Os blocos de construção da espectroscopia UV VIS, incluindo escalas de cores, fundamentos, instrumentação e calibração
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A espectroscopia UV Vis é uma técnica científica usada para medir a quantidade de luz que é absorvida ou transmitida por uma amostra em diferentes comprimentos de onda de luz ultravioleta (UV) e visível (Vis).
O processo envolve iluminar um feixe de luz UV Vis através da amostra e medir a quantidade de luz que passa por ela. Ao analisar o padrão de absorção e transmissão da luz, os cientistas podem identificar e quantificar os componentes da amostra.
Existe uma relação única entre a substância e seu espectro UV Vis quando uma substância absorve o máximo de luz em um comprimento de onda específico. Este relacionamento pode ser usado para:
Análise qualitativa , ou seja, determinação da presença de determinadas substâncias.
Análise quantitativa , ou seja, determinação das quantidades de determinadas substâncias.
A espectrofotometria UV VIS é comumente usada em muitos campos da ciência, incluindo química, biologia e física, para estudar as propriedades dos materiais e suas interações com a luz. Também é amplamente utilizado na indústria para controle de qualidade e análise de materiais como medicamentos, alimentos e cosméticos.
Esta página fornecerá conhecimentos essenciais sobre espectroscopia UV VIS e suas aplicações.
Obtenha suas respostas sobre os fundamentos e aplicações do UV Vis nas seções a seguir:
A espectroscopia UV-Vis é um tipo de espectroscopia de absorção em que uma amostra é iluminada com raios eletromagnéticos de vários comprimentos de onda nas faixas ultravioleta (UV) e visível (Vis). Dependendo da substância, os raios UV ou de luz visível são parcialmente absorvidos pela amostra. A luz restante, isto é, a luz transmitida , é registada em função do comprimento de onda por um detector adequado. O detector então produz o espectro UV-Vis exclusivo da amostra (também conhecido como espectro de absorção).
Para saber mais sobre os fundamentos da espectroscopia UV-Vis, baixe o guia da METTLER TOLEDO “Aplicações e fundamentos da espectrofotometria"
Quando a luz atinge um objeto, ela pode ser absorvida pelo objeto, normalmente porque o comprimento de onda da luz absorvida corresponde a uma excitação eletrônica no objeto. A luz restante é transmitida, ou seja, passa através do objeto.
Num espectrofotómetro a transmitância é medida dividindo o espectro de intensidade da luz transmitida através de uma amostra (I) pelo espectro de intensidade da luz transmitida através do branco (I 0 ).
Conversor de Absorbância/Transmitância
=
Absorbância (A), também conhecida como densidade óptica (OD) é a quantidade de luz absorvida pelo objeto e pode ser expressa da seguinte forma
Transmitância (T)
Para saber mais sobre o conhecimento fundamental das técnicas de espectroscopia UV-Vis, baixe o guia “Aplicações e fundamentos da espectrofotometria”.
O que é a lei Beer-Lambert?
A Lei de Beer-Lambert afirma que a quantidade de energia absorvida por uma solução é proporcional ao comprimento do caminho e à concentração. Simplificando, uma solução mais concentrada absorve mais luz do que uma solução diluída.
A declaração matemática da lei de Beer é:
A = ϵ.dc
Onde ϵ = absortividade molar, d = comprimento do caminho e c = concentração. A absortividade molar é uma constante física única da amostra que se relaciona com a capacidade da amostra de absorver luz em um determinado comprimento de onda. ϵ tem a unidade L·mol-1·cm-1.
Para saber mais sobre os fundamentos da espectroscopia UV-Vis, baixe o guia da METTLER TOLEDO, “Aplicações e fundamentos da espectrofotometria”
Qual é a diferença entre espectrofotômetros de varredura e array?
Um espectrofotômetro UV Vis é um instrumento projetado para medir a absorbância na região UV Vis usando a lei de Beer-Lambert. Ele mede a intensidade da luz que passa através de uma solução de amostra em uma cubeta e a compara com a intensidade da luz antes de passar pela amostra.
Os principais componentes de um espectrofotômetro UV Vis são uma fonte de luz, um porta-amostras, um dispositivo dispersivo para separar os diferentes comprimentos de onda da luz e um detector adequado.
Espectrofotômetro de Varredura
Os espectrofotômetros de varredura convencionais funcionam com base no princípio de realizar medições consecutivas de transmitância em cada comprimento de onda definido. A luz é dividida em diferentes comprimentos de onda por uma rede de difração. Uma cubeta de amostra é colocada entre a rede de difração e o detector.
Espectrofotômetro de matriz
Num espectrofotómetro de matriz, a amostra é iluminada por um continuum, ou seja, todos os componentes espectrais da luz de uma só vez, absorvendo assim luz de diferentes comprimentos de onda simultaneamente. A luz transmitida é então difratada por uma rede de reflexão. Esta instrumentação ajuda a adquirir o espectro UV-Vis mais rapidamente do que pode ser obtido usando um espectrofotômetro de varredura tradicional.
Em comparação com um espectrofotômetro de varredura, um espectrofotômetro de matriz não possui partes móveis.
Para saber mais, baixe “Array versus Scanning”. O informativo técnico compara as duas configurações estabelecidas do espectrofotômetro UV-VIS e avalia seu desempenho e benefícios.
Um instrumento de espectrofotometria deve funcionar de acordo com suas especificações para medições críticas de UV/Vis, especialmente em controle de qualidade clínico, farmacêutico ou industrial. Portanto, a verificação de desempenho deve ser realizada regularmente. Os resultados da calibração também devem ser registrados e armazenados.
Baixe “Como os laboratórios UV Vis fazem a calibração do espectrofotômetro” para obter informações sobre a importância da calibração em relação às revisões do capítulo UV Vis encontradas no Ph. 10 e USP42 NF37.
Principais parâmetros a serem calibrados para um espectrofotômetro UV-VIS
Os principais parâmetros a serem calibrados para um espectrofotômetro UV-Vis são mostrados na tabela a seguir.
Teste de performance
Material de referência certificado (CRM)
Parâmetro de teste do instrumento
Critérios de aceitação
USP 42NF 37
Ph. Eur. 10
Precisão do comprimento de onda e
repetibilidade
Ho(ClO 4 ) 3 : 4% Ho 2 O 3 em 10% v/v HClO 4
Em branco: Ar
14 comprimentos de onda
(240 nm – 650 nm)
Xe: 2 comprimentos de onda (260,6, 528,6 nm)
UV (200 – 400 nm): ± 1 nm
Vis (400 – 780 nm): ± 2 nm
(DP) < 0,5 nm
UV (<400nm):
± 1nm
Vis (> 400nm):
± 3nm
Fotométrico
precisão &
repetibilidade**
K 2 Cr 2 O 7 em 0,001 M HClO 4
Branco : 0,001 M HClO4
60mg/L
0A – 2A,
235, 257, 313, 350 nm
Para absorbância ≤ 1A
Precisão: ± 0,010A
Repetibilidade:
SD ≤ 0,005 A
Para absorvância > 1A
Precisão: ± 1%
Repetibilidade:
DP ≤ 0,5%
Precisão: ± 0,010 A ou ± 1%, o que for maior
Ácido nicotínico em
0,1 M de HCl
Branco : HCl 0,1 M
12mg/L
0,26 A – 1,6 A
213, 261 nm
Linearidade fotométrica
K 2 Cr 2 O 7 em 0,001 M HClO 4
Branco : 0,001 M HClO4
6 – 200 mg/L, até 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Todos os filtros medidos cumprem critérios de aceitação de precisão fotométrica
R2 > 0,999
Ácido nicotínico em
0,1 M de HCl
Branco : HCl 0,1 M
6 – 60 mg/L, até 2,5 A
213, 261 nm
Luz difusa de acordo com o procedimento A
(SFRM)
1,2% p/v de KCl/ H2O ;
Comprimento do caminho de 10 mm
Branco : 1,2% p/v KCl/ H2O , comprimento de caminho de 5 mm
Um máximo em 198 nm
≥ 0,7 A
(N / D)
Luz difusa de acordo com procedimento B (SWM)
1,2% p/v de KCl/ H2O ;
Comprimento do caminho de 10 mm
Branco : H 2 O, comprimento de caminho de 10 mm
Um máximo em 198 nm
≥ 2,0 A
≥ 2,0 A
Resolução
0,02% v/v de tolueno em n-hexano
Em branco : n-hexano/
n-heptano (Ph. Eur. 10)
A máx.,269 /A mín.,267
>1,3
Os níveis são indicados na respectiva monografia
** Nenhuma especificação de repetibilidade fotométrica (precisão) na Ph. Eur.
DP - Desvio padrão
3. A Ciência das Cores
Noções básicas de medições de cores
As cores tornam nosso mundo mais interessante. Quando vemos um objeto, a luz refletida pelo objeto entra em nossos olhos e é coletada por vários tipos de fotorreceptores na retina. Dependendo da sensibilidade dos fotorreceptores, pessoas diferentes podem perceber a mesma cor de maneira diferente.
Para aceitar universalmente a precisão de uma cor específica, valores numéricos devem ser atribuídos. Resumindo, equipamentos de medição como espectrofotômetros e colorímetros fornecem resultados de cores como valores para garantir precisão e repetibilidade na determinação de cores.
Os espectrofotômetros quantificam dados de cores coletando e filtrando comprimentos de onda transmitidos através de uma amostra. Uma equação matemática é aplicada aos dados espectrais para mapear a cor em uma escala de cores.
Uma escala de cores CIE (Commission Internationale de l'éclairage) é definida usando três parâmetros: matiz, croma e luminosidade.
Matiz é a cor dominante de um objeto. As cores primárias e secundárias combinadas formam a tonalidade.
Croma , também conhecido como saturação, descreve o quão vívida ou opaca é uma cor.
Luminosidade é a intensidade luminosa da cor (seja ela escura ou clara).
Cada sistema de cores CIE utiliza três coordenadas para localizar uma cor em uma escala. As três escalas de cores primárias são Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* e CIE L*u*v*.
Por exemplo, quando uma cor é expressa em CIE L*a*b*:
L* define leveza
a* denota o valor vermelho/verde
b* denota o valor amarelo/azul
Usando a escala de cores CIE L*a*b*, as coordenadas para o vermelho da rosa retratada seriam:
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23
Para saber mais sobre os fundamentos da medição de cores, baixe o guia.
A cor é um fator chave para o reconhecimento instantâneo.
Fornecer uma experiência visual geral bem-sucedida aos consumidores pode influenciar a decisão de compra. Portanto, a cor é importante na definição da identidade da marca e na consistência do produto.
Diferentes escalas de cores são estabelecidas para definir exclusivamente um produto de acordo com os padrões industriais. Essas escalas incluem:
Escala
Padrão
Formulários
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Para determinar se o combustível (querosene, gasolina, diesel, nafta, etc.) está contaminado ou degradado durante o armazenamento
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Índice de amarelecimento usado como métrica para verificações de pureza nas indústrias de água, química, petróleo e plásticos
jardineiro
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Para testar produtos como resinas, ácidos graxos, vernizes e óleos secantes que adquiriram cor por aquecimento
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Controle de qualidade para as indústrias de aromas e fragrâncias e de alimentos e bebidas
Para medir intensidade de cor e turbidez (turbidez) em unidades EBC de cerveja, maltes, caramelo, etc.
USP/EUP
Monografia USP-24 631, método EP 2.2.2
Controle de qualidade de medicamentos
Hess-Ives
Método de teste DGK F 050.2
Usado para testar produtos químicos e líquidos surfactantes (principalmente na indústria cosmética)
4. Análise de microvolume usando um espectrofotômetro UV Vis
Como realizar análise de microvolumes em espectroscopia UV-VIS?
Um espectrofotômetro de microvolume mede volumes de amostra tão baixos quanto 1 µl. A concentração de ácidos nucleicos numa amostra é geralmente da ordem de nano ou micrograma por mililitro.
Diluir esses microvolumes e obter resultados precisos é um desafio. Portanto, a microanálise sem diluição torna-se importante para a análise a jusante de ácidos nucleicos.
Durante a análise de ácidos nucleicos, a amostra em microvolume é pipetada para o compartimento fino na superfície do pedestal. O feixe de luz da fonte da lâmpada é guiado pela fibra óptica até a plataforma de microvolume. Como o comprimento do caminho é reduzido à ordem de um milímetro, maiores concentrações de analito podem ser analisadas com precisão, sem múltiplas diluições.
Um sistema de microvolume utiliza tecnologia de fibra óptica juntamente com as propriedades inerentes da amostra (como tensão superficial) para reter a amostra na plataforma de pedestal e determinar a absorvância em tempo real das amostras em volumes baixos.
Com essas vantagens, a análise de microvolumes torna-se a escolha ideal para análises biomoleculares.
Participe do webinar sob demanda “Maximize a precisão do fluxo de trabalho por meio de boas práticas de UV/VIS em análises de ácidos nucleicos” para obter dicas e truques sobre análise de microvolumes.
Controle de Qualidade de Ácidos Nucleicos A quantificação de ácidos nucleicos é um método pré-analítico essencial para obter resultados precisos e confiáveis em muitos ensaios de biologia molecular, como sequenciamento de próxima geração (NGS), reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR em tempo real (PCR quantitativo; qPCR), clonagem e transfecção.
O controle qualitativo e quantitativo de ácidos nucleicos pode ser realizado determinando a pureza e a concentração de ácidos nucleicos.
Métodos de análise de DNA A260 dá a correlação da concentração de nucleotídeos e A280 dá a das proteínas residuais. Os aminoácidos tirosina e triptofano absorvem a 280 nm e a fenilalanina absorve bem a 260 nm. Isto permite o cálculo da razão A260/A280 para pureza do DNA usando medições diretas de absorbância. DNA de boa qualidade terá uma proporção A260/A280 de 1,7–2,0
Ensaios de quantificação de proteínas Diferentes métodos de quantificação de proteína total incluem A280, ácido bicinconínico (BCA), Bradford, Lowry, Pierce e outros novos ensaios. As proteínas em soluções têm máximos em 280 nm devido aos aminoácidos com anéis aromáticos e mínimos em torno de 220 nm devido à presença de ligações peptídicas.
A concentração é calculada usando a fórmula de Warburg:
Concentração de proteína (mg/ml) = 1,55 X (leitura A280) – 0,76 X (leitura A260)
Para saber mais sobre análise de DNA com espectroscopia UV-Vis, baixe o editorial do aplicativo “Relação 260/280: Indicador de Contaminação de Proteínas”.
Quais são os erros comuns em medições e calibração de UV Vis?
Boa exatidão e precisão nas medições UV Vis podem ser alcançadas tomando precauções para evitar erros. Os riscos de erro típicos que devem ser considerados ao realizar medições UV Vis incluem:
Características espectrais. A caracterização espectral é realizada durante o processo de calibração. Os principais fatores que podem levar a resultados errôneos são precisão do comprimento de onda, largura de banda espectral, luz dispersa e linearidade.
Características fotométricas. As características fotométricas incluem a sensibilidade espectral da fonte de luz, a sensibilidade dependente da temperatura da fonte de luz e do detector, etc.
Interações ópticas. As radiações da fonte da lâmpada podem interagir com o material da cubeta, alterando a intensidade da absorvância da amostra. Tais interações ópticas podem ser evitadas selecionando o material correto da cubeta.
Fatores diversos. Outros fatores como temperatura, flutuações de tensão de linha, vibrações, contaminação ou aquecimento da amostra pelo fotômetro também afetam negativamente as medições.
GUVP®
Embora nem todos os erros possam ser evitados, os erros podem ser minimizados para obter melhores resultados.
'Baixe o folheto Boas Práticas UV/VIS “Resultados Confiáveis para Espectroscopia UV/Vis”.
Escolher a cubeta certa envolve selecionar o material certo e o tamanho correto com base na sua amostra e instrumentação.
O material da cubeta deve ter transmissão suficiente em um determinado comprimento de onda. A atenuação da luz nas paredes da cubeta não deve afetar o resultado de uma análise. Cubetas de vidro não são utilizadas na região UV para análises abaixo de 370 nm, pois absorvem a radiação. Recomenda-se utilizá-los apenas na região visível.
O gráfico a seguir fornece as faixas de transmissão utilizáveis das cubetas:
Material
Faixa de transmissão teórica (nm)
Quartzo UV distante
170-2700
Vidro óptico
320-2500
Perto do quartzo IR
220-3800
Sílica UV
220-2500
Plástico UV
220-900
Célula PS descartável
340-750
Célula PMMA descartável
285-750
O tamanho das cubetas também afeta as capacidades de medição. O comprimento nominal do caminho de radiação da cubeta é de 10 mm. Dependendo das amostras, o comprimento pode variar de 1 mm a 100 mm.
Cubetas padrão podem ser usadas para a maioria das amostras em estudo. As cubetas comuns de absorção e fluorescência têm uma base externa de 12,5 mm x 12,5 mm, uma altura de 45 mm e dimensões internas de 10 mm x 10 mm.
Cuvetes de percurso longo (cuvetes com comprimento de percurso superior a 10 mm) são usadas quando a amostra está muito diluída ou quando a amostra vaporiza ou sofre uma alteração química durante o processo de medição.
As cuvetes de percurso curto (cuvetes com um comprimento de percurso inferior a 10 mm) são utilizadas quando a absorvância é elevada e a diluição é difícil.
Como manusear as cubetas corretamente?
Ao manusear cubetas, transporte-as sempre usando os lados foscos. Evite tocar nas superfícies ópticas transparentes com os dedos, pois as impressões digitais podem causar absorção significativa e, portanto, afetar a precisão.
Evite usar pipetas pasteur de vidro para encher a cubeta, pois elas podem riscar a superfície óptica causando mais interferências. São recomendadas pipetas com pontas plásticas descartáveis.
A limpeza das cubetas tem um efeito importante nos resultados, por isso devemos considerar isso como um fator muito importante.
As etapas a seguir são recomendadas para limpeza profunda de cubetas de quartzo:
Mergulhe as cubetas na solução de limpeza.
Remova a solução de limpeza e enxágue as cubetas com água deionizada.
Lave as cubetas com etanol ou acetona, exceto no caso de proteínas (ver tabela abaixo).
Seque as cubetas com um pano sem fiapos e depois seque ao ar ou em forno.
O gráfico a seguir fornece as faixas de transmissão utilizáveis das cubetas.
Soluções aquosas
Moléculas orgânicas
Difícil de remover partículas
Proteínas
Metais pesados
Ácidos graxos
Soluções de limpeza
Partes iguais em volume de HCl 3 M e etanol
Lave com ácido nítrico 50%
HNO 3 ou 2 M HCl concentrado
Partes iguais em volume de etanol e 3 M de HCl
Incubar à temperatura ambiente com tripsina
(Etanol e acetona não são recomendados para limpeza.)
Partes iguais em volume de ácido sulfúrico 2 M e 50% de água deionizada
Água régia
Partes iguais por volume de IPA e água desionizada
Tempo de imersão*
10 minutos
10 minutos
30 segundos
Pernoite
20 minutos
Limpar
*O tempo de imersão indicado na tabela é uma estimativa aproximada; no entanto, só é recomendado que você mergulhe as cubetas até que as manchas/contaminantes sejam removidas.
As cubetas de vidro podem ser limpas enxaguando-as com acetona ou etanol e depois enxaguando com água. A secagem ao ar é recomendada.
As cubetas de plástico podem ser lavadas diversas vezes com água deionizada. Não é recomendado lavar cubetas de plástico com produtos químicos.
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Boas práticas para uso de espectrofotômetros de microvolume
Prepare a amostra A sensibilidade do instrumento pode ser baixa para concentrações diluídas de amostras biológicas. Para aumentar a sensibilidade de tais amostras, considere obter uma concentração mais elevada da amostra. Medições de microvolume normalmente precisam de 1-2 µl de volume de amostra. Use pipetas calibradas para coletar a amostra. Deve-se ter cuidado para que uma amostra homogênea seja preparada e levada para análise.
Limpe a plataforma de micro volume Certifique-se de que a superfície do pedestal de microvolume e o espelho estejam devidamente limpos. Simplesmente limpe as superfícies com um pano sem fiapos e água deionizada. Se estiver usando uma solução tampão, detergentes ou uma amostra pegajosa, limpe a superfície várias vezes antes de prosseguir para a próxima amostra.
Coloque a amostra na plataforma De forma lenta e constante, coloque a amostra na superfície para evitar a formação de bolhas.
Trabalhe dentro dos limites de detecção Conheça os limites de detecção mais baixos e mais altos do instrumento e trabalhe dentro dessa faixa.
Práticas Gerais para Medições Precisas de UV Vis
Tenha cuidado ao preparar a amostra e pipetá-la para uma cubeta ou plataforma de microvolume. A amostra deve ser homogênea.
Se quaisquer partículas sólidas suspensas estiverem presentes na amostra, a luz poderá se espalhar. Nesses casos, filtre a amostra utilizando um filtro de seringa.
Encha a amostra em uma cubeta considerando a dimensão z do porta-amostra. Isso garantirá que a luz passe pela amostra. A dimensão z é a distância do fundo de uma cubeta até a altura na qual o feixe de luz passa pela amostra.
Antes de cada medição, limpe a cuvete com um tecido sem fiapos. Use tecido novo sempre.
Use o mesmo tampão solvente/solução que foi usado na preparação da amostra como branco.
6. Quais são as aplicações da espectroscopia UV-VIS em vários setores?
A espectroscopia UV-Vis é uma técnica analítica versátil com uma ampla gama de aplicações em diversos setores. Algumas das aplicações significativas da espectroscopia UV-Vis em diferentes indústrias são:
Comida & Bebida
A espectroscopia UV-Vis determina a qualidade e a composição de produtos alimentícios e bebidas. Pode ser usado para analisar a cor (por exemplo, vinho), sabor e aroma de produtos alimentícios, bem como para detectar a presença de contaminantes ou adulterantes.
Farmacêutico
A espectroscopia UV-Vis analisa a pureza, concentração e identidade de medicamentos e outros produtos farmacêuticos. Também é usado para monitorar a estabilidade de produtos farmacêuticos ao longo do tempo.
Cosméticos
Avaliação da fotoestabilidade de agentes para formulações, caracterização de partículas de agente bloqueador de UV, avaliação do índice de cor, detecção de adulteração (indústria de perfumes), estudo de propriedades ópticas, quantificação de corantes, antioxidantes, etc.
Petroquímica
Caracterização do petróleo bruto, cálculo das frações de asfalteno, formulação de índices de teor de aromáticos, qualidade da gravidade do petróleo bruto, teor de enxofre, cálculo do fator de solubilidade de Hildebrand. (Estendido a óleos betuminosos, pesados e de xisto e óleos de craqueamento catalítico fluido, coque ou liquefação de carvão)
Químico
Determinação de propriedades químicas, avaliação da qualidade final do produto acabado, estudo da composição de polímeros, qualificação de águas residuais, determinação de pureza e eficiência de tingimento, degradação fotocatalítica de polímeros/corantes, resíduos de pesticidas no solo ou na água
Biotecnologia
Concentração e pureza de ácido nucleico, proteínas (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), medições de cultura de células microbianas, desnaturação de proteínas, estudos cinéticos (atividade enzimática), amostras biológicas como sangue, plasma, soro, etc.
A METTLER TOLEDO oferece uma ampla variedade de métodos de aplicação validados. Encontre a aplicação que melhor se adapta às suas necessidades através do nosso motor de pesquisa online.
As diferentes técnicas espectroscópicas são diferenciadas principalmente pela radiação que utilizam, pela interação entre a energia e o material e pelo tipo de material e aplicações para as quais são utilizadas. As técnicas espectroscópicas comumente utilizadas para análise química são espectroscopia atômica, espectroscopia ultravioleta e visível (espectroscopia UV Vis), espectroscopia infravermelha, espectroscopia Raman e ressonância magnética nuclear.
Tipo de espectroscopia
Tipo de radiação
Interações
Comprimento de onda
espectroscopia de raios ϒ
raios ϒ
Núcleos atômicos
< 0,1nm
Espectroscopia de fluorescência de raios X
X – raios
Elétrons da camada interna
0,01 – 2,0 nm
Espectroscopia UV a vácuo
Ultravioleta (UV)
Ionizacao
2,0 – 200 nm
Espectroscopia UV-Vis
Vis UV
Elétrons de valência
200 – 800 nm
Espectroscopia infravermelha e Raman
Infravermelho
Vibrações moleculares
0,8 – 300mm
Espectroscopia de microondas
Microondas
Rotações moleculares
1 mm a 30 cm
Espectroscopia de ressonância de spin eletrônico
Rotação do elétron
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear
Ondas de rádio
Rotação nuclear
0,6 – 10m
Quais são as diferentes interações moleculares na região UV?
A absorção da luz UV resulta em transições eletrônicas de níveis de energia mais baixos para níveis de energia mais altos. A absorção da radiação ultravioleta em moléculas orgânicas é restrita a certos grupos funcionais (cromóforos) que contêm elétrons de valência de baixa energia de excitação. As transições/interações moleculares que ocorrem devido à absorção de UV são:
π- π* (transição de estrela pi para pi) – ligação ao orbital anti-ligação
n - π* (transição de estrela n para pi) – orbital não-ligante para anti-ligante
Essas transições precisam de um grupo insaturado na molécula para fornecer os elétrons π.
As transições σ (ligação) para σ* (anti-ligação) requerem energia mais alta e, portanto, não podem ser detectadas usando espectroscopia UV-Vis.
Como os grupos funcionais afetam os espectros?
Considere um grupo funcional contendo átomos com um ou mais pares isolados de elétrons que não absorvem radiação ultravioleta/visível. Porém, quando esse grupo funcional está ligado a um cromóforo, altera a intensidade e o comprimento de onda da absorção. Esse fenômeno é chamado de auxocromo ou grupo de realce de cor.
A presença de um auxocromo causa a mudança de posição de um pico ou sinal para um comprimento de onda mais longo, que é chamado de desvio batocrômico ou para o vermelho. Os grupos funcionais que contribuem para os grupos batocrómicos são substituintes tais como grupos metilo, hidroxilo, alcoxi, halogéneo e amino.
O auxocromo que causa a mudança de posição de um pico ou sinal para um comprimento de onda mais curto é chamado de mudança hipsocrômica ou azul. Na verdade, a combinação de cromóforo e auxocromo comporta-se como um novo cromóforo com máximos de absorção diferentes ( λmax ). Por exemplo, o benzeno mostra λ max em 256 nm, enquanto a anilina mostra λ max em 280 nm. Conseqüentemente, o grupo NH 2 atua como um auxocromo e causa a mudança de λ max para um valor maior.
Qual é a diferença entre largura de banda espectral e resolução na espectroscopia UV/VIS?
A largura de banda espectral (SBW) de um espectrofotômetro está relacionada à largura da fenda física e à dispersão óptica do sistema monocromador. Resolução é a capacidade de um instrumento de separar a luz em regiões de comprimento de onda distintas e finitas e de distinguir cada região finita. A largura de banda espectral é normalmente usada para instrumentos de varredura, enquanto a resolução é normalmente usada para instrumentos de matriz.
Para a maioria dos propósitos quantitativos da farmacopeia, uma largura de banda espectral inferior a 2 nm é suficiente e os critérios de aceitação para a razão são 1,3. A resolução espectral pode ser usada para comparação com a largura de banda espectral.
A tabela mostra a resolução dos espectrofotômetros UV/VIS Excellence da METTLER TOLEDO, que é medida usando tolueno em hexano, e o SBW equivalente.
Instrumento
Resolução espectral
SBW equivalente (nm)
UV5
> 1,5
<2,0
UV5Bio
> 1,5
<2,0
UV5Nano
> 1,7
<1,5
UV7
> 1,9
≤ 1,0
Quais são as diferentes fontes de luz usadas em um espectrofotômetro UV/VIS?
A melhor fonte de luz seria aquela que fornecesse boa intensidade com baixo ruído em todos os comprimentos de onda ultravioleta e visível e oferecesse estabilidade por um longo período. Há uma variedade de fontes de luz que são comumente empregadas conforme mencionado abaixo.
Fonte de luz
Faixa de comprimento de onda
(nm)
Região
Vida
Lâmpada de filamento de tungstênio
350 – 2500
VIS + IR
3.000 horas
Lâmpada de arco de deutério
190 – 400
ultravioleta
1.000 horas
Lâmpada de hidrogênio
190 – 400
ultravioleta
1.000 horas
Lâmpada de flash de xenônio
190 – 1100
UV + VIS + NIR
5.500 horas*
* Corresponde a flashes de 50 Hz em operação constante
Como a rede de difração é melhor do que um prisma?
Prismas e redes de difração são elementos dispersivos típicos. Um prisma atinge dispersão devido à diferença no índice de refração do material de acordo com o comprimento de onda. No entanto, uma rede de difração utiliza a diferença na direção de difração para cada comprimento de onda devido à interferência. Tanto os prismas quanto as redes de difração podem espalhar espectros de luz em muitas cores para análise. No entanto, uma rede de difração é menos sensível à cor da luz e pode espalhar as cores em um ângulo maior do que um prisma. O vidro de um prisma é transparente à luz visível, mas absorve e bloqueia a luz na parte infravermelha e ultravioleta do espectro. Uma rede de difração com algumas centenas de linhas por polegada pode desviar a luz no meio do espectro visível em pelo menos 20 graus. O ângulo de deflexão de um prisma de vidro é geralmente muito menor que isso.
Quais compostos inorgânicos podem ser medidos por espectroscopia UV-VIS?
As moléculas podem ser analisadas por espectroscopia UV-Vis se possuírem algum grupo funcional ou conjugação, ou se produzirem um complexo de cores. Como os compostos inorgânicos não contêm nenhum grupo funcional ou conjugação, o método comum para analisá-los é por reação com um composto adequado. Isto produz um complexo de cores cuja absorvância pode ser medida fotometricamente na região visível e correlacionada com a sua concentração real. Por exemplo, o ferro é comumente analisado por uma reação com 1,10-fentrolina para produzir um complexo de cor vermelha. A absorvância do complexo é medida a 570 nm para estimar a concentração de ferro.
Como os espectrofotômetros de feixe único e feixe duplo diferem?
A principal diferença entre um espectrofotômetro de feixe único e um espectrofotômetro de feixe duplo é a seguir.
Espectrofotômetro de feixe único: Um único feixe da fonte de luz passa através da amostra
Espectrofotômetro de feixe duplo: O feixe de luz da fonte de luz é dividido em duas partes: uma parte passa pela amostra e a outra parte passa pela referência
A divisão do feixe em um espectrofotômetro de feixe duplo é obtida de duas maneiras:
estaticamente, com espelhos parcialmente transmissores ou um dispositivo similar
atenuando os feixes usando dispositivos ópticos e mecânicos móveis
Como analisar filme de polímero sólido usando UV Vis?
A análise de uma amostra sólida é realizada principalmente estimando sua absorbância, transmitância e refletância. Os parâmetros comuns determinados para polímeros sólidos incluem % de transmitância, comprimento de onda de corte e índice de amarelecimento. A amostra é montada em um suporte projetado especificamente para amostras sólidas e as leituras são feitas da mesma maneira que para amostras líquidas. Um porta-amostras sólido permite a medição de amostras sólidas, como filmes ou vidro.
A temperatura afeta a análise UV-VIS?
A temperatura afeta os valores de absorção. Diferentes solventes sofrem diferentes interações em diferentes temperaturas. Os parâmetros da solução que mudam devido às mudanças de temperatura são:
Taxa de reação. A taxa muda quando a temperatura é elevada. Isto pode causar uma alteração na atividade da amostra. As reações enzimáticas/biomoleculares são muito sensíveis à temperatura.
Solubilidade de um soluto. A solubilidade é afetada pelas variações de temperatura. A baixa solubilidade pode resultar em absorção imprecisa.
Expansão ou contração do solvente. Isto pode levar a uma alteração na concentração da solução e afectar a absorvância, uma vez que a absorvância está linearmente relacionada com a concentração.
Efeito Schlieren. Este efeito pode ocorrer com mudanças de temperatura, levando a uma série de correntes convectivas que podem alterar a absorção real.
Parâmetros de desempenho óptico, como ruído fotométrico, precisão/repetibilidade do comprimento de onda, repetibilidade fotométrica e luz difusa, não são influenciados pela temperatura dentro de uma faixa de 10 a 40 °C.
Considerando que parâmetros ópticos como resolução fotométrica (relação tolueno/hexano) e comprimentos de onda de precisão fotométrica (K 2 Cr 2 O 7 em HClO 4 ) mostram uma dependência de temperatura variando de 0,014 a -0,034/unidade dentro de 10 – 40 °C.
O controle de temperatura para espectrofotometria UV-VIS pode ser alcançado usando sistemas de termostato de alto desempenho como CuveT e CuvetteChanger. Saiba mais aqui .
O que é luz difusa?
A luz difusa é definida como a luz que atinge o detector que não provém da fonte de luz do instrumento e não segue o caminho óptico, causando um desvio no comprimento de onda correspondente. Portanto, a intensidade da luz medida pelo detector é maior do que realmente deveria ser. Por outro lado, isto também significa que a absorvância medida é inferior à absorvância verdadeira porque é reduzida pela contribuição da luz difusa. Este efeito é mais proeminente em valores de absorvância mais elevados (altas concentrações de amostra).
Baixe o informativo técnico para saber mais sobre a origem e a medição precisa da luz difusa:
Por que o compartimento de amostras nos espectrofotômetros UV Vis Array está aberto?
O compartimento de amostras nos espectrofotômetros de matriz UV Vis é aberto devido ao fato de que os instrumentos de matriz usam óptica reversa e a detecção simultânea de todos os comprimentos de onda do espectro.
Óptica reversa: A luz é difratada depois de passar pela amostra. Devido a isso, apenas uma pequena fração da luz ambiente externa contribui para o sinal em uma determinada região de comprimento de onda.
Detecção simultânea: Usando um detector de matriz que fornece 2.048 sinais de intensidade de luz ao mesmo tempo, o espectro completo é registrado em um segundo. Como a medição é muito rápida, o efeito da luz ambiente é significativamente reduzido.
Aplicações
Baixe os guias de aplicação específicos para espectroscopia UV-Vis abaixo
