L'inactivation virale dans les procédés biologiques

L'inactivation virale est la première des deux étapes visant à améliorer la sécurité des produits biothérapeutiques. Au cours de l'inactivation, tout virus présent dans la suspension thérapeutique concentrée et semi-purifiée est intentionnellement détruit ou voit son pouvoir pathogène abruptement supprimé, en altérant l'environnement du virus afin de provoquer la destruction et la dénaturation irréversibles de la structure virale.

L'inactivation a généralement lieu en altérant l'environnement du virus afin de provoquer la destruction et la dénaturation irréversibles de la structure virale – par exemple au moyen de méthodes chimiques, physiques, voire énergétiques. L'élimination du virus est une étape distincte de l'inactivation virale : il s'agit d'un procédé complémentaire, qui permet de renforcer encore la sécurité virale en éliminant ou en séparant le virus de la ou des protéines ou des produits étudiés.

De nombreux produits biothérapeutiques contiennent des virus ou peuvent être contaminés par ces derniers au cours de leur production ou de leur traitement. La pathogénicité et la charge virale, c'est-à-dire la quantité de virus, doivent être éliminées ou du moins limitées par inactivation et élimination virales afin de protéger le patient, tout en sachant que la mise en œuvre d'un seul procédé ne suffit pas en général. Plusieurs méthodes d'inactivation et d'élimination virales peuvent être mises en œuvre en fonction des caractéristiques du virus et du type de produit biothérapeutique. De nombreux procédés biothérapeutiques s'appuient sur une combinaison de méthodes complémentaires pour étendre le spectre de virus pouvant être éliminés de manière satisfaisante.

Inactivation
Plusieurs méthodes d'inactivation virale sont envisageables. Voici les plus courantes :

• Méthodes fondées sur un faible pH – notamment pour les produits biothérapeutiques, tels que les anticorps monoclonaux (mAb)
• Méthodes à base de solvant ou de tensioactif – pour les polysaccharides en général

Parmi les méthodes d'inactivation virale moins courantes figurent la pasteurisation, la stérilisation par chaleur sèche et chaleur humide – en particulier pour les produits à base de sang ou de sérum.

Élimination virale
Parmi les méthodes bien documentées d'élimination virale figurent la précipitation, la chromatographie et la nanofiltration.

Le choix des méthodes à employer pour l'inactivation et l'élimination virale dépend de la taille, du type et de la labilité du produit biothérapeutique préparé, de la ou des méthodes de purification que le fabricant souhaite utiliser, ainsi que de la nature et du titre des virus en question. La structure et la fonction de la substance médicamenteuse sont des attributs de qualité tout aussi importants, tout comme la sécurité virale, et doivent être évaluées et préservées tout au long du procédé. La méthode d'inactivation virale, qu'elle implique un faible pH ou un tensioactif, peut tirer parti d'un contrôle précis et simultané de plusieurs paramètres critiques du procédé (PCP) ; cette capacité est requise pour comprendre le procédé en lui-même et l'effet de la substance médicamenteuse. Les réacteurs de synthèse chimique permettent de cartographier les procédés modernes et garantissent la reproductibilité des opérations dans le cadre d'un espace de paramètres défini, tout en modélisant le transfert et le scale-up de la méthode.

On sait que l'inactivation virale des produits biothérapeutiques dans des conditions de faible pH est influencée par le pH, le temps, la température, la teneur en protéines et la teneur en soluté ou en tampon. De nombreux virus sont dénaturés de manière irréversible et détruits efficacement à une valeur de pH comprise entre 5,0 et 5,5. En fonction des virus destinés à subir une inactivation et une clairance, cette plage de pH peut être suffisante. Cependant, plusieurs virus enveloppés nécessitent une plage de pH de 3,5 à 4 pour être inactivés de manière efficace.

De nombreux produits biothérapeutiques à base de mAb requièrent une clairance à très large spectre de différents types de virus, ce qui explique pourquoi on utilise souvent des conditions à « faible » pH de 3,5 à 4 (Figure A). Cependant, une exposition prolongée à ces valeurs de pH peut également endommager ou inactiver certains produits biothérapeutiques, en particulier les protéines ou les enzymes, telles que les protéines sanguines ou l'insuline (Figure B). L'exposition prolongée à ces faibles valeurs de pH peut entraîner une déamidation, une dénaturation et une agrégation importantes des protéines et des enzymes. Des solutions d'immunoglobulines (y compris les mAb d'IgG et d'IgM) sont, en général, moins sensibles que d'autres protéines ou enzymes à un pH de 3,5 à 5,5 – bien qu'elles le restent dans une certaine mesure. Au terme d'une durée suffisante dans des conditions d'inactivation virale, la charge virale infectieuse devrait être effectivement réduite, mais cela ne suffit pas à éliminer physiquement certaines particules virales, certains débris ou d'autres éléments (Figure C).

Pour les produits à base de mAb d'immunoglobuline, les conditions de faible pH constituent la méthode la plus fréquemment utilisée pour l'inactivation virale, car elle est relativement simple à mettre en œuvre, elle nécessite peu de place et requiert peu d'interventions ou d'étapes supplémentaires, contrairement aux méthodes fondées sur les tensioactifs ou d'autres solvants. Pourtant, les conditions optimales et appropriées varient selon les molécules et le spectre de clairance virale requis. Par conséquent, des études doivent être menées pour chaque molécule afin de caractériser et de valider l'espace de conception ou les limites opérationnelles au sein desquelles l'inactivation virale peut avoir lieu. Ces limites et le résultat d'un procédé d'inactivation virale sont généralement définis par l'ensemble – ou au moins une sélection – des variables ou paramètres critiques du procédé (PCP) qui influencent le résultat de l'inactivation virale et, donc, la qualité de la substance médicamenteuse. L'identification et la sélection de ces facteurs permettent d'améliorer la qualité et la quantité de produit créé.

En général, des études d'inactivation virale dans des conditions à faible pH sont menées sur différents volumes et concentrations de solution d'immunoglobulines dans un récipient, tel qu'un bécher, soumis à agitation magnétique. Comme la plupart des matériaux étudiés utilisent des solutions d'immunoglobulines à un pH de départ proche des conditions physiologiques, les études d'inactivation virale cherchent à définir les paramètres d'ajout de réactif. Un titrage manuel est généralement réalisé à l'aide d'une burette ou d'une pipette, tout en relevant les mesures de pH à intervalles réguliers. Au terme d'une durée définie et du maintien d'autres paramètres dans des conditions de faible pH suffisantes pour inactiver la teneur en virus cible, la substance médicamenteuse ou la solution d'immunoglobulines est soumise à un titrage inverse à partir de la plage de faible pH jusqu'à la plage de pH physiologique ou légèrement alcaline. Cette étape permet d'achever l'inactivation virale en maintenant un faible pH. Néanmoins, tout au long de l'étude de titrage à faible pH en vue de l'inactivation virale, une extraction d'échantillon doit être réalisée pour procéder à l'analyse hors ligne et documenter les différents attributs de qualité, tels que l'agrégation ou la déamidation, par chromatographie par échange d'ions par exemple. Bien que les scientifiques chevronnés parviennent à obtenir des résultats précis, le procédé d'inactivation virale est souvent laborieux et souffre de variations naturelles, d'inexactitudes et d'un manque de reproductibilité inhérents à tout procédé manuel.

Tandis que l'objectif principal des études d'inactivation virale dans des conditions de faible pH dans le cadre de procédés biologiques en aval consiste à définir la quantité de réactif à ajouter et la durée nécessaire du procédé, la caractérisation de la cinétique du procédé et l'impact des paramètres de procédé composés jouent également un rôle essentiel et sont incontournables pour permettre la conception d'un procédé d'inactivation virale à la fois robuste et optimal. Cependant, la surveillance et le contrôle de la température sont souvent négligés et constituent, par conséquent, un paramètre incontrôlé de nombreuses études de développement de procédé pour l'inactivation virale.

Ce manquement peut être dû en partie à l'utilisation de systèmes pilotes voire de fabrication à échelle commerciale qui procèdent à l'inactivation virale dans des récipients de transfert, capables de consigner, mais pas de réguler la température. La représentativité de l'échelle, et notamment la représentativité du mélange, est un autre paramètre souvent négligé par les études d'inactivation virale dans des conditions de faible pH, telles que celles réalisées à l'aide de plateformes manuelles contrôlées par des agitateurs magnétiques à plaque. Le manque de données obtenues pour une opération aussi simple que le mélange empêche de vérifier la précision et la reproductibilité des conditions d'étude supposées. 

Le traitement à faible pH en vue de l'opération d'inactivation virale présente un risque potentiel d'agrégation du produit en cours de procédé lors du traitement en aval d'un anticorps monoclonal. Cette présentation, réalisée par Hiren D. Ardeshna de GlaxoSmithKline, porte sur un plan expérimental factoriel complet pour étudier les effets de quatre paramètres de procédé :

• le point final dans des conditions de faible pH ;
• le temps de maintien à faible pH ;
• la durée du titrage à faible pH ;
• la durée du titrage pour la neutralisation.

Les méthodes d'inactivation virale par solvant ou détergent sont fréquemment utilisées contre les virus enveloppés. Les réactifs utilisés ont généralement un impact négligeable sur la labilité de la protéine thérapeutique ou les anticorps qui peuvent faire l'objet d'une dénaturation ou d'une déamidation avec certaines méthodes à faible pH. Les méthodes de traitement par solvant ou détergent sont soumises aux mêmes besoins et facteurs que les méthodes à faible pH. Il est ainsi nécessaire de définir la quantité de réactif ajouté (dans le cas présent, un solvant ou un détergent), ainsi que la durée du procédé. Comme pour l'inactivation virale dans des conditions de faible pH, les conditions varient selon les immunoglobulines ou les types de substance médicamenteuse. Par conséquent, des études doivent être menées pour chaque molécule afin de caractériser et de valider l'espace de conception ou les limites opérationnelles au sein desquelles l'inactivation virale par solvant ou détergent peut avoir lieu. Ces limites et le résultat d'un procédé d'inactivation virale sont définis une fois encore par les paramètres critiques du procédé (PCP), tels que la température, la teneur en protéines, la teneur en solvant ou en détergent, le temps passé dans les conditions d'inactivation, ainsi que le mélange et l'efficacité de l'homogénéisation du solvant ou du détergent. L'identification et la sélection de ces facteurs ont une incidence favorable sur la qualité et la quantité de produit créé.

Tandis que les études d'inactivation virale par détergent ne requièrent pas de titrage de réactif, contrairement aux études dans des conditions de faible pH, un espace de conception des variables critiques doit être évalué. Comme pour leurs homologues à faible pH, les études d'inactivation virale impliquant des solvants ou des détergents supposent de caractériser le procédé entièrement à la main. De même, le dosage du réactif et les contrôles dépendent de l'exactitude et la précision des personnes très qualifiées qui se chargent de la réalisation de plusieurs tâches critiques en parallèle. Les études d'inactivation virale par solvant ou détergent sont également soumises à des variations naturelles, à des inexactitudes et à des problèmes de reproductibilité.

Les méthodes d'inactivation virale fondées sur des solvants ou des détergents requièrent généralement de prendre en compte un autre élément, qui n'est pas particulièrement pertinent dans le cadre des méthodes à faible pH. En effet, le solvant ou détergent ajouté doit être retiré de la substance médicamenteuse ou de la solution d'immunoglobulines et vérifié à l'aide d'une méthode d'analyse appropriée. La plupart du temps, les solvants ou les détergents sont éliminés par chromatographie ou échange de tampon via filtration à flux tangentiel. L'élimination des solvants ou détergents ajoutés est comparable, dans une certaine mesure, au titrage par pH inverse qui permet de retrouver une plage de pH physiologique approprié ou légèrement alcalin. À plus grande échelle, les méthodes d'échange de tampon ou de chromatographie se dérouleraient sous forme d'opérations continues ou semi-continues lorsque le matériau quitte son récipient pour passer dans une colonne ou autre membrane adaptée à un échange de solvant ou de tampon. Lors du développement du procédé, l'inactivation virale par solvant ou détergent est susceptible d'être réalisée séparément de l'étape de purification ou d'élimination. Aussi, la continuité des données ou des informations peut-elle être mise à mal par cette pratique.

Différents produits vaccinaux subissent une inactivation virale, tels que l'anatoxine, les protéines recombinantes, les sous-unités, les polysaccharides et même quelques vaccins à pseudo-particules virales. Une fois encore, le choix de la méthode d'inactivation virale appropriée doit tenir compte de la nature du produit biothérapeutique, ainsi que du spectre de virus à éliminer efficacement.

Il convient, en général, de prendre en compte les autres méthodes ou pratiques disponibles qui permettent d'éviter la contamination virale par des corps étrangers pour certains types de vaccins, tels que les virus vivants atténués – impliquant une particule virale. Les méthodologies spécifiques à ces produits peuvent inclure un ou plusieurs procédés de nanofiltration ou de chromatographie destinés à réduire la charge virale extérieure dans les sources de matière première respective. Les virus inactivés ou détruits peuvent encore subir un procédé d'inactivation virale dans des conditions de faible pH ou à base de solvant ou de détergent – cette étape peut, en effet, maintenir l'effet immunostimulant même si le produit viral est dénaturé ou détruit.

Les méthodes d'inactivation virale destinées aux types de molécules ou de produits d'oligonucléotides ne sont pas considérées comme nécessaires. Cela tient principalement à la nature des réactifs, aux conditions de réaction et aux méthodes de traitement qui ne sont pas favorables aux virus. À l'heure actuelle, bon nombre de ces produits à base d'oligonucléotides en développement et en production sont principalement purifiés, concentrés et formulés par des échanges successifs de tampon au moyen d'une filtration à flux tangentiel ou par l'un des différents types de séparation chromatographique.

Avec la nécessité de garantir la continuité des données et d'enregistrer des lots de données électroniques, les réacteurs de synthèse chimique démultiplient la puissance des procédés d'inactivation virale en facilitant la conception et l'exécution d'expériences, mais aussi l'acquisition et l'intégrité des données. Les technologies analytiques des procédés  (PAT) couvrent plusieurs applications et méthodes de travail, telles que l'inactivation virale avec échange de tampon, et modélisent plus précisément le déroulement des procédés dans le cadre d'opérations à grande échelle.

Visionnez une eDemo en direct à votre bureau ou à votre domicile selon vos disponibilités.

• Il vous suffit d'appuyer sur Lecture : le logiciel iC s'adapte de manière dynamique aux conditions au sein du réacteur. Exécutez des opérations de manière reproductible en respectant le protocole d'inactivation virale.
• Collectez des données de plusieurs capteurs, y compris le pH, la conductivité, le potentiel Redox (ORP) et l'oxygène dissous.
• Intégrez des périphériques, tels que des pompes ou des balances pour le transfert de masse par gravimétrie.

La spectroscopie FTIR et Raman in situ permet de suivre les composants critiques du procédé biologique tout au long des opérations de formulation et de conjugaison en amont et en aval.

Le glucose et les principaux métabolites peuvent être surveillés dans les applications en amont, tandis que dans les procédés en aval la concentration du vaccin ou des protéines, les stabilisateurs, les excipients et les impuretés peuvent tous être surveillés et contrôlés en temps réel sans avoir à attendre ou à subir les coûts associés à l'analyse hors ligne.

Ce système permet une détermination rapide des points finaux des procédés et assure une compréhension parfaite de l'impact des différents paramètres du procédé sur la qualité des produits et l'efficacité du procédé.