De basis van UV/VIS spectroscopie waaronder kleurschalen, grondbeginselen, instrumentatie en kalibratie.
Beschrijf hier uw project. Bel ons voor een offerte /content/nl/nl/home/applications/Application_Browse_Laboratory_Analytics/uv-vis-spectroscopy/uvvis-spectroscopy-explained.fb.1.c.11.html
UV/VIS spectroscopie is een wetenschappelijke techniek die wordt gebruikt om de hoeveelheid licht te meten die door een monster bij verschillende golflengten van ultraviolet (UV) en zichtbaar (VIS) licht wordt geabsorbeerd of doorgelaten.
Hierbij wordt een bundel UV/VIS-licht door het monster geschenen en wordt de hoeveelheid licht gemeten die erdoorheen gaat. Door het absorptie- en transmissiepatroon van licht te analyseren, kunnen wetenschappers de componenten van het monster identificeren en kwantificeren.
Er bestaat een unieke relatie tussen de stof en zijn UV/VIS spectrum wanneer een stof het maximale licht absorbeert bij een specifieke golflengte. Deze relatie kan gebruikt worden voor:
Kwalitatieve analyse: het bepalen van de aanwezigheid van bepaalde stoffen.
Kwantitatieve analyse: het bepalen van de hoeveelheden van bepaalde stoffen.
UV/VIS spectrofotometrie wordt algemeen gebruikt in vele takken van de wetenschap, waaronder chemie, biologie en natuurkunde, om de eigenschappen van materialen en hun interactie met licht te bestuderen. Het wordt ook veel gebruikt in de industrie voor kwaliteitscontrole en analyse van materialen zoals medicijnen, voedsel en cosmetica.
Deze pagina geeft u essentiële kennis over UV/VIS spectroscopie en toepassingen.
In de volgende hoofdstukken vindt u antwoorden op uw vragen over de grondbeginselen en toepassingen van UV/VIS:
UV/VIS spectroscopie is een soort absorptiespectroscopie waarbij een monster wordt belicht met elektromagnetische stralen van verschillende golflengten in het ultraviolette (UV) en zichtbare (VIS) bereik. Afhankelijk van de stof worden de UV- of zichtbare lichtstralen gedeeltelijk door het monster geabsorbeerd. Het resterende licht, oftewel het doorgelaten licht, wordt door een geschikte detector geregistreerd als functie van de golflengte. De detector produceert dan het unieke UV/VIS spectrum van het monster (ook bekend als het absorptiespectrum).
Om meer te weten te komen over de basisprincipes van UV/VIS spectroscopie, kunt u de METTLER TOLEDO UV/VIS informatiegids "Spectrofotometry Applications and Fundamentals" downloaden.
Wanneer licht een voorwerp raakt, kan het door het voorwerp worden geabsorbeerd, meestal omdat de golflengte van het geabsorbeerde licht overeenkomt met een elektronische excitatie in het voorwerp. Het resterende licht wordt doorgelaten, dus dat gaat door het object heen.
In een spectrofotometer wordt de transmissie gemeten door het intensiteitsspectrum van licht dat door een monster wordt doorgelaten (I) te delen door het intensiteitsspectrum van licht dat door de blanco wordt doorgelaten (I0).
Absorbantie/transmissie converter
=
Absorbantie (A), ook wel optische dichtheid (OD) genoemd, is de hoeveelheid licht die door het object wordt geabsorbeerd en kan als volgt worden uitgedrukt:
Transmissien of doorlatingsfactor (T)
Download voor meer fundamentele kennis over UV/VIS spectroscopie technieken de informatiegids "Spectrofotometrie toepassingen en grondbeginselen".
Wat is de Wet van Beer-Lambert?
De Wet van Beer-Lambert stelt dat de hoeveelheid energie die door een oplossing wordt geabsorbeerd evenredig is met de weglengte en de concentratie. Eenvoudig gezegd absorbeert een meer geconcentreerde oplossing meer licht dan een verdunde oplossing.
De wiskundige formulering van de wet van Beer is:
A = ϵ.d.c
Waarbij ϵ = molaire absorptiviteit, d = weglengte en c = concentratie. Molaire absorptiviteit is een unieke fysische constante van het monster die betrekking heeft op het vermogen van het monster om licht bij een bepaalde golflengte te absorberen. ϵ heeft de eenheid L-mol-1-cm-1.
Om meer te weten te komen over de basis van UV/VIS spectroscopie, kunt u de onze UV/VIS informatiegids, "Spectrophotometry Applications and Fundamentals" downloaden:
Wat is het verschil tussen scanning- en array-spectrofotometers?
Een UV/VIS spectrofotometer is een instrument dat is ontworpen om de absorptie in het UV-VIS gebied te meten met behulp van de wet van Beer-Lambert. Het meet de intensiteit van het licht dat door een monsteroplossing in een cuvet gaat en vergelijkt dit met de intensiteit van het licht voordat het door het monster gaat.
De belangrijkste onderdelen van een UV/VIS spectrofotometer zijn een lichtbron, een monsterhouder, een diffuseerapparaat om de verschillende golflengten van het licht te scheiden, en een geschikte detector.
De werking van scanning spectrofotometers in een schema
Conventionele scanning spectrofotometers werken volgens het principe van opeenvolgende transmissiemetingen bij elke gedefinieerde golflengte. Het licht wordt door een diffractierooster opgesplitst in verschillende golflengten. Een monsterkuvet wordt tussen het diffractierooster en de detector geplaatst.
De werking van array spectrofotometers in een schema
In een array spectrofotometer wordt het monster verlicht door een continuüm, d.w.z. alle spectrale lichtcomponenten tegelijk, waardoor het licht van verschillende golflengten tegelijkertijd wordt geabsorbeerd. Het doorgelaten licht wordt vervolgens door een reflectierooster gebroken. Met deze instrumenten kan het UV/VIS spectrum sneller worden verkregen dan met een traditionele scanning spectrofotometer.
In tegenstelling tot een scanning spectrofotometer heeft een array spectrofotometer geen bewegende delen.
Download "Array versus scanning" voor meer informatie. Het whitepaper vergelijkt de twee veelvoorkomende UV/VIS spectrofotometeropstellingen en beoordeelt hun prestaties en voordelen.
Een spectrofotometrie-instrument moet volgens de specificaties presteren voor kritische UV/VIS-metingen, vooral bij klinische, farmaceutische of industriële kwaliteitscontrole. Een regelmatige controle van de prestaties is daarom essentieel. Kalibratieresultaten moeten daarnaast worden geregistreerd en opgeslagen.
Download het whitepaper voor inzicht in het belang van kalibratie met betrekking tot UV/VIS hoofdstukherzieningen in de Ph. Eur. 10 en USP42 NF37.
Belangrijke parameters die moeten worden gekalibreerd voor een UV/VIS spectrofotometer
De belangrijkste parameters die voor een UV/VIS spectrofotometer moeten worden gekalibreerd, staan in de volgende tabel:
Prestatietest
Gecertificeerd referentiemateriaal (CRM)
Testparameters instrument
Acceptatiecriteria
USP 42 NF 37
Ph. Eur. 10
Golflengtenauwkeurigheid &
herhaalbaarheid
Ho(ClO4)3: 4% Ho2O3 in 10% v/v HClO4
Blanco: Lucht
14 golflengten
(240 nm - 650 nm)
Xe: 2 golflengten (260,6, 528,6 nm)
UV (200 - 400 nm): ± 1 nm
Vis (400 - 780 nm): ± 2 nm
(S.D.) < 0,5 nm
UV (< 400 nm):
± 1 nm
Zicht (> 400 nm):
± 3 nm
Fotometrische
nauwkeurigheid &
herhaalbaarheid**
K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4
Blanco: 0,001 M HClO4
60 mg/L
0 A - 2 A,
235, 257, 313, 350 nm
Voor extinctie ≤ 1A
Nauwkeurigheid: ± 0,010A
Herhaalbaarheid:
S.D. ≤ 0.005 A
Voor extinctie > 1A
Nauwkeurigheid: ± 1%
Herhaalbaarheid:
S.D. ≤ 0.5%
Nauwkeurigheid: ± 0,010 A of ± 1% (de grootste waarde is van toepassing)
Nicotinezuur in
0,1 M HCl
Blanco: 0,1 M HCl
12 mg/L
0,26 A - 1,6 A
213, 261 nm
Fotometrische lineariteit
K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4
Blanco: 0,001 M HClO4
6 - 200 mg/L, tot 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Alle gemeten filters voldoen aan de acceptatiecriteria voor fotometrische nauwkeurigheid
R2> 0,999
Nicotinezuur in
0,1 M HCl
Blanco: 0,1 M HCl
6 - 60 mg/L, tot 2,5 A
213, 261 nm
Strooilicht volgens procedure A
(SFRM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
10 mm padlengte
Blanco: 1,2% w/v KCl/H2O, weglengte 5 mm
Amax bij 198 nm
≥ 0.7 A
(NA)
Strooilicht volgens procedure B (SWM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
10 mm padlengte
Blanco: H2O, padlengte 10 mm
Amax bij 198 nm
≥ 2.0 A
≥ 2.0 A
Resolutie
0,02 % v/v tolueen in n-hexaan
Blanco: n-hexaan/
n-heptaan (Ph. Eur. 10)
Amax,269/Amin,267
>1.3
De niveaus worden vermeld in de desbetreffende monografie
** Geen specificatie van fotometrische herhaalbaarheid (precisie) in Ph. Eur.
S.D. - Standaardafwijking
3. De wetenschap van kleuren
Grondbeginselen van kleurmetingen
Kleuren maken onze wereld interessanter. Wanneer we een voorwerp zien, komt het licht dat door het voorwerp gereflecteerd wordt onze ogen binnen en wordt het opgevangen door verschillende soorten fotoreceptoren in het netvlies. Afhankelijk van de gevoeligheid ervan kunnen verschillende mensen dezelfde kleur verschillend waarnemen.
Om de nauwkeurigheid van een specifieke kleur universeel te accepteren, moeten numerieke waarden worden toegekend. Kortom, meetapparatuur zoals spectrofotometers en colorimeters leveren kleurresultaten als waarden om de nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van kleurbepalingen te garanderen.
Spectrofotometers kwantificeren kleurgegevens door golflengten die door een monster worden uitgezonden te verzamelen en te filteren. Een wiskundige vergelijking wordt toegepast op de spectrale gegevens om de kleur in kaart te brengen op een kleurschaal.
Een CIE (Commission internationale de l'éclairage) kleurenschaal wordt gedefinieerd aan de hand van drie parameters: tint, chroma en lichtheid:
Tint is de dominante kleur van een object. Primaire en secundaire kleuren vormen samen de kleurtoon.
Chroma, ook wel bekend als verzadiging, beschrijft hoe levendig of dof een kleur is.
Lichtheid is de lichtintensiteit van de kleur (of deze donker of licht is).
Elk CIE-kleurensysteem gebruikt drie coördinaten om een kleur op een schaal te plaatsen. De drie primaire kleurschalen zijn Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* en CIE L*u*v*.
Wanneer een kleur bijvoorbeeld wordt uitgedrukt in CIE L*a*b*:
L* definieert de lichtheid
a* geeft de rood/groen-waarde aan
b* staat voor de geel/blauwe waarde
Op basis van de CIE L*a*b* kleurenschaal, zouden de coördinaten voor het rood van de afgebeelde roos zijn:
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23
Download de informatiegids voor meer informatie over de basisprincipes van kleurmeting:
Het bieden van een algehele succesvolle visuele ervaring voor consumenten kan de koopbeslissing beïnvloeden. Daarom is kleur belangrijk bij het definiëren van merkidentiteit en productconsistentie.
Er zijn verschillende kleurschalen vastgesteld om een uniek product te definiëren volgens industriële normen. Deze schalen omvatten:
Kleurschaal
Standaard
Toepassingen
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Om te bepalen of brandstof (kerosine, benzine, diesel, nafta, enz.) verontreinigd is of tijdens opslag is afgebroken.
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Geelheids-index die wordt gebruikt als meetwaarde voor zuiverheidscontroles in de water-, chemische, olie- en kunststofindustrie.
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Voor het testen van producten zoals harsen, vetzuren, vernissen en drogende oliën die door verhitting een kleur hebben gekregen.
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Kwaliteitscontrole voor de smaak- en geurstoffenindustrie en de voedingsmiddelen- en drankenindustrie.
Voor het meten van kleurintensiteit en troebelheid (waas) in EBC-eenheden van onder andere bier, mout en karamel.
USP/EUP
USP-24 Monografie 631, EP-methode 2.2.2
Kwaliteitscontrole van geneesmiddelen.
Hess-Ives
DGK testmethode F 050.2
Gebruikt om chemicaliën en oppervlakte-actieve vloeistoffen te testen (voornamelijk in de cosmetica-industrie).
4. Microvolume-analyse met behulp van een UV/VIS spectrofotometer
Hoe analyseert u microvolumes met UV/VIS-spectroscopie?
Een spectrofotometer voor microvolumes meet monstervolumes zo klein als 1 µl. De concentratie nucleïnezuren in een monster is meestal van de orde van nano- of microgram per milliliter.
Het verdunnen van dergelijke microvolumes en het verkrijgen van nauwkeurige resultaten is een uitdaging. Daarom wordt micro-analyse zonder verdunning belangrijk voor downstream-analyse van nucleïnezuren.
Tijdens de analyse van nucleïnezuren wordt het microvolume monster in het compartiment op het voetstuk gepipetteerd. De lichtstraal van de lichtbron wordt door de glasvezel naar het microvolume platform geleid. Aangezien de weglengte tot de orde van een millimeter wordt gereduceerd, kunnen hogere concentraties van de analyt nauwkeurig worden geanalyseerd zonder meerdere verdunningen.
Een microvolumesysteem maakt gebruik van glasvezeltechnologie samen met de inherente eigenschappen van het monster (zoals oppervlaktespanning) om het monster op het voetstukplatform te houden en de real-time absorptie van de monsters bij lage volumes te bepalen.
Door deze voordelen is microvolume-analyse een ideale keuze voor biomoleculaire analyse.
Neem deel aan het on-demand webinar "Maximaliseer de nauwkeurigheid van de workflow door middel van Good UV/VIS Practices bij nucleïnezuuranalyses" voor tips en tricks over microvolume-analyse.
Kwaliteitscontrole van nucleïnezuren Kwantificering van nucleïnezuren is een essentiële pre-analytische methode voor het verkrijgen van nauwkeurige en betrouwbare resultaten in veel moleculair biologische assays, zoals Next-Generation Sequencing (NGS), Polymerase Chain Reaction (PCR), Real-Time PCR (kwantitatieve PCR; qPCR), klonen en transfectie.
Kwalitatieve en kwantitatieve controle van nucleïnezuren kan worden uitgevoerd door de zuiverheid en de concentratie van nucleïnezuren te bepalen.
DNA-analysemethoden A260 geeft de correlatie van de concentratie nucleotiden en A280 geeft die van de resterende eiwitten. De aminozuren tyrosine en tryptofaan absorberen bij 280 nm en fenylalanine absorbeert goed bij 260 nm. Dit maakt het mogelijk om de verhouding A260/A280 voor DNA-zuiverheid te berekenen met directe absorptiemetingen. DNA van goede kwaliteit zal een verhouding A260/A280 van 1,7-2,0 hebben.
Eiwitkwantificatietests Verschillende methoden voor het kwantificeren van het totale eiwitgehalte omvatten A280, Bicinchoninezuur (BCA), Bradford, Lowry, Pierce en andere nieuwe assays. Eiwitten in oplossingen hebben maxima bij 280 nm door aminozuren met aromatische verbindingen en minima rond 220 nm door de aanwezigheid van peptidebindingen.
De concentratie wordt berekend met de Warburg-formule:
Eiwitconcentratie (mg/ml) = 1,55 X (A280 aflezing) - 0,76 X (A260 aflezing)
Om meer te weten te komen over DNA-analyse met UV-VIS spectroscopie, kunt u de informatiegids "260/280 Ratio: Indicator van eiwitverontreiniging" downloaden:
Wat zijn de meest voorkomende fouten bij UV/VIS kalibratie en metingen?
Een goede nauwkeurigheid en precisie bij UV/VIS-metingen kan worden bereikt door voorzorgsmaatregelen te nemen om fouten te vermijden. Typische foutenrisico's waarmee rekening moet worden gehouden bij UV/VIS-metingen zijn onder andere:
Spectrale kenmerken. Spectrale karakterisering wordt uitgevoerd tijdens het kalibratieproces. Belangrijke factoren die tot foutieve resultaten kunnen leiden, zijn de nauwkeurigheid van de golflengte, de spectrale bandbreedte, strooilicht en lineariteit.
Fotometrische kenmerken. Fotometrische kenmerken omvatten de spectrale gevoeligheid van de lichtbron, de temperatuurafhankelijke gevoeligheid van onder andere de lichtbron en detector.
Optische interacties. De straling van de lichtbron kan interageren met het materiaal van de cuvet, waardoor de intensiteit van de absorptie van het monster verandert. Dergelijke optische interacties kunnen vermeden worden door het juiste cuvettemateriaal te kiezen.
Overige factoren. Andere factoren zoals temperatuur, schommelingen in de lijnspanning, trillingen, verontreiniging of verwarming van het monster door de fotometer hebben ook een negatieve invloed op de metingen.
GUVP™ - Good UV/VIS Practices
Hoewel niet alle fouten vermeden kunnen worden, kunnen deze wel geminimaliseerd worden voor betere resultaten.
Download de brochure over Good UV/VIS Practices: "Betrouwbare resultaten voor UV/VIS spectroscopie".
Het kiezen van de juiste cuvet houdt in dat u het juiste materiaal en de juiste grootte kiest op basis van uw monster en instrumentatie.
Het materiaal van de cuvet moet voldoende transmissie hebben bij een bepaalde golflengte. Lichtverzwakking op de wanden van de cuvet mag het resultaat van een analyse niet beïnvloeden. Glazen cuvetten worden niet gebruikt in het UV-gebied voor analyses onder 370 nm omdat ze de straling absorberen. Het wordt aanbevolen om ze alleen in het zichtbare gebied te gebruiken.
De onderstaande tabel geeft de bruikbare transmissiebereiken van cuvetten:
Materiaal
Theoretisch transmissiebereik (nm)
Ver UV-kwarts
170-2700
Optisch glas
320-2500
Nabij IR-kwarts
220-3800
UV-siliciumdioxide
220-2500
UV kunststof
220-900
PS-cel voor eenmalig gebruik
340-750
Wegwerp PMMA-cel
285-750
De grootte van de cuvetten heeft ook invloed op de meetmogelijkheden. De nominale stralingsweglengte van de cuvette is 10 mm. Afhankelijk van de monsters kan de lengte variëren van 1 mm tot 100 mm.
Standaardcuvetten kunnen voor de meeste onderzochte monsters gebruikt worden. Gangbare absorptie- en fluorescentiecuvetten hebben een externe basis van 12,5 mm x 12,5 mm, een hoogte van 45 mm en interne afmetingen van 10 mm x 10 mm.
Cuvetten met een lange weglengte (van meer dan 10 mm) worden gebruikt wanneer het monster te verdund is of wanneer het monster verdampt of een chemische verandering ondergaat tijdens het meetproces.
Cuvetten met een korte weglengte (van minder dan 10 mm) worden gebruikt wanneer de absorptie hoog is en verdunning moeilijk is.
Hoe werkt u met cuvetten op de juiste manier?
Bij het werken met cuvetten moet u deze altijd aan de matte zijden vasthouden. Raak de transparante optische oppervlakken niet met uw vingers aan, omdat vingerafdrukken een aanzienlijke absorptie kunnen veroorzaken en zo de nauwkeurigheid kunnen beïnvloeden.
Vermijd het gebruik van glazen pasteurpipetten om de cuvette te vullen, aangezien deze krassen op het optische oppervlak kunnen maken en zo verdere interferentie kunnen veroorzaken. Pipetten met plastic pipetpunten voor eenmalig gebruik worden aanbevolen.
De reinheid van cuvetten heeft een groot effect op de resultaten, dus we moeten dit als een zeer belangrijke factor beschouwen.
De volgende stappen worden aanbevolen voor het grondig reinigen van kwarts-cuvetten:
Week de cuvetten in de reinigingsoplossing.
Verwijder de reinigingsoplossing en spoel de cuvetten met gedeïoniseerd water.
Was de cuvetten met ethanol of aceton, behalve in het geval van proteïnen (zie onderstaande tabel).
Droog de cuvetten door ze af te vegen met een pluisvrije tissue, gevolgd door drogen aan de lucht of drogen in de oven.
De onderstaande tabel geeft de bruikbare transmissiebereiken van cuvetten.
Waterige oplossingen
Organische moleculen
Moeilijk te verwijderen deeltjes
Eiwitten
Zware metalen
Vetzuren
Reinigingsoplossingen
Gelijke volumedelen van 3 M HCl en ethanol
Wassen met 50% salpeterzuur
Geconcentreerd HNO3 of 2 M HCl
Gelijke volumedelen ethanol en 3 M HCl
Incubeer bij kamertemperatuur met trypsine
(Ethanol en aceton worden niet aanbevolen voor reiniging)
Gelijke volumedelen zwavelzuur 2 M en 50% gedeïoniseerd water
Aqua regia
Gelijke volumedelen IPA en gedeïoniseerd water
Inweektijd*
10 minuten
10 minuten
30 seconden
Overnachting
20 minuten
Veeg af
*De inweektijd in de tabel is een ruwe schatting; het wordt echter alleen aanbevolen om cuvetten te laten weken totdat vlekken/verontreinigingen verwijderd zijn.
Glazen cuvetten kunnen gereinigd worden door de cuvetten met aceton of ethanol te spoelen, gevolgd door spoelen met water. Drogen aan de lucht wordt aanbevolen.
Kunststof cuvetten kunnen meerdere keren met gedeïoniseerd water gewassen worden. Het wassen van plastic cuvetten met chemicaliën wordt afgeraden.
Download onze verzameling posters met tips en tricks om uw labinstrumenten schoon te houden
Best practices voor het gebruik van microvolume spectrofotometers
Het monster voorbereiden De gevoeligheid van het instrument kan laag zijn voor verdunde concentraties van biologische monsters. Om de gevoeligheid van dergelijke monsters te verhogen, kunt u overwegen om een hogere concentratie van het monster te nemen. Voor microvolumemetingen is meestal 1-2 µl monstervolume nodig. Gebruik gekalibreerde pipetten voor het nemen van het monster. Zorg voor een bereiding en monstername van een homogeen monster.
Reinig het microvolume-platform Zorg ervoor dat het oppervlak van het microvolume voetstuk en de spiegel goed schoongemaakt worden. Veeg de oppervlakken gewoon af met een pluisvrije doek met gedeïoniseerd water. Als u een bufferoplossing, detergenten of een kleverig monster gebruikt, reinig het oppervlak dan meerdere keren voordat u verder gaat met het volgende monster.
Plaats het monster op het platform Plaats het monster langzaam en gelijkmatig op het oppervlak om luchtbelvorming te voorkomen.
Werk binnen de detectielimieten Ken de laagste en hoogste detectielimiet van het instrument en werk binnen dat bereik.
Algemene praktijken voor nauwkeurige UV/VIS-metingen
Wees voorzichtig bij de monstervoorbereiding en het pipetteren in een cuvet of op een microvolume platform. Het monster moet homogeen zijn.
Als er zwevende vaste deeltjes in het monster aanwezig zijn, kan het licht verstrooid worden. Filter het monster in dat geval met een spuitfilter.
Vul het monster in een cuvet rekening houdend met de z-dimensie van de monsterhouder. Dit zorgt ervoor dat het licht door het monster gaat. De z-dimensie is de afstand van de bodem van een cuvet tot de hoogte waarop de lichtstraal door het monster gaat.
Maak de cuvet voor elke meting schoon met een pluisvrije tissue. Gebruik elke keer een nieuwe tissue.
Gebruik hetzelfde oplosmiddel/oplosbuffer als bij de monstervoorbereiding als blanco.
6. Wat zijn de UV/VIS spectroscopie toepassingen binnen verschillende industrieën?
UV/VIS spectroscopie is een veelzijdige analysetechniek met een groot aantal toepassingen in verschillende industrieën. Een aantal van de belangrijkste UV/VIS toepassingen zijn:
Voeding & dranken
UV/VIS spectroscopie bepaalt de kwaliteit en samenstelling van voedingsmiddelen en dranken. Het kan gebruikt worden om de kleur (bijv. wijn), smaak en het aroma van voedingsmiddelen te analyseren en om de aanwezigheid van verontreinigingen of versnijdingsmiddelen te detecteren.
Farmaceutisch
UV-spectroscopie analyseert de zuiverheid, concentratie en identiteit van geneesmiddelen en andere farmaceutische producten. Het wordt ook gebruikt om de stabiliteit van geneesmiddelen in de loop van de tijd te controleren.
Cosmetica
Evaluatie van fotostabiliteit van middelen voor formules, deeltjeskarakterisering van UV-blokkerende middelen, beoordeling van de kleurindex, opsporen van vervalsing (parfumindustrie), studie van optische eigenschappen, kwantificering van kleurstoffen, antioxidanten en meer.
Petrochemisch
Karakterisering van ruwe olie, berekening van asfalteenfracties, formulering van indices voor aromaatgehalte, kwaliteit van de zwaartekracht van ruwe olie, zwavelgehalte, berekening van Hildebrand-oplosbaarheidsfactor. (Uitgebreid tot bitumen, zware oliën en schalieoliën en oliën uit vloeibaar katalytisch kraken, coking of kolenliquefactie)
Chemisch
Bepaling van chemische eigenschappen, eindkwaliteitsbeoordeling van eindproduct, studie van polymeer samenstelling, kwalificatie van afvalwater, bepaling van zuiverheid & verfefficiëntie, fotokatalytische afbraak van polymeren/kleurstoffen, residuen van pesticiden in water of de bodem.
Biotechnologie
Concentratie en zuiverheid van nucleïnezuur, eiwitten (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), microbiële celkweekmetingen, denaturatie van eiwitten, kinetische studies (enzymatische activiteit), biologische monsters zoals bloed, plasma, serum en meer.
METTLER TOLEDO biedt een breed scala aan gevalideerde applicatiemethoden. Vind de toepassing die het beste bij uw behoeften past via onze online zoekmachine.
De verschillende spectroscopische technieken worden voornamelijk onderscheiden door de straling die ze gebruiken, de interactie tussen de energie en het materiaal, het type materiaal en de toepassingen waarvoor ze gebruikt worden. De technieken die vaak gebruikt worden voor chemische analyse zijn atoomspectroscopie, ultraviolet en zichtbaar spectroscopie (UV-spectroscopie), infraroodspectroscopie, Raman spectroscopie en kernspinresonantie.
Type spectroscopie
Type straling
Interacties
Golflengte
ϒ-straling spectroscopie
ϒ-straling
Atoomkernen
< 0,1 nm
X-ray fluorescentie spectroscopie
X-straling
Elektronen in de binnenste schil
0,01 - 2,0 nm
Vacuüm UV-spectroscopie
Ultraviolet (UV)
Ionisatie
2.0 - 200 nm
UV/VIS spectroscopie
UV/VIS
Valance elektronen
200 - 800 nm
Infrarood- en Raman-spectroscopie
Infrarood
Moleculaire trillingen
0,8 - 300 mm
Microgolf spectroscopie
Microgolven
Moleculaire rotaties
1 mm tot 30 cm
Elektron-spinresonantiespectroscopie
Elektronspin
Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie
Radiogolven
Kernspin
0.6 - 10 m
Wat zijn de verschillende moleculaire interacties in het UV-gebied?
De absorptie van UV-licht resulteert in elektronische overgangen van lagere energieniveaus naar hogere energieniveaus. Absorptie van ultraviolette straling in organische moleculen is beperkt tot bepaalde functionele groepen (chromoforen) die valentie-elektronen van lage excitatie-energie bevatten. De moleculaire overgangen en interacties die plaatsvinden als gevolg van UV-absorptie zijn:
π- π* (pi naar pi ster overgang) - binding naar anti-binding orbitaal
n - π* (n naar pi ster overgang) - niet-bindende naar anti-bindende orbitaal
Deze overgangen hebben een onverzadigde groep in het molecuul nodig om de π elektronen te leveren.
σ (binding) naar σ* (anti-binding) overgangen vereisen een hogere energie en kunnen daarom niet worden gedetecteerd met UV/VIS spectroscopie.
Welke invloed hebben functionele groepen op het spectrum?
Neem een functionele groep die atomen bevat met één of meer eenzame elektronenparen die geen ultraviolette/zichtbare straling absorberen. Wanneer deze functionele groep echter aan een chromofoor wordt gekoppeld, verandert de intensiteit en golflengte van de absorptie. Dit fenomeen wordt een auxochroom of een kleurversterkende groep genoemd.
De aanwezigheid van een auxochroom veroorzaakt een positieverschuiving van een piek of signaal naar een langere golflengte, wat een bathochrome of roodverschuiving wordt genoemd. De functionele groepen die bijdragen aan bathochrome groepen zijn substituenten zoals methyl-, hydroxyl-, alkoxy-, halogeen- en aminogroepen.
Het auxochroom dat een positieverschuiving van een piek of signaal naar een kortere golflengte veroorzaakt, wordt hypsochroom of blauwverschuiving genoemd. Eigenlijk gedraagt de combinatie van chromofoor en auxochroom zich als een nieuwe chromofoor met een ander absorptiemaximum (λmax). Benzeen vertoont bijvoorbeeld λmax bij 256 nm, terwijl aniline λmax vertoont bij 280 nm. De NH2 groep werkt dus als een auxochroom en veroorzaakt de verschuiving van λmax naar een grotere waarde.
Wat is het verschil tussen spectrale bandbreedte en resolutie in UV/VIS spectroscopie?
De spectrale bandbreedte (SBW) van een spectrofotometer houdt verband met de fysieke spleetbreedte en optische dispersie van het monochromatorsysteem. Resolutie is het vermogen van een instrument om licht te scheiden in eindige, afzonderlijke golflengtegebieden en om elk eindig gebied te onderscheiden. Spectrale bandbreedte wordt meestal gebruikt voor scanninginstrumenten, terwijl resolutie meestal wordt gebruikt voor array-instrumenten.
Voor de meeste kwantitatieve doeleinden van de farmacopeia is een spectrale bandbreedte van minder dan 2 nm voldoende en het acceptatiecriterium voor de verhouding is 1,3. Spectrale resolutie kan worden gebruikt ter vergelijking met spectrale bandbreedte.
De tabel toont de resolutie van METTLER TOLEDO's UV/VIS Excellence spectrofotometers, die wordt gemeten met tolueen in hexaan, en de equivalente SBW:
Instrument
Spectrale resolutie
Equivalente SBW (nm)
UV5
> 1.5
< 2.0
UV5Bio
> 1.5
< 2.0
UV5Nano
> 1.7
< 1.5
UV7
> 1.9
≤ 1.0
Wat zijn de verschillende lichtbronnen die in een UV/VIS spectrofotometer gebruikt worden?
De beste lichtbron is een lichtbron die een goede intensiteit met weinig ruis biedt voor alle ultraviolette en zichtbare golflengten en die gedurende lange tijd stabiel blijft. Er zijn verschillende lichtbronnen die gewoonlijk gebruikt worden, zoals hieronder vermeld:
Lichtbron
Golflengtebereik
(nm)
Gebied
Levensduur
Wolfraam gloeilamp
350 - 2500
VIS + IR
3000 uur
Deuterium booglamp
190 - 400
UV
1.000 uur
Waterstoflamp
190 - 400
UV
1.000 uur
Xenon flitslamp
190 - 1100
UV + VIS + NIR
5.500 uur*
* Komt overeen met 50 Hz flitsen bij constante werking
Hoe is een diffractierooster beter dan een prisma?
Prisma's en diffractieroosters zijn typische dispersieve elementen. Een prisma bereikt dispersie door het verschil in de brekingsindex van het materiaal afhankelijk van de golflengte. Een diffractierooster maakt echter gebruik van het verschil in diffractierichting voor elke golflengte als gevolg van interferentie. Zowel prisma's als diffractieroosters kunnen lichtspectra in vele kleuren verdelen voor analyse. Een diffractierooster is echter minder gevoelig voor de kleur van het licht en kan kleuren over een grotere hoek verspreiden dan een prisma. Het glas in een prisma is helder voor zichtbaar licht, maar het absorbeert en blokkeert licht in het infrarode en ultraviolette deel van het spectrum. Een diffractierooster met een paar honderd lijnen per inch kan licht in het midden van het zichtbare spectrum minstens 20 graden afbuigen. De afbuigingshoek van een glasprisma is over het algemeen veel kleiner dan dit.
Welke anorganische verbindingen kunnen met UV/VIS spectroscopie gemeten worden?
Moleculen kunnen met UV-spectroscopie worden geanalyseerd als ze een functionele groep of conjugatie bezitten, of als ze een kleurcomplex produceren. Omdat anorganische verbindingen geen functionele groep of conjugatie bevatten, is de gebruikelijke methode om ze te analyseren een reactie met een geschikte verbinding. Dit produceert een kleurcomplex waarvan de absorptie fotometrisch gemeten kan worden in het zichtbare gebied en gecorreleerd kan worden met de werkelijke concentratie. Bijvoorbeeld, ijzer wordt gewoonlijk geanalyseerd door een reactie met 1, 10-fenthroline om een rood kleurcomplex te produceren. De absorptie van het complex wordt gemeten bij 570 nm om de ijzerconcentratie te schatten.
Wat is het verschil tussen single beam en double beam spectrofotometers?
Het belangrijkste verschil tussen een single beam en double beam spectrofotometer is als volgt.
Single beam spectrofotometer: Een enkele bundel van de lichtbron gaat door het monster.
Spectrofotometer met dubbele bundel: De lichtstraal van de lichtbron wordt in twee delen gesplitst: één deel gaat door het monster, en het andere deel door de referentie.
Bundelsplitsing in een spectrofotometer met dubbele bundel wordt op twee manieren bereikt:
Statisch, met gedeeltelijk doorlatende spiegels of een soortgelijk apparaat
Verzwakking van de bundels met behulp van bewegende optische en mechanische apparaten
Hoe analyseer ik vaste polymeerfilm met UV/VIS?
De analyse van een vast monster wordt voornamelijk uitgevoerd door de absorptie, transmissie en reflectie te schatten. Gangbare parameters die voor vaste polymeren worden bepaald, zijn onder andere % transmissie, cutoff-golflengte en geelheidsindex. Het monster wordt op een houder geplaatst die speciaal ontworpen is voor vaste monsters en de metingen worden op dezelfde manier uitgevoerd als voor vloeibare monsters. Een houder voor vaste monsters maakt het mogelijk om vaste monsters zoals films of glas te meten.
Is de temperatuur van invloed op een UV/VIS-analyse?
Temperatuur beïnvloedt de absorptiewaarden. Verschillende oplosmiddelen ondergaan verschillende interacties bij verschillende temperaturen. Oplossingsparameters die veranderen door temperatuurveranderingen zijn:
Reactiesnelheid. De reactiesnelheid verandert wanneer de temperatuur wordt verhoogd. Dit kan een verandering in de activiteit van het monster veroorzaken. Enzymatische/biomoleculaire reacties zijn erg gevoelig voor temperatuur.
Oplosbaarheid van een opgeloste stof. De oplosbaarheid wordt beïnvloed door temperatuurschommelingen. Een slechte oplosbaarheid kan resulteren in een onnauwkeurige absorptie.
Uitzetting of inkrimping van het oplosmiddel. Dit kan leiden tot een verandering in de concentratie van de oplossing en de absorptie beïnvloeden, aangezien absorptie lineair gerelateerd is aan concentratie.
Schlieren-effect. Dit effect kan optreden bij temperatuurveranderingen, wat leidt tot een reeks convectiestromen die de werkelijke extinctie kunnen veranderen.
Optische prestatieparameters zoals fotometrische ruis, golflengtenauwkeurigheid/herhaalbaarheid, fotometrische herhaalbaarheid en strooilicht worden niet beïnvloed door temperatuur binnen een bereik van 10 - 40 °C.
Optische parameters zoals fotometrische resolutie (tolueen/hexaanverhouding) en fotometrische nauwkeurigheid golflengten (K2Cr2O7 in HClO4) tonen een temperatuurafhankelijkheid variërend van 0,014 tot -0,034/eenheid binnen 10 - 40 °C.
Temperatuurregeling voor UV/VIS-spectrofotometrie kan worden bereikt met behulp van hoogwaardige thermostatiseringssystemen zoals CuveT en CuvetteChanger. Lees hier meer.
Wat is strooilicht?
Strooilicht wordt gedefinieerd als licht dat de detector bereikt dat niet van de lichtbron van het instrument afkomstig is en het optische pad niet volgt, waardoor een afwijking op de corresponderende golflengte ontstaat. Daarom is de lichtintensiteit die door de detector wordt gemeten hoger dan hij eigenlijk zou moeten zijn. Omgekeerd betekent dit ook dat de gemeten absorptie lager is dan de werkelijke absorptie, omdat deze verminderd wordt door de bijdrage van strooilicht. Dit effect is prominenter aanwezig bij hogere absorptiewaarden (hoge monsterconcentraties).
Download de whitepaper voor meer informatie over de oorsprong en nauwkeurige meting van strooilicht:
Waarom is het monstercompartiment in UV/VIS spectrofotometers met array open?
Het monstercompartiment in UV/VIS spectrofotometers is open omdat array-instrumenten gebruik maken van omgekeerde optica en de gelijktijdige detectie van alle golflengten van het spectrum.
Omgekeerde optiek: Het licht wordt afgebogen nadat het door het monster is gegaan. Hierdoor draagt slechts een klein deel van het externe omgevingslicht bij aan het signaal in een bepaald golflengtegebied.
Gelijktijdige detectie: Met behulp van een arraydetector die tegelijkertijd 2048 lichtintensiteitssignalen levert, wordt het volledige spectrum binnen één seconde opgenomen. Omdat de meting zeer snel is, wordt het effect van omgevingslicht aanzienlijk verminderd.
Applicaties
Download de specifieke application notes voor UV/VIS-spectroscopie hieronder
