Come contare le cellule?

Un conteggio cellulare affidabile richiede più della semplice misurazione di un campione. Ogni fase del flusso di lavoro può influenzare l'accuratezza, la riproducibilità e i risultati di vitalità:

• Preparazione del campione: preparare una sospensione a cellula singola rappresentativa da colture aderenti o in sospensione.
• Diluizione del campione: regolare la concentrazione cellulare nell'intervallo di misurazione ottimale del metodo di conteggio.
• Colorazione cellulare: distinguere le cellule vitali da quelle non vitali utilizzando coloranti di vitalità, a meno che non si utilizzi un metodo senza colorazione.
• Misurazione: determinare il numero totale di cellule e il numero di cellule vitali utilizzando una tecnica di conteggio cellulare appropriata e un'attrezzatura idonea.
• Calcolo: calcolare la concentrazione cellulare e la vitalità tenendo conto dei fattori di diluizione applicati.

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La scelta del metodo di conteggio cellulare più adatto dipende dai requisiti sperimentali, tra cui velocità, preparazione del campione, valutazione della vitalità, capacità produttiva e livello di informazioni richiesto. Quattro metodi ampiamente utilizzati offrono diverse შესაძლებლità:

1. Conteggio cellulare manuale: le cellule vengono identificate e contate visivamente con un microscopio e un emocitometro. Questo metodo consolidato ha bassi costi di strumentazione e consumabili, ma comporta diverse fasi manuali ed è relativamente lento.
2. Conteggio cellulare basato su immagini: immagini digitali e software specializzati vengono utilizzati per rilevare e quantificare automaticamente le cellule. A seconda della tecnologia di imaging, il metodo può utilizzare microscopia in campo chiaro, a fluorescenza o olografica, con alcuni approcci che consentono la valutazione della vitalità senza colorazione.
3. Impedenza elettrica: le cellule sospese in una soluzione elettrolitica passano attraverso una piccola apertura e generano variazioni dell'impedenza elettrica. Questi segnali vengono utilizzati per determinare rapidamente la concentrazione e la dimensione delle cellule, sebbene la vitalità generalmente non possa essere valutata oltre la differenziazione basata sulla dimensione.
4. Citometria a flusso: cellule colorate con fluorocromi passano attraverso un fascio laser focalizzato, consentendo un conteggio cellulare rapido e una caratterizzazione multiparametrica. Il metodo offre un'elevata capacità produttiva e informazioni cellulari dettagliate, ma richiede una preparazione del campione più estesa, formazione specializzata e analisi dei dati.

Ogni metodo presenta vantaggi e limitazioni specifici. La scelta appropriata dipende dal campione cellulare, dalla capacità produttiva richiesta, dalle informazioni sulla vitalità, dalle risorse disponibili e dall'applicazione prevista.

Scarica il manuale per scoprire come questi fattori influenzano i risultati del conteggio cellulare e come ridurne l'impatto.

La valutazione tradizionale della vitalità si basa spesso su coloranti come il Blu di Tripano o su marcatori fluorescenti. Tuttavia, la colorazione aggiunge una fase manuale di diluizione, aumenta i tempi del flusso di lavoro e può introdurre variabilità dovuta alla pipettatura, all'intensità della colorazione, alle impostazioni del microscopio e alla classificazione soggettiva della vitalità. I coloranti citotossici possono inoltre compromettere l'integrità cellulare e influenzare i risultati di vitalità.

Il conteggio cellulare senza colorazione basato sulla microscopia olografica digitale offre un'alternativa, acquisendo informazioni sull'integrità della membrana cellulare e sul contenuto proteico. Ciò consente di classificare le cellule vitali e non vitali senza coloranti, aiutando a preservare le cellule per usi successivi, semplificando il flusso di lavoro ed evitando la variabilità legata alla colorazione.

L'intelligenza artificiale porta ulteriormente avanti il conteggio cellulare basato sulle immagini imparando automaticamente i parametri rilevanti dell'immagine, segmentando le cellule dallo sfondo, dallo sporco e dai detriti e classificando gli stati cellulari in base a caratteristiche morfologiche. Se combinata con la microscopia olografica, l'IA può supportare un conteggio cellulare e una valutazione della vitalità rapidi, oggettivi e indipendenti dall'operatore, senza colorazione.

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