Un'analisi rigorosa è fondamentale per verificare la purezza, la concentrazione e l'identità dei farmaci. Anche il monitoraggio della stabilità dei farmaci è essenziale per garantirne l'efficacia nel tempo al variare delle condizioni ambientali.

Valuta la sicurezza e l'efficacia dei prodotti analizzando la fotostabilità dei filtri UV, caratterizzando le particelle e misurando gli indici di colore. Rileva anche l'adulterazione e quantifica i coloranti e gli antiossidanti per soddisfare le aspettative dei consumatori.

Caratterizza il petrolio greggio, calcola le frazioni di asfaltene, formula indici di contenuto aromatico, determina il contenuto di zolfo e calcola i fattori di solubilità.

Determina le proprietà chimiche, valuta la qualità del prodotto finale, studia la composizione del polimero, qualifica l'acqua, determina la purezza e l'efficienza di tintura, analizza la degradazione fotocatalitica e i residui di pesticidi.

Determina la concentrazione e la purezza degli acidi nucleici e delle proteine, monitora le colture cellulari microbiche, studia la denaturazione e la cinetica delle proteine e analizza campioni biologici come il plasma sanguigno e il siero.

Per leggere uno spettro UV/Vis, si analizza il grafico dell'assorbanza (o talvolta della trasmittanza) rispetto alla lunghezza d'onda. I punti chiave su cui concentrarsi includono:

• Picchi di assorbimento: Identificare le lunghezze d'onda in cui l'assorbanza è più alta; Questi corrispondono a transizioni elettroniche nelle molecole.
• Lunghezze d'onda di picco (λmax): La lunghezza d'onda (o le lunghezze d'onda) alla quale si verifica la massima assorbanza, caratteristica di specifiche strutture molecolari o gruppi funzionali.
• Intensità di picco: l'altezza dei picchi di assorbimento indica la forza con cui la sostanza assorbe a quella lunghezza d'onda, in relazione alla concentrazione e all'assorbimento molare.
• Basale: controllare l'assorbanza basale nelle regioni senza assorbimento per valutare i problemi dello strumento o del campione.
• Forma dello spettro: la forma e il numero di picchi possono fornire informazioni sui tipi di transizioni elettroniche e sull'ambiente delle molecole.

Interpretando queste caratteristiche, è possibile identificare i composti, determinare la concentrazione e studiare le proprietà molecolari.

La spettroscopia UV/Vis copre tipicamente l'intervallo di lunghezze d'onda da 190 nm a 780 nm. 

Più specificamente: 

• La regione dell'ultravioletto (UV) varia generalmente da 190 nm a 390 nm.
• La regione visibile (Vis) varia generalmente da 390 nm a 780 nm.

Gli spettrofotometri UV/VIS Excellence di METTLER TOLEDO si estendono ulteriormente nella regione del vicino infrarosso, raggiungendo i 1100 nm.

La spettroscopia UV/Vis è importante perché consente l'analisi qualitativa e quantitativa delle sostanze misurando il loro assorbimento della luce ultravioletta e visibile.

Questo metodo aiuta a determinare la concentrazione degli analiti, studiare la cinetica chimica, valutare la purezza, eseguire misurazioni oggettive del colore e analizzare le strutture molecolari. Le sue applicazioni coprono un'ampia gamma di campi, tra cui la chimica, la biologia, le scienze ambientali e la scienza dei materiali, rendendolo uno strumento versatile ed essenziale per l'analisi.

La spettroscopia UV/Vis misura la luce assorbita da un campione per determinarne la concentrazione e identificare i composti. Questo processo comporta la rimozione della luce.

Al contrario, la spettroscopia di fluorescenza misura la luce emessa da un campione dopo che la ha assorbita, di solito a una lunghezza d'onda più lunga. Questa tecnica si concentra sulla riemissione della luce, fornendo una sensibilità molto più elevata per specifiche molecole fluorescenti.

Per determinare la concentrazione di una soluzione sconosciuta utilizzando la spettroscopia UV/Vis, attenersi alla seguente procedura:

1. Preparare una curva di taratura: misurare l'assorbanza di una serie di soluzioni standard con concentrazioni note alla lunghezza d'onda della massima assorbanza (λmax) per l'analita.
2. Tracciare l'assorbanza rispetto alla concentrazione: crea una curva di taratura tracciando i valori di assorbanza rispetto alle concentrazioni note. Secondo la legge di Beer, l'assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione.
3. Misurare il campione sconosciuto: Registrare l'assorbanza della soluzione incognita allo stesso λmax.
4. Determinare la concentrazione: utilizzare la curva di taratura per trovare la concentrazione corrispondente all'assorbanza misurata del campione sconosciuto.

Questo metodo si basa sulla legge di Beer-Lambert, che afferma che l'assorbanza A = εbc, dove ε è l'assorbività molare, b è la lunghezza del percorso e c è la concentrazione.

Si consideri un gruppo funzionale contenente atomi con una o più coppie solitarie di elettroni che non assorbono la radiazione ultravioletta/visibile. Tuttavia, quando questo gruppo funzionale è attaccato a un cromoforo, altera l'intensità e la lunghezza d'onda dell'assorbimento. Questo fenomeno è chiamato auxocromo o gruppo che migliora il colore.

La presenza di un auxocromo provoca lo spostamento della posizione di un picco o di un segnale su una lunghezza d'onda più lunga, che è chiamato spostamento batocromico o verso il rosso. I gruppi funzionali che contribuiscono ai gruppi batocromici sono sostituenti come metile, idrossile, alcossi, alogeno e gruppi amminici.

L'auxocromo che causa lo spostamento della posizione di un picco o di un segnale a una lunghezza d'onda più corta è chiamato spostamento ipsocromico o blu. In realtà, la combinazione di cromoforo e auxocromo si comporta come un nuovo cromoforo con un diverso massimo di assorbimento (λ_max). Ad esempio, il benzene mostra λ_max a 256 nm, mentre l'anilina mostra λ_max a 280 nm. Quindi, il gruppo NH₂ agisce come un auxocromo e provoca lo spostamento di λ_max a un valore più grande.

I reticoli di diffrazione sono generalmente migliori dei prismi per dividere diverse lunghezze d'onda perché:

Risoluzione spettrale più elevata: I reticoli possono fornire una risoluzione spettrale molto più elevata grazie alla loro capacità di produrre più ordini di diffrazione nitida, consentendo una separazione più fine di lunghezze d'onda ravvicinate.

Dispersione lineare: La separazione angolare tra le lunghezze d'onda in un reticolo è più linearmente correlata alla lunghezza d'onda, rendendo più facile l'analisi e la taratura degli spettri rispetto alla dispersione non lineare dei prismi.

Nessuna limitazione di dispersione del materiale: I prismi si basano sulla dispersione del materiale (variazione dell'indice di rifrazione con la lunghezza d'onda), che può limitare le prestazioni, soprattutto in determinati intervalli di lunghezze d'onda. I grigliati utilizzano effetti di interferenza, che non sono limitati dalle proprietà del materiale.

Ampia gamma di lunghezze d'onda: I reticoli possono funzionare in modo efficiente su una gamma più ampia di lunghezze d'onda, inclusi ultravioletti e infrarossi, mentre i prismi hanno limitazioni di assorbimento e dispersione.

Nel complesso, i reticoli di diffrazione forniscono una separazione delle lunghezze d'onda più precisa e versatile rispetto ai prismi, motivo per cui sono comunemente utilizzati negli spettrometri e negli strumenti ottici.

Le molecole possono essere analizzate utilizzando la spettroscopia UV/Vis se possiedono un gruppo funzionale o una coniugazione o se producono un complesso di colori. Poiché i composti inorganici non contengono alcun gruppo funzionale o coniugazione, il metodo comune per analizzarli è la reazione con un composto adatto. Questo produce un complesso di colori la cui assorbanza può essere misurata fotometricamente nella regione visibile e correlata con la sua concentrazione effettiva. Ad esempio, il ferro viene comunemente analizzato mediante una reazione con 1,10-fentrolina per produrre un complesso di colore rosso. L'assorbanza del complesso viene misurata a 570 nm per stimare la concentrazione di ferro.

Di seguito è nota la principale differenza tra uno spettrofotometro a raggio singolo e uno a doppio raggio.

• Spettrofotometro a raggio singolo: un singolo raggio dalla sorgente luminosa passa attraverso il campione
• Spettrofotometro a doppio raggio: il raggio di luce proveniente dalla sorgente luminosa è diviso in due parti: una parte passa attraverso il campione e l'altra parte passa attraverso il riferimento

La suddivisione del fascio in uno spettrofotometro a doppio raggio si ottiene in due modi:

1. Staticamente, con specchi parzialmente trasmittenti o un dispositivo simile
2. Tramite attenuazione dei raggi mediante dispositivo ottico e meccanico in movimento

La temperatura influisce sui valori di assorbanza. Solventi diversi subiscono interazioni diverse a temperature diverse. I parametri della soluzione che cambiano a causa delle variazioni di temperatura sono:

• Velocità di reazione. La velocità cambia quando la temperatura è elevata. Ciò può causare una modifica nell'attività del campione. Le reazioni enzimatiche/biomolecolari sono molto sensibili alla temperatura.
  
• Solubilità di un soluto. La solubilità è influenzata dalle variazioni di temperatura. Una scarsa solubilità può comportare un assorbimento impreciso.
  
• Espansione o contrazione del solvente. Ciò può portare a una variazione della concentrazione della soluzione e influenzare l'assorbanza, poiché l'assorbanza è linearmente correlata alla concentrazione.
  
• Effetto Schlieren. Questo effetto può verificarsi con variazioni di temperatura, portando a una serie di correnti convettive che possono modificare l'assorbanza reale.
  

I parametri delle prestazioni ottiche come il rumore fotometrico, l'accuratezza/ripetibilità della lunghezza d'onda, la ripetibilità fotometrica e la luce diffusa non sono influenzati dalla temperatura compresa tra 10 e 40 °C.

Invece, parametri ottici come la risoluzione fotometrica (rapporto toluene/esano) e le lunghezze d'onda di precisione fotometrica (K₂Cr₂O₇ in HClO₄) mostrano una dipendenza dalla temperatura che varia da 0,014 a -0,034/unità entro 10 – 40 °C.

Il compartimento del campione negli spettrofotometri array UV/Vis è aperto a causa del fatto che gli strumenti array utilizzano l'ottica inversa e il rilevamento simultaneo di tutte le lunghezze d'onda dello spettro.

• Ottica inversa: la luce viene diffratta dopo aver attraversato il campione. Per questo motivo, solo una piccola frazione della luce ambientale esterna contribuisce al segnale in una data regione di lunghezza d'onda.
• Rilevamento simultaneo: utilizzando un rivelatore array che fornisce 2048 segnali di intensità luminosa contemporaneamente, l'intero spettro viene registrato entro un secondo. Poiché la misurazione è molto veloce, l'effetto della luce ambientale è notevolmente ridotto.