Cristalización de proteínas

La cristalización de proteínas es el acto y método de crear redes estructuradas y ordenadas para macromoléculas complejas. Las proteínas suelen ser amorfas como sólidos y propensas a la desnaturalización, mientras que las proteínas que existen en redes cristalinas resisten la desnaturalización y poseen mayor estabilidad. Las proteínas pueden cristalizarse si se colocan en ambientes adecuados y hospitalarios. La cristalización de proteínas se considera tanto un arte como una ciencia, debido a las interacciones altamente complejas de variables que influyen en el proceso de cristalización de proteínas.

La razón más común para crear cristales de proteínas es apoyar investigaciones en biología estructural, típicamente mediante cristalografía de difracción de rayos X. Los investigadores pueden visualizar áreas en la estructura que permiten la interacción con otras moléculas al comprender las estructuras tridimensionales de las proteínas (por ejemplo, para entender mejor cómo interactúan enzimas, sustratos y ligandos). Además, la cristalización es un medio eficaz para crear proteínas puras libres de contaminación por otras proteínas o materia biológica extraña, ofreciendo así una alternativa para la purificación y separación a la cromatografía preparativa. 

La cristalización procede a través de una serie de mecanismos interdependientes que son influenciados de manera única por la elección de los parámetros del proceso: nucleación, crecimiento, formación de aceite, aglomeración, rotura, siembra y transición polimórfica.

A menudo, estos mecanismos ocurren simultáneamente, lo que hace que el diseño efectivo de la cristalización sea un desafío. En ausencia de comprensión mecanicista, los científicos dependen del método de prueba y error para ajustar los parámetros del proceso y optimizar el rendimiento, la pureza y el tamaño del cristal. Al entender qué mecanismos ocurren durante la cristalización, los científicos pueden implementar estrategias para obtener un producto cristalino con las propiedades deseadas.

Las proteínas son cada vez más importantes como medicamentos terapéuticos. Sin embargo, producir proteínas con la estabilidad necesaria presenta desafíos clave, incluyendo variación del producto, pérdida de estructura que reduciría la eficacia y la formación de subproductos potencialmente peligrosos. La cristalización de proteínas es un método para producir formas sólidas puras y estables de dosificación y varios terapéuticos inyectables e infundidos asociados con cristales de proteínas. En el pasado, la cristalización de proteínas ha sido una actividad de laboratorio para apoyar la cristalografía de rayos X, pero debido al crecimiento exponencial de los terapéuticos basados en proteínas, la ampliación de la cristalización de proteínas a niveles de producción es cada vez más importante y un área de enfoque intensivo.

La ampliación de la cristalización de proteínas es fundamentalmente análoga a la cristalización de pequeñas moléculas en sus requisitos para optimizar los Parámetros Críticos del Proceso (CPP) a escala de laboratorio para lograr los Atributos Críticos de Calidad (CQA) de una sustancia farmacéutica cristalizada a escala comercial. Una plataforma integral para el desarrollo y escalado del proceso de cristalización de proteínas típicamente abarca:

• Caracterización in situ del sistema de partículas
• Monitoreo espectroscópico y caracterización de polimorfos
• Optimización del procedimiento y estrategias de control de retroalimentación mediante módulos y sensores integrados

Existen aplicaciones farmacéuticas importantes asociadas con la cristalización de proteínas: química medicinal a través de la biología estructural, desarrollo de fármacos proteicos, ampliación, separación y purificación, formulación y administración de medicamentos.

• Química medicinal a través de la biología estructural. Los avances en técnicas de cristalización de proteínas y la mejora de la cristalografía de rayos X han llevado a la deducción de decenas de miles de estructuras tridimensionales de proteínas. Es posible entender las interacciones fármaco-receptor en gran detalle al determinar la estructura de estas macromoléculas complejas y visualizar los sitios de unión. Esta información permite una mayor comprensión a nivel molecular de inhibidores de proteínas, activadores alostéricos, cofactores e incluso sitios catalíticos de enzimas o 'sitios activos', resultando en mejores medicamentos con eficacia mejorada. Un ejemplo clásico de la importancia de entender la estructura proteína-inhibidor mediante cristalografía se demuestra en los grandes avances en el desarrollo de proteasas del VIH.
• Desarrollo, ampliación, separación y purificación para terapéuticos basados en proteínas. Además de cultivar cristales individuales de proteínas para cristalografía de rayos X, la industria farmacéutica ha incrementado los esfuerzos en el desarrollo de terapéuticos basados en cristales de proteínas. El objetivo de estas aplicaciones es desarrollar y ampliar a grandes cantidades cristales de proteínas puros y estables que tengan el tamaño de partícula correcto y una distribución de tamaño de partícula bien controlada. En relación con la cromatografía preparativa, la cristalización de proteínas tiene el potencial de ser un medio alternativo rentable para la separación y purificación de macromoléculas y para el aislamiento de moléculas quirales. Las herramientas para escalar la cristalización de proteínas son análogas a las usadas para escalar reacciones químicas, con la necesidad de entender los CPP y su efecto en los CQA.
• Formulación y administración de medicamentos. Los terapéuticos proteicos se administran como soluciones y pueden ser entregados mediante inyección o infusión. Debido a que se necesitan entregar altas cantidades de proteína, las soluciones proteicas infundidas se diluyen para evitar problemas de viscosidad y agregación. Esto es menos conveniente para el paciente y el hospital debido al tiempo requerido para infundir todo el tratamiento, pero también puede contribuir al fenómeno de menor cumplimiento del paciente con cualquier forma de administración parenteral. El uso de la forma cristalina de proteínas en suspensión es de gran interés, ya que estas formulaciones presentan menos problemas de viscosidad y pueden administrarse a concentraciones más altas. Otro punto clave es que el tamaño de los cristales de proteínas debe controlarse cuidadosamente para asegurar que la suspensión pueda pasar fácilmente a través de una aguja de inyección o infusión. También es importante que cualquier cristal residual que no se disuelva durante la reconstitución no exceda tamaños críticos de partículas que podrían causar efectos secundarios adversos debido a la acumulación capilar en la vasculatura, minimizando generalmente cantidades significativas de partículas >15 µm. 

1. Elija un solvente apropiado. Las consideraciones comunes incluyen cuánto soluto se puede disolver (solubilidad), qué tan práctico es manejar el solvente (seguridad) y cómo el solvente afectará la estabilidad y los estados de energía libre del péptido o proteína.
2. Logre la sobresaturación. Caliente la sustancia soluble del fármaco péptido/proteína en solvente o tampón hasta una tolerancia máxima permitida (generalmente limitada por la desnaturalización). La solución se volverá sobresaturada.
3. Cristalice el producto controlando los CPP. Reduzca la solubilidad mediante enfriamiento, adición de anti-solvente, evaporación o reacción. A medida que se reduce la solubilidad, se alcanza un punto donde los cristales nuclearán y luego crecerán. Deberían crecer cristales de producto altamente puro, aunque motivos con alta energía libre pueden formar estructuras alternativas o no cristalinas; prevenir esto requiere un control cuidadoso de los CPP si es siquiera práctico.
4. Permita que el sistema alcance el equilibrio. Esto se hace para maximizar el rendimiento del sólido del producto farmacéutico.
5. Filtre y seque el producto purificado.

Existen varios métodos que se emplean para cultivar cristales de proteínas; entre los más comunes están la difusión de vapor y el microbatch. El primer método tiene dos variaciones, descritas como gota colgante y gota sentada, y ambas funcionan fundamentalmente de la misma manera. En un sistema sellado, una gota de solución que contiene la proteína, tampón y precipitante se equilibra con un reservorio que contiene concentraciones más altas de soluto de la misma solución, pero sin la proteína. El agua de la gota que contiene la proteína se vaporiza y es atraída hacia la solución de mayor concentración en el reservorio. A medida que aumenta la concentración de solutos en la gota, la proteína comienza a cristalizar. En el método microbatch, las proteínas y otros reactivos se introducen y contienen bajo una capa delgada de aceite mineral que elimina la difusión del agua. El microbatch es esencialmente un pequeño reactor que contiene todos los ingredientes necesarios en las concentraciones correctas y estables para permitir que ocurra la cristalización.

Dado que encontrar el conjunto correcto de reactivos, parámetros y condiciones necesarios para cristalizar una proteína suele ser empírico, el medio más práctico para una cristalización exitosa de proteínas es usar una gama variable de condiciones experimentales basadas en experiencias previas. La forma más fácil de hacer esto es usar kits comerciales de cribado de cristales de proteínas que contienen soluciones preempaquetadas con tampones, precipitantes, etc., contenidas en placas de múltiples pocillos. El método de difusión de vapor de gota colgante se aplica para cultivar cristales con estos kits. Cuando se requiere un cribado a gran escala, existen sistemas de alto rendimiento que automatizan el método microbatch, ahorrando tiempo y tedio mientras minimizan la cantidad de proteína purificada requerida. Para cristalizaciones de proteínas a gran escala requeridas para aplicaciones farmacéuticas o industriales, la información obtenida en los experimentos de cribado forma la base para la aplicación en sistemas automatizados de reactores a mayor escala caracterizados por PAT en tiempo real y en situ. 

En apoyo al desarrollo de procesos y fabricación, uno de los pasos iniciales más importantes para cristalizar proteínas con éxito es asegurar que haya un suministro adecuado de proteína altamente purificada y bien caracterizada disponible. Además de que la proteína sea pura (es decir, libre de contaminantes, como impurezas de matrices de fermentación), la proteína debe ser homogénea y estable (o estabilizada) en solución con:

• Agregación mínima (Figura A)
• Estructura secundaria, terciaria y cuaternaria correcta (Figura B)
• Cualquier modificación conjugada o recombinante (Figura C)

Además, todos los reactivos y solventes usados en el proceso de cristalización de proteínas deben estar libres de contaminantes, ya que estos pueden tener un efecto significativo en la nucleación.

Similar a la cristalización de moléculas pequeñas, las proteínas cristalizan a partir de soluciones sobresaturadas. Para moléculas pequeñas que forman redes cristalinas robustas, manipular la temperatura es un medio principal para lograr la sobresaturación; esto también es útil para las proteínas. Sin embargo, se permite un rango de temperatura reducido ya que los cristales de proteínas típicamente tienen solvente como parte de la estructura cristalina, son frecuentemente sensibles a la temperatura y propensos a la desnaturalización y agregación.

Las moléculas pequeñas tienen significativamente menos grados de libertad estereoscópicos y cristalizan mucho más fácilmente como resultado. Los péptidos de moléculas grandes tienen muchas más interacciones internas ácidas, básicas, polares, no polares y fuerzas repulsivas que resisten la cristalización ordenada, un fenómeno que se agrava para proteínas aún más grandes. La mayoría de los péptidos compatibles con la cristalización también contienen un número significativo de enlaces disulfuro que son cruciales para inmovilizar motivos estructurales. La extensión del desorden intramolecular o la posible variación en la estructura es un atributo importante que determina si un péptido o proteína podría cristalizar en lugar de precipitar. Incluso si la molécula está predispuesta con atributos que son favorables para la cristalización, hay varios parámetros de proceso que influyen en la viabilidad comercial del proceso y necesitan ser caracterizados.

Más allá de la temperatura, varios otros factores afectan o ayudan a la cristalización de proteínas mediante sobresaturación, incluyendo el ajuste de pH y la fuerza iónica de una solución, la adición de sales y precipitantes como PEG para ayudar a reducir la solubilidad de la proteína, el tipo de ligando presente, etc. La clave es sobresaturar la solución dentro de un ambiente que no perturbe el carácter normal de la proteína. Esto implica la importancia de encontrar un conjunto de variables y condiciones que resulten en cristales con la morfología correcta, pureza y tasas de crecimiento aceptables.

La cristalización de proteínas procede a través de una serie de mecanismos interdependientes:

1. Nucleación
2. Crecimiento
3. Separación por aceite en la cristalización
4. Aglomeración
5. Rotura
6. Siembra
7. Química del Polimorfismo

Estos mecanismos, que a menudo están ocultos para los científicos, juegan un papel dominante en la definición del resultado de un proceso de cristalización.

El desarrollo y la ampliación de la escala de cristalizaciones para terapéuticos basados en proteínas requiere una comprensión profunda de las variables y condiciones que afectan el proceso de cristalización. Como en otras cristalizaciones, lograr la forma cristalina deseada, la forma, el tamaño de partícula y la distribución del tamaño requiere un control cuidadoso para lograr una calidad de producto consistente. Cualquier variación en las CQAs de las suspensiones de cristales de proteínas afectará directamente la eficacia terapéutica. Debido a que los cristales de proteínas son altamente sensibles a su entorno de crecimiento y pueden dañarse fácilmente por temperaturas excesivas, pérdida de solvente y otros factores externos o incluso por el proceso de muestreo, es deseable medir los CPPs y la calidad del producto in situ, es decir, sin retirar los cristales de su entorno de solución.

• Los reactores químicos automatizados EasyMax y Optimax permiten un control preciso, ajuste y registro de parámetros, incluyendo temperatura, pH, conductividad, velocidad de agitación y dosificación de tampones y excipientes, que son críticamente importantes para el desarrollo exitoso y la ampliación de la escala de cristalizaciones de proteínas
• Las herramientas tecnológicas analíticas in situ que ayudan a monitorear, solucionar problemas y corregir desviaciones del proceso también son útiles
  • Espectroscopía Raman in situ y espectroscopía FTIR rastrean las concentraciones de reactivos, monitorean el crecimiento de la estructura cristalina y también miden la concentración de soluciones sobresaturadas
  • Tecnología ParticleTrack (con FBRM) monitorea el cambio en el tamaño y la distribución del tamaño de los cristales en tiempo real mientras avanzan segmentos clave del proceso de cristalización
  • EasyViewer permite la visualización y análisis de imágenes del proceso de cristalización a medida que progresa

Cuando se utilizan reactores de laboratorio automatizados en asociación con analizadores in situ en tiempo real, se puede identificar el impacto de los parámetros del proceso en mecanismos de cristalización tales como agregación, crecimiento, aglomeración, rotura y cambio de forma. El control preciso sobre el proceso de cristalización en asociación con el monitoreo continuo e in situ del progreso de la formación de cristales permite que la optimización y la ampliación de escala se basen en hechos y datos.

El reactor de laboratorio automatizado EasyMax es una estación de trabajo completa para la optimización de parámetros en la cristalización de proteínas para apoyar el diseño y la ejecución del desarrollo y la ampliación de escala. Este sistema totalmente automatizado permite un control preciso sobre los parámetros del proceso.

• Gestiona los CPPs incluyendo las tasas de dosificación, temperatura, agitación, pH y conductividad
• Se integra fácilmente con análisis in situ para cristalización incluyendo ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FFE), y EasyViewer (análisis de imágenes in situ)
• El software iC permite la ejecución y control automatizados de todos los experimentos y equipos periféricos, así como la captura completa de datos y el mantenimiento de registros

ReactIR utiliza espectroscopía en el infrarrojo medio para medir la fase en solución en estudios de cristalización. Las mediciones de ReactIR no se ven afectadas por sólidos suspendidos, burbujas u otra masa particulada.

• Rastrea solutos individuales de cristalización in situ y en tiempo real.
• Mide concentraciones en solución en apoyo a estudios de sobresaturación
• Proporciona análisis de datos accionables para la toma de decisiones y control en tiempo real

ReactRaman utiliza espectroscopía Raman para proporcionar análisis molecular de partículas en solución

• Rastrea el crecimiento, la estructura y la morfología de los cristales de forma no destructiva, in situ y en tiempo real
• Determina los efectos de los parámetros y optimiza las condiciones y variables de cristalización para lograr los objetivos de calidad

ParticleTrack utiliza la tecnología Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM) y es un instrumento óptico basado en una sonda que se inserta directamente en un recipiente para rastrear en tiempo real el tamaño y el conteo de partículas que cambian. ParticleTrack utiliza mediciones de Distribución de Longitud de Cuerda para obtener la Distribución de Tamaño de Cristal (CSD).

• Los cristales de proteínas se monitorean continuamente, mientras se varían las condiciones experimentales
• Rastree el crecimiento por lotes o continuo durante la cristalización en tiempo real sin necesidad de retirar muestras
• Caracterice las condiciones que afectan la nucleación, agregación, polimorfismo y otros atributos del sistema

EasyViewer es un instrumento basado en una sonda que se inserta directamente en un recipiente para capturar imágenes de sistemas de partículas. EasyViewer realiza análisis de imágenes y mide el conteo de partículas, la distribución de tamaño y la morfología a partir de imágenes en línea con resolución temporal del proceso, permitiendo que las poblaciones se sigan a lo largo del tiempo.

• Los cristales de proteínas se monitorean continuamente, mientras se varían las condiciones experimentales
• Rastree el crecimiento por lotes o continuo durante la cristalización en tiempo real sin necesidad de retirar muestras
• Visualice en tiempo real los parámetros de cristalización que afectan la nucleación, agregación, polimorfismo y otros atributos del sistema

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitoreo en tiempo real de la cristalización biofarmacéutica: Distribución de longitud de cuerda a distribución de tamaño de cristal para lisozima, rHu insulina y vitamina B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Los autores reportaron éxito en el desarrollo de un enfoque eficiente para el monitoreo en tiempo real de cristalizaciones biofarmacéuticas. Este procedimiento utiliza ParticleTrack para medir la CLD para una serie de moléculas biofarmacéuticas bajo condiciones estáticas y dinámicas, y luego aplica modelado matemático para convertir la CLD en CSD. Las biomoléculas investigadas tienen diferentes formas cristalinas, que dependen de las condiciones experimentales de la cristalización. La lisozima puede producir cristales tetragonales y en forma de aguja, la insulina rHu forma cristales romboédricos y la B12 forma cristales poliédricos.

Los autores desarrollaron modelos para determinar la CSD para cristales tetragonales de baja relación de aspecto, romboédricos, poliédricos y cristales en forma de aguja de alta relación de aspecto. Los autores usaron tres modelos diferentes para determinar la distribución del tamaño de cristal:

• Un modelo desarrollado por otro grupo de investigación que asumía que los cristales podían representarse como esferas (diámetro equivalente esférico, SED) fue efectivo para los cristales de baja relación de aspecto
• Para cristales de alta relación de aspecto, los autores de este estudio desarrollaron un modelo basado en el ancho
• Por último, desarrollaron un modelo basado en la longitud que requería especificar la relación de aspecto

Los resultados de los modelos desarrollados para calcular la CSD a partir de las mediciones FBRM se compararon luego con mediciones de CSD obtenidas mediante análisis de imágenes.

Intentar monitorear una suspensión cristalina opaca presenta desafíos, especialmente cuando las especificaciones de fabricación requieren una distribución de tamaño de partícula (PSD) estrecha. Para formulaciones de cristales de proteínas inyectables, la PSD puede influir significativamente en la viscosidad, así como servir como una advertencia temprana para la agregación u otros eventos de degradación que pueden comprometer potencialmente la formulación. Se utilizó el monitoreo in situ en un estudio de cristalización por lotes a escala para caracterizar la formación y crecimiento de cristales de hormona de crecimiento humano (hGH). El análisis en tiempo real detectó una desviación del perfil habitual de PSD causada por diferencias en la mezcla entre los recipientes. Esto fue confirmado por un posterior análisis de imágenes fuera de línea (IA).

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Procesos de Cristalización Continua en la Fabricación Farmacéutica: Una Revisión. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Estimación de Parámetros de la Cinética Estocástica de Nucleación Primaria mediante Integrales Estocásticas usando Mediciones de Reflectancia con Haz Enfocado. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Monitoreo en Tiempo Real de la Cristalización Biofarmacéutica: Distribución de Longitud de Cuerda a Distribución de Tamaño de Cristal para Lisozima, rHu Insulina y Vitamina B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulación de la Cristalización en Lisozima y Autoorganización Supramolecular en Solución usando Líquidos Iónicos. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modelado y Control de la Forma del Cristal en la Cristalización Continua de Proteínas. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Mejorando la Tasa de Producción de Cristales y Reduciendo la Polidispersidad en la Cristalización Continua de Proteínas. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Cristales de Proteínas para la Administración de Biofarmacéuticos. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301