UV Vis spektroskopisi, ultraviyole (UV) ve görünür (Vis) ışığın farklı dalga boylarında bir numune tarafından emilen veya iletilen ışık miktarını ölçmek için kullanılan bilimsel bir tekniktir.
İşlem, bir UV Vis ışık demetinin numuneden geçirilmesini ve içinden geçen ışık miktarının ölçülmesini içerir. Bilim insanları, ışığın emilim ve iletim modelini analiz ederek numunenin bileşenlerini tanımlayabilir ve miktarını belirleyebilir.
Bir madde belirli bir dalga boyunda maksimum ışığı emdiğinde, madde ile UV Vis spektrumu arasında benzersiz bir ilişki vardır. Bu ilişki aşağıdakiler için kullanılabilir:
Kalitatif analiz, yani belirli maddelerin varlığının belirlenmesi.
Kantitatif analiz, yani belirli maddelerin miktarlarının belirlenmesi.
UV Vis spektrofotometrisi, kimya, biyoloji ve fizik dahil olmak üzere birçok bilim alanında, malzemelerin özelliklerini ve ışıkla etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca endüstride ilaç, gıda ve kozmetik gibi malzemelerin kalite kontrolü ve analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu sayfa size UV Vis Spektroskopisi ve uygulamaları hakkında temel bilgiler verecektir.
UV Vis temelleri ve uygulamaları hakkındaki cevaplarınızı aşağıdaki bölümlerden alabilirsiniz:
UV Vis spektroskopisi, bir numunenin ultraviyole (UV) ve görünür (Vis) aralıklarda çeşitli dalga boylarında elektromanyetik ışınlarla aydınlatıldığı bir absorpsiyon spektroskopisi türüdür. Maddeye bağlı olarak, UV veya görünür ışık ışınları numune tarafından kısmen emilir. Kalan ışık, yani iletilen ışık, uygun bir dedektör tarafından dalga boyunun bir fonksiyonu olarak kaydedilir. Dedektör daha sonra numunenin benzersiz UV Vis spektrumunu (absorpsiyon spektrumu olarak da bilinir) üretir.
UV Vis spektroskopisinin temelleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için METTLER TOLEDO "Spektrofotometri Uygulamaları ve Temelleri" kılavuzunu indirin
Işık bir nesneye çarptığında, tipik olarak emilen ışığın dalga boyu nesnedeki elektronik bir uyarıma karşılık geldiği için nesne tarafından emilebilir. Geriye kalan ışık iletilir, yani nesnenin içinden geçer.
Bir spektrofotometrede geçirgenlik, bir numuneden (I) geçen ışığın yoğunluk spektrumunun, boşluktan geçen ışığın yoğunluk spektrumuna (I0) bölünmesiyle ölçülür.
Absorbans / Geçirgenlik Dönüştürücü
=
Optik yoğunluk (OD) olarak da bilinen absorbans (A), nesne tarafından emilen ışık miktarıdır ve aşağıdaki gibi ifade edilebilir
Geçirgenlik (T)
UV Vis spektroskopisi teknikleri hakkında temel bilgiler hakkında daha fazla bilgi edinmek için "Spektrofotometri Uygulamaları ve Temelleri" kılavuzunu indirin.
Beer-Lambert Yasası Nedir?
Beer-Lambert Yasası, bir çözelti tarafından emilen enerji miktarının yol uzunluğu ve konsantrasyon ile orantılı olduğunu belirtir. Basitçe söylemek gerekirse, daha konsantre bir çözelti, seyreltik bir çözeltiden daha fazla ışık emer.
Beer yasasının matematiksel ifadesi şöyledir:
A = ϵ.d.c
Burada ϵ = molar absorptivite, d = yol uzunluğu ve c = konsantrasyondur. Molar absorptivite, numunenin belirli bir dalga boyunda ışığı absorbe etme kabiliyeti ile ilgili benzersiz bir fiziksel sabittir. ϵ, L-mol-1-cm-1 birimine sahiptir.
UV Vis spektroskopisinin temelleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için METTLER TOLEDO "Spektrofotometri Uygulamaları ve Temelleri" kılavuzunu indirin
Tarama ve Dizi Spektrofotometreleri Arasındaki Fark Nedir?
UV Vis spektrofotometresi, Beer-Lambert yasasını kullanarak UV Vis bölgesindeki absorbansı ölçmek için tasarlanmış bir cihazdır. Bir küvetteki numune çözeltisinden geçen ışığın yoğunluğunu ölçer ve bunu numuneden geçmeden önceki ışığın yoğunluğuyla karşılaştırır.
Bir UV Vis spektrofotometresinin ana bileşenleri bir ışık kaynağı, bir numune tutucu, ışığın farklı dalga boylarını ayırmak için bir dağıtıcı cihaz ve uygun bir dedektördür.
Taramalı Spektrofotometre
Geleneksel taramalı spektrofotometreler, tanımlanan her dalga boyunda ardışık geçirgenlik ölçümleri alma prensibine göre çalışır. Işık, bir kırınım ızgarası tarafından farklı dalga boylarına bölünür. Kırınım ızgarası ile dedektör arasına bir örnek küveti yerleştirilir.
Array Spektrofotometre
Bir dizi spektrofotometresinde, numune bir süreklilikle, yani ışığın tüm spektral bileşenleriyle aynı anda aydınlatılır, böylece farklı dalga boylarındaki ışığı aynı anda emer. İletilen ışık daha sonra bir yansıma ızgarası tarafından kırılır. Bu cihaz, UV Vis spektrumunun geleneksel bir taramalı spektrofotometre kullanılarak elde edilebileceğinden daha hızlı elde edilmesine yardımcı olur.
Taramalı bir spektrofotometre ile karşılaştırıldığında, bir dizi spektrofotometresinde hareketli parça yoktur.
Daha fazla bilgi edinmek için "Taramaya Karşı Dizi" bölümünü indirin. Bu teknik doküman, iki yerleşik UV Vis spektrofotometre kurulumunu karşılaştırmakta, performanslarını ve faydalarını değerlendirmektedir.
Bir spektrofotometri cihazı, özellikle klinik, farmasötik veya endüstriyel kalite kontrolde kritik UV Vis ölçümleri için spesifikasyonuna göre performans göstermelidir. Bu nedenle, performans doğrulaması düzenli olarak yapılmalıdır. Kalibrasyon sonuçları da kaydedilmeli ve saklanmalıdır.
Ph. Eur. 10 ve USP42 NF37'de bulunan UV Vis bölüm revizyonlarına göre kalibrasyonun önemi hakkında bilgi edinmek için "UV Vis Laboratuvarları Spektrofotometre Kalibrasyonunu Nasıl Yapmalıdır? 10 ve USP42 NF37.
Renkler dünyamızı daha ilginç hale getirir. Bir nesneyi gördüğümüzde, nesneden yansıyan ışık gözümüze girer ve retinadaki çeşitli fotoreseptörler tarafından toplanır. Fotoreseptör duyarlılığına bağlı olarak, farklı insanlar aynı rengi farklı algılayabilir.
Belirli bir rengin doğruluğunu evrensel olarak kabul etmek için sayısal değerler atanmalıdır. Kısacası, spektrofotometreler ve kolorimetreler gibi ölçüm ekipmanları, renk belirleme doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için renk sonuçlarını değerler olarak verir.
Spektrofotometreler, bir numuneden geçen dalga boylarını toplayıp filtreleyerek renk verilerini ölçer. Rengi bir renk skalasına eşlemek için spektral verilere matematiksel bir denklem uygulanır.
Bir CIE (Commission internationale de l'éclairage) renk ölçeği üç parametre kullanılarak tanımlanır: ton, kroma ve açıklık.
Ton , bir nesnenin baskın rengidir. Birincil ve ikincil renkler birleşerek tonu oluşturur.
Doygunluk olarak da bilinen kroma, bir rengin ne kadar canlı veya donuk olduğunu tanımlar.
Açıklık , rengin ışık yoğunluğudur (koyu veya açık olması).
Her bir CIE renk sistemi, bir rengi bir ölçek üzerinde konumlandırmak için üç koordinat kullanır. Üç ana renk ölçeği Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* ve CIE L*u*v*'dir.
Örneğin, bir renk CIE L*a*b* olarak ifade edildiğinde:
L* açıklığı tanımlar
a* kırmızı/yeşil değerini gösterir
b* sarı/mavi değerini ifade eder
CIE L*a*b* renk skalasını kullanarak, resimde görülen gülün kırmızısı için koordinatlar şöyle olacaktır:
L* = 29.00, a* = 52.48, b* = 22.23
Renk ölçümünün temelleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kılavuzu indirin.
Tüketiciler için genel olarak başarılı bir görsel deneyim sağlamak, satın alma kararını etkileyebilir. Bu nedenle renk, marka kimliği ve ürün tutarlılığının tanımlanmasında önemlidir.
Endüstriyel standartlara göre bir ürünü benzersiz bir şekilde tanımlamak için farklı renk skalaları oluşturulmuştur. Bu ölçekler şunları içerir:
Ölçek
Standart
Uygulamalar
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Yakıtın (gazyağı, benzin, dizel, nafta, vb.) kirlenip kirlenmediğini veya depoda bozulup bozulmadığını belirlemek için
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Su, kimya, petrol ve plastik endüstrilerinde saflık kontrolleri için bir metrik olarak kullanılan sarılık indeksi
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Isıtma yoluyla renk kazanan reçineler, yağ asitleri, vernikler ve kuruyan yağlar gibi ürünleri test etmek için
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Aroma & koku ve yiyecek & içecek endüstrileri için kalite kontrol
Bira, malt, karamel vb. ürünlerin EBC birimlerinde renk yoğunluğunu ve bulanıklığını (pus) ölçmek için.
USP/EUP
USP-24 Monograf 631, EP yöntemi 2.2.2
İlaçların kalite kontrolü
Hess-Ives
DGK test yöntemi F 050.2
Kimyasalları ve yüzey aktif sıvıları test etmek için kullanılır (özellikle kozmetik endüstrisinde)
4. UV Vis Spektrofotometresi Kullanılarak Mikrovolüm Analizi
UV Vis Spektroskopisinde Mikrovolüm Analizi Nasıl Yapılır?
Mikro hacimli bir spektrofotometre 1 µl kadar düşük örnek hacimlerini ölçer. Bir numunedeki nükleik asit konsantrasyonu genellikle mililitre başına nano veya mikrogram mertebesindedir.
Bu tür mikro hacimleri seyreltmek ve doğru sonuçlar almak zordur. Bu nedenle, nükleik asitlerin aşağı akış analizi için seyreltme olmaksızın mikroanaliz önem kazanmaktadır.
Nükleik asitlerin analizi sırasında mikro hacimli numune kaide yüzeyindeki ince bölmeye pipetlenir. Lamba kaynağından gelen ışık demeti fiber optikler tarafından mikro hacimli platforma yönlendirilir. Yol uzunluğu bir milimetre mertebesine düşürüldüğünden, daha yüksek analit konsantrasyonu çoklu seyreltmeler olmadan hassas bir şekilde analiz edilebilir.
Mikro hacimli bir sistem, numuneyi kaide platformunda tutmak ve düşük hacimlerde numunelerin gerçek zamanlı absorbansını belirlemek için numunenin doğal özellikleriyle (yüzey gerilimi gibi) birlikte fiber optik teknolojisini kullanır.
Bu avantajlar sayesinde mikro hacim analizi, biyomoleküler analiz için ideal bir seçim haline gelmektedir.
Mikro hacim analizine ilişkin ipuçları ve püf noktaları için "Nükleik Asit Analizlerinde İyi UV/VIS Uygulamaları ile İş Akışı Doğruluğunu En Üst Düzeye Çıkarın" başlıklı isteğe bağlı web seminerine katılın.
Nükleik Asitlerin Kalite Kontrolü Nükleik asit miktar tayini, Yeni Nesil Dizileme (NGS), Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), Gerçek Zamanlı PCR (kantitatif PCR; qPCR), klonlama ve transfeksiyon gibi birçok moleküler biyoloji testinde doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek için önemli bir ön analitik yöntemdir.
Nükleik asitlerin saflığı ve konsantrasyonu belirlenerek nükleik asitlerin kalitatif ve kantitatif kontrolü gerçekleştirilebilir.
DNA Analiz Yöntemleri A260 nükleotid konsantrasyonunun korelasyonunu verirken A280 kalan proteinlerin korelasyonunu verir. Tirozin ve triptofan amino asitleri 280 nm'de absorbe olurken fenilalanin 260 nm'de iyi absorbe olur. Bu, doğrudan absorbans ölçümleri kullanılarak DNA saflığı için A260/A280 oranının hesaplanmasını sağlar. İyi kalitede DNA'nın A260/A280 oranı 1,7-2,0 olacaktır.
Protein Miktar Tayini Testleri Toplam protein miktarının belirlenmesinde kullanılan farklı yöntemler arasında A280, Bicinchoninic acid (BCA), Bradford, Lowry, Pierce ve diğer yeni analizler yer almaktadır. Çözeltilerdeki proteinler, aromatik halkalı amino asitler nedeniyle 280 nm'de maksimuma ve peptit bağlarının varlığı nedeniyle 220 nm civarında minimuma sahiptir.
Konsantrasyon Warburg formülü kullanılarak hesaplanır:
Protein konsantrasyonu (mg/ml) = 1,55 X (A280 okuma) - 0,76 X (A260 okuma)
UV Vis spektroskopisi ile DNA analizi hakkında daha fazla bilgi edinmek için uygulama editörü "260/280 Oranı "nı indirin: Protein Kontaminasyonunun Göstergesi".
UV Vis Ölçümlerinde ve Kalibrasyonunda Sık Karşılaşılan Hatalar Nelerdir?
UV Vis ölçümlerinde iyi doğruluk ve hassasiyet, hataları önlemek için önlemler alınarak elde edilebilir. UV Vis ölçümleri yapılırken dikkate alınması gereken tipik hata riskleri şunları içerir:
Spektral özellikler. Spektral karakterizasyon kalibrasyon işlemi sırasında gerçekleştirilir. Hatalı sonuçlara yol açabilecek başlıca faktörler dalga boyu doğruluğu, spektral bant genişliği, kaçak ışık ve doğrusallıktır.
Fotometrik özellikler. Fotometrik özellikler, ışık kaynağının spektral hassasiyetini, ışık kaynağının ve dedektörün sıcaklığa bağlı hassasiyetini vb. içerir.
Optik etkileşimler. Lamba kaynağının radyasyonları küvet malzemesi ile etkileşime girerek numune absorbansının yoğunluğunu değiştirebilir. Bu tür optik etkileşimler, doğru küvet malzemesi seçilerek önlenebilir.
Çeşitli faktörler. Sıcaklık, hat voltajı dalgalanmaları, titreşimler, kontaminasyon veya numunenin fotometre tarafından ısıtılması gibi diğer faktörler de ölçümleri olumsuz etkiler.
GUVP™
Tüm hatalardan kaçınılamasa da, daha iyi sonuçlar için hatalar en aza indirilebilir.
'İyi UV/VIS Uygulamaları "UV/Vis Spektroskopisi için Güvenilir Sonuçlar" broşürünü indirin.
Doğru küvetin seçilmesi, numunenize ve cihazınıza bağlı olarak doğru malzemenin ve doğru boyutun seçilmesini içerir.
Küvet malzemesi belirli bir dalga boyunda yeterli bir geçirgenliğe sahip olmalıdır. Küvet duvarlarındaki ışık zayıflaması analizin sonucunu etkilememelidir. Cam küvetler, radyasyonu emdikleri için 370 nm'nin altındaki analizler için UV bölgesinde kullanılmaz. Bunların sadece görünür bölgede kullanılması tavsiye edilir.
Aşağıdaki çizelge küvetlerin kullanılabilir iletim aralıklarını vermektedir:
Malzeme
Teorik iletim aralığı (nm)
Uzak UV kuvars
170-2700
Optik cam
320-2500
Yakın IR kuvars
220-3800
UV silika
220-2500
UV plastik
220-900
Tek kullanımlık PS hücresi
340-750
Tek kullanımlık PMMA hücre
285-750
Küvetlerin boyutu da ölçüm kabiliyetlerini etkiler. Küvetin nominal radyasyon yolu uzunluğu 10 mm'dir. Numunelere bağlı olarak, uzunluk 1 mm'den 100 mm'ye kadar değişebilir.
Standart küvetler, incelenen numunelerin çoğu için kullanılabilir. Yaygın absorpsiyon ve floresan küvetleri 12,5 mm x 12,5 mm dış tabana, 45 mm yüksekliğe ve 10 mm x 10 mm iç boyutlara sahiptir.
Uzun yollu küvetler (yol uzunluğu 10 mm'den fazla olan küvetler) numune çok seyreltik olduğunda veya numune buharlaştığında ya da ölçüm işlemi sırasında kimyasal bir değişime uğradığında kullanılır.
Kısa yollu küvetler (yol uzunluğu 10 mm'den az olan küvetler) absorbansın yüksek olduğu ve seyreltmenin zor olduğu durumlarda kullanılır.
Küvetler nasıl doğru şekilde taşınır?
Küvetleri taşırken her zaman buzlu taraflarını kullanarak taşıyın. Parmak izleri önemli ölçüde absorbansa neden olabileceğinden ve dolayısıyla doğruluğu etkileyebileceğinden, şeffaf optik yüzeylere parmaklarınızla dokunmaktan kaçının.
Küveti doldurmak için cam pastör pipetleri kullanmaktan kaçının çünkü bunlar optik yüzeyi çizerek daha fazla parazite neden olabilir. Tek kullanımlık plastik uçlu pipetler tavsiye edilir.
Küvetlerin temizliği sonuçlar üzerinde büyük bir etkiye sahiptir, bu nedenle bunu çok önemli bir faktör olarak değerlendirmeliyiz.
Kuvars küvetlerin derinlemesine temizlenmesi için aşağıdaki adımlar önerilir:
Küvetlerin temizleme solüsyonu içinde bekletilmesi.
Temizleme solüsyonunu çıkarın ve küvetleri deiyonize su ile durulayın.
Protein durumları hariç, küvetleri etanol veya aseton ile yıkayın (aşağıdaki tabloya bakın).
Tüy bırakmayan bir mendille silerek ve ardından havayla kurutarak veya fırında kurutarak küvetleri kurutun.
Aşağıdaki çizelge küvetlerin kullanılabilir iletim aralıklarını vermektedir.
Sulu çözeltiler
Organik moleküller
Partikülleri çıkarmak zor
Proteinler
Ağır metaller
Yağ asitleri
Temizlik çözümleri
Hacimce eşit miktarda 3 M HCl ve etanol
50 nitrik asit ile yıkayın
Konsantre HNO3 veya 2 M HCl
Hacimce eşit miktarda etanol ve 3 M HCl
Tripsin ile oda sıcaklığında inkübe edin
(Etanol ve aseton temizlik için önerilmez.)
Hacimce eşit miktarda sülfürik asit 2 M ve %50 deiyonize su
Aqua regia
Hacimce eşit miktarda IPA ve Deiyonize su
Islatma süresi*
10 dakika
10 dakika
30 saniye
Gece boyunca
20 dakika
Silin
*Tabloda belirtilen ıslatma süresi kaba bir tahmindir; ancak küvetleri yalnızca lekeler/kirleticiler çıkana kadar ıslatmanız önerilir.
Cam küvetler, küvetler aseton veya etanol ile durulanarak ve ardından su ile durulanarak temizlenebilir. Havayla kurutma önerilir.
Plastik küvetler deiyonize su ile birkaç kez yıkanabilir. Plastik küvetlerin kimyasallarla yıkanması önerilmez.
Laboratuvar Cihazlarınızı Temiz Tutmak İçin İpuçları ve Püf Noktaları İçeren Poster Koleksiyonumuzu İndirin
Mikro Hacim Spektrofotometrelerinin Kullanımı için İyi Uygulamalar
Numuneyi hazırlayın Seyreltilmiş biyolojik numune konsantrasyonları için cihaz hassasiyeti düşük olabilir. Bu tür numunelerin hassasiyetini artırmak için daha yüksek konsantrasyonda numune almayı düşünün. Mikro hacim ölçümleri tipik olarak 1-2 µl örnek hacmine ihtiyaç duyar. Numune almak için kalibre edilmiş pipetler kullanın. Homojen bir numunenin hazırlanmasına ve analiz için alınmasına dikkat edilmelidir.
Mikro hacim platformunu temizleyin Mikro hacim kaide yüzeyinin ve aynanın düzgün bir şekilde temizlendiğinden emin olun. Yüzeyleri deiyonize su kullanarak tiftiksiz bir mendille silmeniz yeterlidir. Tampon çözeltisi, deterjan veya yapışkan bir numune kullanıyorsanız, bir sonraki numuneye geçmeden önce yüzeyi birkaç kez temizleyin.
Numuneyi platform üzerine yerleştirin Kabarcık oluşumunu önlemek için numuneyi yavaş ve sabit bir şekilde yüzeye yerleştirin.
Tespit limitleri dahilinde çalışın Cihazın en düşük ve en yüksek tespit limitlerini bilin ve bu aralıkta çalışın.
Doğru UV Vis Ölçümleri için Genel Uygulamalar
Numuneyi hazırlarken ve bir küvete veya mikrovolüm platformuna pipetlerken dikkatli olun. Numune homojen olmalıdır.
Numunede asılı katı partiküller varsa ışık saçılabilir. Bu gibi durumlarda, numuneyi bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
Numuneyi, numune tutucunun z boyutunu dikkate alarak bir küvete doldurun. Bu, ışığın numunenin içinden geçmesini sağlayacaktır. z boyutu, bir küvetin tabanından ışık demetinin numunenin içinden geçtiği yüksekliğe kadar olan mesafedir.
Her ölçümden önce küveti tüy bırakmayan bir mendille temizleyin. Her seferinde yeni doku kullanın.
Numune hazırlamada kullanılan aynı çözücü/çözelti tamponunu boş olarak kullanın.
6. UV Vis Spektroskopisinin Çeşitli Sektörlerdeki Uygulamaları Nelerdir?
UV Vis spektroskopisi, çeşitli endüstrilerde geniş bir uygulama yelpazesine sahip çok yönlü bir analitik tekniktir. UV Vis spektroskopisinin farklı endüstrilerdeki önemli uygulamalarından bazıları şunlardır:
Yiyecek & İçecek
UV Vis spektroskopisi, gıda ve içecek ürünlerinin kalitesini ve bileşimini belirler. Gıda ürünlerinin rengini (örn. şarap), lezzetini ve aromasını analiz etmenin yanı sıra kirletici veya tağşiş edici maddelerin varlığını tespit etmek için de kullanılabilir.
Farmasötik
UV Vis spektroskopisi, ilaçların ve diğer farmasötik ürünlerin saflığını, konsantrasyonunu ve kimliğini analiz eder. Ayrıca farmasötiklerin zaman içindeki stabilitesini izlemek için de kullanılır.
Kozmetik ürünleri
Formülasyonlar için ajanların fotostabilitesinin değerlendirilmesi, UV engelleyici ajanın partikül karakterizasyonu, renk indeksinin değerlendirilmesi, tağşişin tespit edilmesi (parfüm endüstrisi), optik özelliklerin incelenmesi, boyaların, antioksidanların vb. miktarının belirlenmesi.
Petrokimya
Ham petrolün karakterizasyonu, asfalten fraksiyonlarının hesaplanması, aromatik içerik için indekslerin formülasyonu, ham petrol gravitesinin kalitesi, kükürt içeriği, Hildebrand çözünürlük faktörünün hesaplanması (Bitüm, ağır ve şeyl yağları ve sıvı katalitik kraking, koklaştırma veya kömür sıvılaştırmasından elde edilen yağlara genişletilmiştir)
Kimyasal
Kimyasal özelliklerin belirlenmesi, bitmiş ürünün nihai kalite değerlendirmesi, polimer bileşiminin incelenmesi, atık suyun nitelendirilmesi, saflık ve boyama verimliliğinin belirlenmesi, polimerlerin / boyaların fotokatalitik bozunması, toprak veya sudaki pestisit kalıntıları
Biyoteknoloji
Nükleik asit konsantrasyonu ve saflığı, proteinler (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), mikrobiyal hücre kültürü ölçümleri, proteinin denatürasyonu, kinetik çalışmalar (enzimatik aktivite), kan, plazma, serum gibi biyolojik örnekler vb.
METTLER TOLEDO, çok çeşitli onaylanmış uygulama metotları sunar. Çevrimiçi arama motorumuzu kullanarak ihtiyaçlarınıza en uygun uygulamayı bulun.
Farklı spektroskopik teknikler temel olarak kullandıkları radyasyon, enerji ve malzeme arasındaki etkileşim ve kullanıldıkları malzeme ve uygulama türüne göre ayrılır. Kimyasal analiz için yaygın olarak kullanılan spektroskopik teknikler atomik spektroskopi, ultraviyole ve görünür spektroskopi (UV Vis spektroskopisi), kızılötesi spektroskopi, Raman spektroskopisi ve nükleer manyetik rezonanstır.
Spektroskopi Türü
Radyasyon Türü
Etkileşimler
Dalga boyu
ϒ-ışını spektroskopisi
ϒ-ışınları
Atom çekirdeği
< 0,1 nm
X-ışını floresan spektroskopisi
X - ışınları
İç kabuk elektronları
0.01 - 2.0 nm
Vakum UV spektroskopisi
Ultraviyole (UV)
İyonizasyon
2.0 - 200 nm
UV Vis spektroskopisi
UV Vis
Değerlik elektronları
200 - 800 nm
Kızılötesi ve Raman spektroskopisi
Kızılötesi
Moleküler titreşimler
0,8 - 300 mm
Mikrodalga spektroskopisi
Mikrodalgalar
Moleküler rotasyonlar
1 mm ila 30 cm
Elektron spin rezonans spektroskopisi
Elektron spini
Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi
Radyo dalgaları
Nükleer spin
0.6 - 10 m
UV Bölgesindeki Farklı Moleküler Etkileşimler Nelerdir?
UV ışığının emilimi, düşük enerji seviyelerinden daha yüksek enerji seviyelerine elektronik geçişlerle sonuçlanır. Organik moleküllerde ultraviyole radyasyonun emilimi, düşük uyarılma enerjisine sahip değerlik elektronları içeren belirli fonksiyonel gruplarla (kromoforlar) sınırlıdır. UV absorpsiyonu nedeniyle gerçekleşen moleküler geçişler/etkileşimler şunlardır:
π- π* (pi'den pi yıldızına geçiş) - bağdan anti-bağ orbitaline
n - π* (n'den pi yıldızına geçiş) - bağ yapmayan orbitalden bağ karşıtı orbitallere
Bu geçişler, π elektronlarını sağlamak için molekülde doymamış bir gruba ihtiyaç duyar.
σ (bağlanma) - σ* (anti-bağlanma) geçişleri daha yüksek enerji gerektirir ve bu nedenle UV Vis spektroskopisi kullanılarak tespit edilemez.
Fonksiyonel Gruplar Spektrumları Nasıl Etkiler?
Ultraviyole/görünür radyasyonu absorbe etmeyen bir veya daha fazla yalnız elektron çiftine sahip atomlar içeren bir fonksiyonel grup düşünün. Bununla birlikte, bu fonksiyonel grup bir kromofora bağlandığında, absorpsiyonun yoğunluğunu ve dalga boyunu değiştirir. Bu olguya auxochrome veya renk arttırıcı grup denir.
Bir yardımcı kromun varlığı, bir pikin veya sinyalin konumunun daha uzun bir dalga boyuna kaymasına neden olur ve buna batokromik veya kırmızı kayma denir. Batokromik gruplara katkıda bulunan fonksiyonel gruplar metil, hidroksil, alkoksi, halojen ve amino grupları gibi sübstitüentlerdir.
Bir pikin veya sinyalin daha kısa dalga boyuna kaymasına neden olan yardımcı krom, hipokromik veya mavi kayma olarak adlandırılır. Aslında, kromofor ve yardımcı krom kombinasyonu, farklı bir absorpsiyon maksimumuna (λmax) sahip yeni bir kromofor gibi davranır. Örneğin, benzen 256 nm'de λmax gösterirken, anilin 280 nm'de λmax gösterir. Dolayısıyla, NH2 grubu bir yardımcı krom gibi davranır ve λmax değerinin daha büyük bir değere kaymasına neden olur.
UV Vis Spektroskopisinde Spektral Bant Genişliği ve Çözünürlük Arasındaki Fark Nedir?
Bir spektrofotometrenin spektral bant genişliği (SBW), monokromatör sisteminin fiziksel yarık genişliği ve optik dağılımıyla ilgilidir. Çözünürlük, bir cihazın ışığı sonlu, farklı dalga boyu bölgelerine ayırma ve her bir sonlu bölgeyi ayırt etme yeteneğidir. Spektral bant genişliği tipik olarak tarama cihazları için kullanılırken, çözünürlük tipik olarak dizi cihazları için kullanılır.
Çoğu farmakope kantitatif amaçları için, 2 nm'den daha az bir spektral bant genişliği yeterlidir ve oran için kabul kriteri 1,3'tür. Spektral çözünürlük, spektral bant genişliği ile karşılaştırma için kullanılabilir.
Tabloda, METTLER TOLEDO'nun UV/VIS Excellence spektrofotometrelerinin hekzan içinde toluen kullanılarak ölçülen çözünürlüğü ve eşdeğer SBW gösterilmektedir.
Enstrüman
Spektral çözünürlük
Eşdeğer SBW (nm)
UV5
> 1.5
< 2.0
UV5Bio
> 1.5
< 2.0
UV5Nano
> 1.7
< 1.5
UV7
> 1.9
≤ 1.0
UV Vis Spektrofotometresinde Kullanılan Farklı Işık Kaynakları Nelerdir?
En iyi ışık kaynağı, tüm ultraviyole ve görünür dalga boylarında düşük gürültü ile iyi yoğunluk sağlayan ve uzun bir süre boyunca stabilite sunan bir kaynak olacaktır. Aşağıda belirtildiği gibi yaygın olarak kullanılan bir dizi ışık kaynağı vardır.
Işık Kaynağı
Dalga Boyu Aralığı
(nm)
Bölge
Ömür boyu
Tungsten filamanlı lamba
350 - 2500
VIS + IR
3,000 saat
Döteryum ark lambası
190 - 400
UV
1,000 saat
Hidrojen lambası
190 - 400
UV
1,000 saat
Xenon flaş lambası
190 - 1100
UV + VIS + NIR
5.500 saat*
* Sabit çalışmada 50 Hz yanıp sönmeye karşılık gelir
Kırınım Izgarası Prizmadan Nasıl Daha İyidir?
Prizmalar ve kırınım ızgaraları tipik dispersif elemanlardır. Bir prizma, dalga boyuna göre malzeme kırılma indisindeki farklılık nedeniyle dağılım sağlar. Bununla birlikte, bir kırınım ızgarası, girişim nedeniyle her dalga boyu için kırınım yönündeki farkı kullanır. Hem prizmalar hem de kırınım ızgaraları ışık spektrumlarını analiz için birçok renge yayabilir. Ancak, bir kırınım ızgarası ışığın rengine daha az duyarlıdır ve renkleri bir prizmadan daha geniş bir açıya yaymak için yapılabilir. Bir prizmadaki cam görünür ışığa karşı berraktır, ancak spektrumun kızılötesi ve ultraviyole kısmındaki ışığı emer ve engeller. İnç başına birkaç yüz çizgiye sahip bir kırınım ızgarası, görünür spektrumun ortasındaki ışığı en az 20 derece saptırabilir. Bir cam prizmanın saptırma açısı genellikle bundan çok daha küçüktür.
Hangi İnorganik Bileşikler UV Vis Spektroskopisi ile Ölçülebilir?
Moleküller, herhangi bir fonksiyonel gruba veya konjugasyona sahiplerse veya bir renk kompleksi üretiyorlarsa UV Vis spektroskopisi kullanılarak analiz edilebilirler. İnorganik bileşikler herhangi bir fonksiyonel grup veya konjugasyon içermediğinden, bunları analiz etmek için yaygın yöntem uygun bir bileşikle reaksiyona girmektir. Bu, absorbansı görünür bölgede fotometrik olarak ölçülebilen ve gerçek konsantrasyonuyla ilişkilendirilebilen bir renk kompleksi üretir. Örneğin, demir genellikle kırmızı renkli bir kompleks üretmek için 1, 10-fentrolin ile reaksiyona sokularak analiz edilir. Demir konsantrasyonunu tahmin etmek için kompleksin absorbansı 570 nm'de ölçülür.
Tek Işınlı ve Çift Işınlı Spektrofotometrelerin Farkı Nedir?
Tek ışınlı ve çift ışınlı spektrofotometre arasındaki temel fark aşağıdaki gibidir.
Tek ışınlı spektrofotometre: Işık kaynağından gelen tek bir ışın numunenin içinden geçer
Çift ışınlı spektrofotometre: Işık kaynağından gelen ışık demeti iki parçaya ayrılır: bir parça numuneden geçer ve diğer parça referanstan geçer
Çift ışınlı bir spektrofotometrede ışın bölme işlemi iki şekilde gerçekleştirilir:
statik olarak, kısmen ileten aynalar veya benzer bir cihaz ile
hareketli optik ve mekanik cihazlar kullanarak ışınların zayıflatılması
UV Vis Kullanarak Katı Polimer Film Nasıl Analiz Edilir?
Katı bir numunenin analizi temel olarak absorbans, geçirgenlik ve yansıma değerlerinin tahmin edilmesiyle gerçekleştirilir. Katı polimerler için belirlenen yaygın parametreler arasında % geçirgenlik, kesme dalga boyu ve sarılık indeksi bulunur. Numune, katı numuneler için özel olarak tasarlanmış bir tutucuya monte edilir ve okumalar sıvı numunelerde olduğu gibi yapılır. Katı numune tutucu, film veya cam gibi katı numunelerin ölçülmesini sağlar.
Sıcaklık UV Vis Analizini Etkiler mi?
Sıcaklık absorbans değerlerini etkiler. Farklı çözücüler farklı sıcaklıklarda farklı etkileşimlere uğrar. Sıcaklık değişimlerine bağlı olarak değişen çözelti parametreleri şunlardır:
Reaksiyon hızı. Sıcaklık yükseldiğinde hız değişir. Bu, numunenin aktivitesinde bir değişikliğe neden olabilir. Enzimatik/biyomoleküler reaksiyonlar sıcaklığa karşı çok hassastır.
Bir çözünenin çözünürlüğü. Çözünürlük sıcaklıktaki değişimlerden etkilenir. Zayıf çözünürlük kesin olmayan emilimle sonuçlanabilir.
Çözücünün genişlemesi veya daralması. Bu durum çözeltinin konsantrasyonunda bir değişikliğe yol açabilir ve absorbansı etkileyebilir, çünkü absorbans konsantrasyonla doğrusal olarak ilişkilidir.
Schlieren etkisi. Bu etki sıcaklık değişimleriyle ortaya çıkabilir ve gerçek absorbansı değiştirebilecek bir dizi konvektif akıma yol açabilir.
Fotometrik gürültü, dalga boyu doğruluğu/tekrarlanabilirliği, fotometrik tekrarlanabilirlik ve kaçak ışık gibi optik performans parametreleri 10 - 40 °C aralığında sıcaklıktan etkilenmez.
Buna karşın, fotometrik çözünürlük (toluen/hekzan oranı) ve fotometrik doğruluk dalga boyları (K2Cr2O7 in HClO4) gibi optik parametreler 10 - 40 °C aralığında 0,014 ila -0,034/birim arasında değişen bir sıcaklık bağımlılığı göstermektedir.
UV Vis spektrofotometrisi için sıcaklık kontrolü, CuveT ve CuvetteChanger gibi yüksek performanslı termostat sistemleri kullanılarak elde edilebilir. Buradan daha fazla bilgi edinin.
Kaçak Işık Nedir?
Kaçak ışık, dedektöre ulaşan, cihazın ışık kaynağından gelmeyen ve optik yolu takip etmeyen, karşılık gelen dalga boyunda bir sapmaya neden olan ışık olarak tanımlanır. Bu nedenle, dedektör tarafından ölçülen ışık yoğunluğu aslında olması gerekenden daha yüksektir. Tersine, bu aynı zamanda ölçülen absorbansın gerçek absorbanstan daha düşük olduğu anlamına gelir, çünkü kaçak ışığın katkısıyla azalır. Bu etki daha yüksek absorbans değerlerinde (yüksek numune konsantrasyonlarında) daha belirgindir.
Kaçak ışığın kaynağı ve doğru ölçümü hakkında daha fazla bilgi edinmek için teknik dokümanı indirin:
UV Vis Dizi Spektrofotometrelerde Numune Bölmesi Neden Açıktır?
UV Vis dizi spektrofotometrelerindeki numune bölmesi, dizi cihazlarının ters optik kullanması ve spektrumun tüm dalga boylarının aynı anda algılanması nedeniyle açıktır.
Ters optik: Işık numuneden geçtikten sonra kırılır. Bu nedenle, harici ortam ışığının yalnızca küçük bir kısmı belirli bir dalga boyu bölgesindeki sinyale katkıda bulunur.
Eşzamanlı algılama: Aynı anda 2048 ışık yoğunluğu sinyali sağlayan bir dizi dedektör kullanılarak, tam spektrum bir saniye içinde kaydedilir. Ölçüm çok hızlı olduğu için ortam ışığının etkisi önemli ölçüde azalır.
Aplikasyonlar
UV Vis spektroskopisi için özel uygulama kılavuzlarını şimdi indirin
