suspensos, bolhas ou outras massas particuladas.

• Acompanhe solutos individuais da cristalização in situ e em tempo real.
• Meça concentrações da solução em suporte a estudos de supersaturação
• Forneça análises de dados acionáveis para tomada de decisão e controle em tempo real

ReactRaman utiliza espectroscopia Raman para fornecer análise molecular de partículas em solução

• Acompanhe o crescimento, estrutura e morfologia dos cristais de forma não destrutiva, in situ e em tempo real
• Determine os efeitos dos parâmetros e otimize as condições e variáveis de cristalização para atingir os objetivos de qualidade

ParticleTrack utiliza a tecnologia Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) e é um instrumento óptico baseado em sonda que é inserido diretamente em um recipiente para monitorar em tempo real a variação do tamanho e da contagem de partículas. ParticleTrack utiliza medições da Distribuição do Comprimento do Corda para obter a Distribuição do Tamanho dos Cristais (CSD).

• Cristais de proteínas são monitorados continuamente, conforme as condições experimentais são alteradas
• Acompanhe o crescimento em lote ou contínuo durante a cristalização em tempo real sem necessidade de remoção da amostra
• Caracterize condições que afetam nucleação, agregação, polimorfismo e outros atributos do sistema

EasyViewer é um instrumento baseado em sonda que é inserido diretamente em um recipiente para capturar imagens de sistemas de partículas. EasyViewer realiza análise de imagens e mede a contagem de partículas, distribuição de tamanho e morfologia a partir de imagens em linha e com resolução temporal do processo, permitindo que as populações sejam monitoradas ao longo do tempo.

• Cristais de proteínas são monitorados continuamente, conforme as condições experimentais são alteradas
• Acompanhe o crescimento em lote ou contínuo durante a cristalização em tempo real sem necessidade de remoção da amostra
• Visualize parâmetros de cristalização que afetam nucleação, agregação, polimorfismo e outros atributos do sistema em tempo real

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitoramento em Tempo Real da Cristalização Biofarmacêutica: Distribuição do Comprimento do Corda para Distribuição do Tamanho do Cristal para Lisozima, rHu Insulina e Vitamina B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Os autores relataram sucesso no desenvolvimento de uma abordagem eficiente para o monitoramento em tempo real de cristalizações biofarmacêuticas. Este procedimento utiliza ParticleTrack para medir a CLD para uma série de moléculas biofarmacêuticas sob condições estáticas e dinâmicas, e então aplica modelagem matemática para converter a CLD em CSD. As biomoléculas investigadas possuem diferentes formas cristalinas, que dependem das condições experimentais da cristalização. A lisozima pode produzir cristais tetragonais e em forma de agulha, a insulina rHu forma cristais romboédricos e a B12 forma cristais poliédricos.

Os autores desenvolveram modelos para determinar a CSD para cristais tetragonais de baixa razão de aspecto, cristais romboédricos, poliédricos e cristais em forma de agulha de alta razão de aspecto. Os autores usaram três modelos diferentes para determinar a distribuição do tamanho dos cristais:

• Um modelo desenvolvido por outro grupo de pesquisa que assumia que os cristais poderiam ser representados como esferas (diâmetro equivalente esférico, SED) foi eficaz para os cristais de baixa razão de aspecto
• Para cristais de alta razão de aspecto, os autores deste estudo desenvolveram um modelo baseado na largura
• Por fim, desenvolveram um modelo baseado no comprimento que requer a especificação da razão de aspecto

Os resultados dos modelos desenvolvidos para calcular a CSD a partir das medições FBRM foram então comparados às medições de CSD obtidas por análise de imagem.

Tentar monitorar uma suspensão opaca de cristais apresenta desafios, especialmente quando as especificações de fabricação exigem uma distribuição estreita do tamanho das partículas (PSD). Para formulações de cristais de proteínas injetáveis, o PSD pode influenciar significativamente a viscosidade, além de servir como um alerta precoce para agregação ou outros eventos de degradação que podem comprometer a formulação. O monitoramento in-situ foi utilizado em um estudo de cristalização em lote para escala para caracterizar a formação e crescimento dos cristais do hormônio do crescimento humano (hGH). A análise em tempo real detectou uma desvio do perfil usual de PSD causado por diferenças na mistura entre os recipientes. Isso foi confirmado por análise de imagem offline subsequente (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Processos de Cristalização Contínua na Fabricação Farmacêutica: Uma Revisão. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Estimativa de Parâmetros da Cinética Estocástica de Nucleação Primária por Integrais Estocásticas Usando Medições de Reflectância com Feixe Focalizado. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitoramento em Tempo Real da Cristalização Biofarmacêutica: Distribuição do Comprimento do Corda para Distribuição do Tamanho do Cristal para Lisozima, rHu Insulina e Vitamina B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulação da cristalização em lisozima e autoarranjo supramolecular em solução usando líquidos iônicos. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modelagem e controle da forma do cristal na cristalização contínua de proteínas. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Aumentando a Taxa de Produção de Cristais e Reduzindo a Polidispersidade na Cristalização Contínua de Proteínas. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Cristais de proteínas para a entrega de biofarmacêuticos. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301