Baza UV Vis spektroskopije uključujući skale boja, osnove, instrumentaciju i kalibraciju
Molimo opišite svoj projekt. Zahtjev za ponudu /content/hr/hr/home/applications/Application_Browse_Laboratory_Analytics/uv-vis-spectroscopy/uvvis-spectroscopy-explained.fb.1.c.11.html
UV Vis spektroskopija je znanstvena tehnika koja se koristi za mjerenje količine svjetlosti koju apsorbira ili propušta uzorak na različitim valnim duljinama ultraljubičastog (UV) i vidljivog (Vis) svjetla.
Proces uključuje propuštanje zrake UV Vis svjetlosti kroz uzorak i mjerenje količine svjetlosti koja prolazi kroz njega. Analizom obrasca apsorpcije i prijenosa svjetlosti, znanstvenici mogu identificirati i kvantificirati komponente uzorka.
Jedinstveni odnos postoji između tvari i njenog UV Vis spektra kada tvar apsorbira maksimalnu svjetlost na određenoj valnoj duljini. Ovaj odnos se može koristiti za:
Kvalitativna analiza , tj. utvrđivanje prisutnosti određenih tvari.
Kvantitativna analiza , tj. određivanje količine određenih tvari.
UV Vis spektrofotometrija obično se koristi u mnogim područjima znanosti, uključujući kemiju, biologiju i fiziku, za proučavanje svojstava materijala i njihove interakcije sa svjetlom. Također se široko koristi u industriji za kontrolu kvalitete i analizu materijala kao što su lijekovi, hrana i kozmetika.
Ova stranica će vam dati osnovno znanje o UV Vis spektroskopiji i njezinoj primjeni.
Saznajte odgovore o osnovama i primjenama UV Vis-a u sljedećim odjeljcima:
UV Vis spektroskopija je vrsta apsorpcijske spektroskopije u kojoj se uzorak osvjetljava elektromagnetskim zrakama različitih valnih duljina u ultraljubičastom (UV) i vidljivom (Vis) području. Ovisno o tvari, uzorak djelomično apsorbira UV ili vidljive svjetlosne zrake. Preostala svjetlost, tj. propuštena svjetlost, bilježi se u funkciji valne duljine odgovarajućim detektorom. Detektor tada proizvodi jedinstveni UV Vis spektar uzorka (poznat i kao apsorpcijski spektar).
Da biste saznali više o osnovama UV Vis spektroskopije, preuzmite vodič tvrtke METTLER TOLEDO "Spectrophotometry Applications and Fundamentals"
Kada svjetlo udari u objekt, objekt ga može apsorbirati, obično zato što valna duljina apsorbiranog svjetla odgovara elektronskoj ekscitaciji u objektu. Preostala svjetlost se prenosi, tj. prolazi kroz predmet.
U spektrofotometru se propusnost mjeri dijeljenjem spektra intenziteta svjetlosti propuštene kroz uzorak (I) sa spektrom intenziteta svjetlosti propuštene kroz slijepu probu (I 0 ).
Pretvarač apsorpcije/transmitancije
=
Apsorbancija (A), također poznata kao optička gustoća (OD) je količina svjetlosti koju apsorbira predmet i može se izraziti na sljedeći način
Transmitancija (T)
Kako biste saznali više o osnovnim znanjima o tehnikama UV-VIS spektroskopije, preuzmite vodič "Primjene i osnove spektrofotometrije".
Što je Beer-Lambertov zakon?
Beer-Lambertov zakon navodi da je količina energije koju apsorbira otopina proporcionalna duljini puta i koncentraciji. Jednostavno rečeno, koncentriranija otopina apsorbira više svjetla od razrijeđene otopine.
Matematička izjava Beerovog zakona je:
A = ϵ.dc
Gdje je ϵ = molarna apsorpcija, d = duljina puta i c = koncentracija. Molarna apsorpcija je jedinstvena fizikalna konstanta uzorka koja se odnosi na sposobnost uzorka da apsorbira svjetlost na određenoj valnoj duljini. ϵ ima jedinicu L·mol-1·cm-1.
Da biste saznali više o osnovama UV Vis spektroskopije, preuzmite vodič tvrtke METTLER TOLEDO, “Spectrophotometry Applications and Fundamentals”
Koja je razlika između skenirajućih i array spektrofotometara?
UV Vis spektrofotometar je instrument dizajniran za mjerenje apsorbancije u UV Vis području pomoću Beer-Lambertova zakona. Mjeri intenzitet svjetla koje prolazi kroz otopinu uzorka u kiveti i uspoređuje ga s intenzitetom svjetla prije nego što prođe kroz uzorak.
Glavne komponente UV Vis spektrofotometra su izvor svjetlosti, držač uzorka, disperzivni uređaj za odvajanje različitih valnih duljina svjetlosti i odgovarajući detektor.
Skenirajući spektrofotometar
Konvencionalni skenirajući spektrofotometri rade na principu uzimanja uzastopnih mjerenja propusnosti na svakoj definiranoj valnoj duljini. Svjetlost se dijeli na različite valne duljine pomoću difrakcijske rešetke. Kiveta s uzorkom postavlja se između difrakcijske rešetke i detektora.
Array Spektrofotometar
U array spektrofotometru uzorak je osvijetljen kontinuumom, tj. svim spektralnim komponentama svjetlosti odjednom, tako da istovremeno apsorbira svjetlost različitih valnih duljina. Propuštena svjetlost se zatim odbija od refleksijske rešetke. Ovaj instrument pomaže u dobivanju UV Vis spektra brže nego što se može dobiti korištenjem tradicionalnog skenirajućeg spektrofotometra.
U usporedbi sa skenirajućim spektrofotometrom, array spektrofotometar nema pokretnih dijelova.
Kako biste saznali više, preuzmite “Array versus Scanning”. Studija uspoređuje dva uspostavljena UV Vis spektrofotometra i procjenjuje njihovu izvedbu i prednosti.
Spektrofotometrijski instrument mora raditi u skladu sa svojim specifikacijama za kritična UV Vis mjerenja, posebno u kliničkoj, farmaceutskoj ili industrijskoj kontroli kvalitete. Stoga se provjera učinkovitosti mora provoditi redovito. Rezultati kalibracije također se moraju zabilježiti i pohraniti.
Preuzmite "Kako bi UV Vis Labs trebao raditi kalibraciju spektrofotometra" za uvid u važnost kalibracije u odnosu na revizije poglavlja o UV Visu koje se nalaze u Ph. Eur. 10 i USP42 NF37.
** Nema specifikacije fotometrijske ponovljivosti (preciznosti) u Ph. Eur.
SD - Standardna devijacija
3. Znanost o bojama
Osnove mjerenja boja
Boje čine naš svijet zanimljivijim. Kada vidimo predmet, svjetlost koja se reflektira od objekta ulazi u naše oči i skuplja je nekoliko vrsta fotoreceptora u mrežnici. Ovisno o osjetljivosti fotoreceptora, različiti ljudi mogu različito percipirati istu boju.
Da bi se univerzalno prihvatila točnost određene boje, moraju se dodijeliti numeričke vrijednosti. Ukratko, mjerna oprema kao što su spektrofotometri i kolorimetri daju rezultate boja kao vrijednosti kako bi se osigurala točnost i ponovljivost određivanja boje.
Spektrofotometri kvantificiraju podatke o boji prikupljanjem i filtriranjem valnih duljina koje se prenose kroz uzorak. Matematička jednadžba primjenjuje se na spektralne podatke kako bi se boja preslikala na ljestvicu boja.
Ljestvica boja CIE (Commission internationale de l'éclairage) definirana je pomoću tri parametra: nijansa, zasićenost i svjetlina.
Nijansa je dominantna boja predmeta. Primarne i sekundarne boje zajedno čine nijansu.
Zasićenost opisuje koliko je boja živa ili mutna.
Svjetloća je intenzitet svjetlosti boje (bilo da je tamna ili svijetla).
Svaki CIE sustav boja koristi tri koordinate za lociranje boje na ljestvici. Tri primarne ljestvice boja su Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* i CIE L*u*v*.
Na primjer, kada je boja izražena u CIE L*a*b*:
L* definira svjetlinu
a* označava crveno/zelenu vrijednost
b* označava žuto/plavu vrijednost
Koristeći CIE L*a*b* skalu boja, koordinate za crvenu boju ruže na slici bile bi:
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23
Kako biste saznali više o osnovama mjerenja boja, preuzmite vodič.
Boja je ključni faktor za trenutačno prepoznavanje.
Pružanje općeg uspješnog vizualnog iskustva potrošačima može utjecati na odluku o kupnji. Stoga je boja važna u definiciji identiteta marke i konzistentnosti proizvoda.
Uspostavljene su različite ljestvice boja kako bi se jedinstveno definirao proizvod prema industrijskim standardima. Ove ljestvice uključuju:
Skala
Standard
Prijave
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Utvrditi je li gorivo (kerozin, benzin, dizel, nafta, itd.) kontaminirano ili degradirano u skladištu
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Indeks žutila koji se koristi kao mjera za provjeru čistoće u industriji vode, kemijskoj industriji, industriji nafte i plastike
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Za testiranje proizvoda kao što su smole, masne kiseline, lakovi i ulja za sušenje koji su poprimili boju zagrijavanjem
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Kontrola kvalitete za industriju okusa i mirisa te industriju hrane i pića
MEBAK metoda 2.13.2, EBC metoda 8.5, EBC metoda 9.6
Za mjerenje intenziteta boje i zamućenosti (maglice) u EBC jedinicama piva, slada, karamele itd.
USP/EUP
USP-24 Monografija 631, EP metoda 2.2.2
Kontrola kvalitete lijekova
Hess-Ives
DGK ispitna metoda F 050.2
Koristi se za testiranje kemikalija i površinski aktivnih tekućina (uglavnom u kozmetičkoj industriji)
4. Analiza mikrovolumena korištenjem UV Vis spektrofotometra
Kako izvesti analizu mikrovolumena u UV Vis spektroskopiji?
Spektrofotometar mikrovolumena mjeri volumene uzoraka od samo 1 µl. Koncentracija nukleinskih kiselina u uzorku obično je reda veličine nano ili mikrograma po mililitru.
Razrjeđivanje takvih mikrovolumena i dobivanje točnih rezultata izazovno je. Stoga mikroanaliza bez razrjeđivanja postaje važna za daljnju analizu nukleinskih kiselina.
Tijekom analize nukleinskih kiselina uzorak mikrovolumena se pipetira u fini odjeljak na površini postolja. Svjetlosni snop iz izvora svjetiljke vodi se pomoću optičkih vlakana do mikrovolumenske platforme. Budući da je duljina puta smanjena na milimetar, veća koncentracija analita može se precizno analizirati bez višestrukih razrjeđivanja.
Sustav mikro-volumena koristi tehnologiju optičkih vlakana zajedno s inherentnim svojstvima uzorka (kao što je površinska napetost) kako bi zadržao uzorak na postolju i odredio apsorpciju uzoraka u stvarnom vremenu pri malim volumenima.
Uz ove prednosti, analiza mikrovolumena postaje idealan izbor za biomolekularnu analizu.
Prisustvujte webinaru na zahtjev "Maksimizirajte točnost tijeka rada kroz dobru UV/VIS praksu u analizama nukleinskih kiselina" za savjete i trikove o analizi mikrovolumena.
Kontrola kvalitete nukleinskih kiselina Kvantifikacija nukleinske kiseline bitna je predanalitička metoda za dobivanje točnih i pouzdanih rezultata u mnogim testovima molekularne biologije kao što su sekvenciranje nove generacije (NGS), lančana reakcija polimeraze (PCR), PCR u stvarnom vremenu (kvantitativni PCR; qPCR), kloniranje i transfekcija.
Kvalitativnu i kvantitativnu kontrolu nukleinskih kiselina moguće je provesti određivanjem čistoće i koncentracije nukleinskih kiselina.
Metode analize DNA A260 daje korelaciju koncentracije nukleotida, a A280 onu rezidualnih proteina. Aminokiseline tirozin i triptofan apsorbiraju na 280 nm, a fenilalanin dobro apsorbira na 260 nm. To omogućuje izračun omjera A260/A280 za čistoću DNK korištenjem izravnih mjerenja apsorbancije. DNK dobre kvalitete imat će omjer A260/A280 od 1,7–2,0
Testovi kvantifikacije proteina Različite metode kvantifikacije ukupnog proteina uključuju A280, bicinhoninsku kiselinu (BCA), Bradford, Lowry, Pierce i druge nove testove. Proteini u otopinama imaju maksimum na 280 nm zbog aminokiselina s aromatskim prstenovima i minimum na oko 220 nm zbog prisutnosti peptidnih veza.
Koncentracija se izračunava pomoću Warburgove formule:
Koncentracija proteina (mg/ml) = 1,55 X (očitanje A280) – 0,76 X (očitanje A260)
Kako biste saznali više o analizi DNK s UV Vis spektroskopijom, preuzmite uvodnik za aplikaciju „Omjer 260/280: pokazatelj kontaminacije proteinima“.
Koje su uobičajene pogreške u UV Vis mjerenjima i kalibraciji?
Točnost i preciznost u UV Vis mjerenjima može se postići poduzimanjem mjera opreza za izbjegavanje pogrešaka. Tipični rizici pogreške koje treba uzeti u obzir pri UV Vis mjerenju uključuju:
Spektralne karakteristike. Spektralna karakterizacija se provodi tijekom procesa kalibracije. Glavni čimbenici koji mogu dovesti do pogrešnih rezultata su točnost valne duljine, spektralna širina pojasa, zalutalo svjetlo i linearnost.
Fotometrijske karakteristike. Fotometrijske karakteristike uključuju spektralnu osjetljivost izvora svjetlosti, temperaturno ovisnu osjetljivost izvora svjetlosti i detektora itd.
Optičke interakcije. Zračenja izvora lampe mogu stupiti u interakciju s materijalom kivete, mijenjajući intenzitet apsorbancije uzorka. Takve optičke interakcije mogu se izbjeći odabirom pravog materijala kivete.
Razni čimbenici. Ostali čimbenici kao što su temperatura, fluktuacije mrežnog napona, vibracije, kontaminacija ili zagrijavanje uzorka fotometrom također nepovoljno utječu na mjerenja.
GUVP™
Iako se ne mogu sve pogreške izbjeći, pogreške se mogu minimizirati za bolje rezultate.
'Preuzmite brošuru dobre UV/VIS prakse "Pouzdani rezultati za UV/Vis spektroskopiju".
Odabir prave kivete uključuje odabir pravog materijala i točne veličine na temelju vašeg uzorka i instrumenata.
Materijal kivete trebao bi imati dovoljan prijenos na danoj valnoj duljini. Prigušenje svjetla na stijenkama kivete ne bi trebalo utjecati na ishod analize. Staklene kivete se ne koriste u UV području za analizu ispod 370 nm jer apsorbiraju zračenje. Preporuča se koristiti ih samo na vidljivom području.
Tablica koja slijedi daje korisne raspone prijenosa kiveta:
Materijal
Teoretski raspon prijenosa (nm)
Daleki UV kvarc
170-2700 (prikaz, ostalo).
Optičko staklo
320-2500 (prikaz, stručni).
Bliski IR kvarc
220-3800 (prikaz, stručni).
UV silicij
220-2500 (prikaz, ostalo).
UV plastika
220-900 (prikaz, ostalo).
PS ćelija za jednokratnu upotrebu
340-750 (prikaz, ostalo).
PMMA ćelija za jednokratnu upotrebu
285-750 (prikaz, ostalo).
Veličina kiveta također utječe na mogućnosti mjerenja. Nazivna duljina puta zračenja kivete je 10 mm. Ovisno o uzorcima, duljina može varirati od 1 mm do 100 mm.
Standardne kivete mogu se koristiti za većinu uzoraka koji se proučavaju. Uobičajene apsorpcijske i fluorescentne kivete imaju vanjsku bazu od 12,5 mm x 12,5 mm, visinu od 45 mm i unutarnje dimenzije od 10 mm x 10 mm.
Kivete s dugim putem (kivete s duljinom puta većom od 10 mm) koriste se kada je uzorak previše razrijeđen ili uzorak isparava ili prolazi kroz kemijsku promjenu tijekom postupka mjerenja.
Kivete kratkog puta (kivete s duljinom puta manjom od 10 mm) koriste se kada je apsorbancija visoka i razrjeđivanje teško.
Kako pravilno rukovati kivetama?
Kada rukujete kivetama, uvijek nosite kivetu sa zaleđenim stranama. Izbjegavajte prstima dodirivati prozirne optičke površine jer otisci prstiju mogu uzrokovati značajnu apsorpciju i time utjecati na točnost.
Izbjegavajte korištenje staklenih pasteurovih pipeta za punjenje kivete jer bi mogle izgrebati optičku površinu i uzrokovati daljnje smetnje. Preporučuju se pipete s jednokratnim plastičnim vrhovima.
Čistoća kiveta ima veliki utjecaj na rezultate, pa to moramo uzeti u obzir kao vrlo važan čimbenik.
Za dubinsko čišćenje kvarcnih kiveta preporučuju se sljedeći koraci:
Namočite kivete u otopinu za čišćenje.
Uklonite otopinu za čišćenje i isperite kivete deioniziranom vodom.
Isperite kivete etanolom ili acetonom, osim u slučaju proteina (vidi tablicu u nastavku).
Osušite kivete brisanjem maramicom koja ne ostavlja dlačice, a zatim sušenjem na zraku ili u pećnici.
Tablica koja slijedi daje korisne domete prijenosa kiveta.
Vodene otopine
Organske molekule
Teško uklanjanje čestica
Proteini
Teški metali
Masne kiseline
Otopine za čišćenje
Jednaki volumni dijelovi 3 M HCl i etanola
Isprati s 50% dušičnom kiselinom
Koncentrirana HNO 3 ili 2 M HCl
Jednaki volumni dijelovi etanola i 3 M HCl
Inkubirajte na sobnoj temperaturi s tripsinom
(Etanol i aceton se ne preporučuju za čišćenje.)
Jednaki volumni dijelovi sumporne kiseline 2 M i 50% deionizirane vode
Aqua regia
Jednaki volumni dijelovi IPA i deionizirane vode
Vrijeme namakanja*
10 minuta
10 minuta
30 sekundi
Preko noći
20 minuta
Brisanje
*Vrijeme namakanja navedeno u tablici je gruba procjena; međutim, preporuča se samo namakanje kiveta dok se mrlje/zagađivači ne uklone.
Staklene kivete mogu se očistiti ispiranjem kiveta acetonom ili etanolom, nakon čega slijedi ispiranje vodom. Preporuča se sušenje na zraku.
Plastične kivete mogu se nekoliko puta oprati deioniziranom vodom. Ne preporučuje se pranje plastičnih kiveta kemikalijama.
Preuzmite našu zbirku postera sa savjetima i trikovima za održavanje čistih laboratorijskih instrumenata
Dobra praksa za korištenje mikrovolumenskih spektrofotometara
Pripremite uzorak Osjetljivost instrumenta može biti niska za razrijeđene koncentracije bioloških uzoraka. Kako biste povećali osjetljivost takvih uzoraka, razmislite o uzimanju veće koncentracije uzorka. Mjerenja mikro volumena obično zahtijevaju 1-2 µl volumena uzorka. Za uzimanje uzorka koristite kalibrirane pipete. Mora se paziti da se pripremi homogen uzorak i odnese na analizu.
Očistite platformu mikro volumena Provjerite jesu li površina postolja za mikro volumen i zrcalo pravilno očišćeni. Jednostavno obrišite površine maramicom koja ne ostavlja dlačice koristeći deioniziranu vodu. Ako koristite pufersku otopinu, deterdžente ili ljepljivi uzorak, očistite površinu više puta prije nego što nastavite sa sljedećim uzorkom.
Stavite uzorak na platformu Polako i ravnomjerno postavite uzorak na površinu kako biste izbjegli stvaranje mjehurića.
Radite unutar granica detekcije Znajte najnižu i najvišu granicu detekcije instrumenta i radite unutar tog raspona.
Opće prakse za točna UV Vis mjerenja
Budite oprezni dok pripremate uzorak i pipetirate ga u kivetu ili na platformu za mikrovolumen. Uzorak treba biti homogen.
Ako su u uzorku prisutne suspendirane čvrste čestice, svjetlost se može raspršiti. U takvim slučajevima, filtrirajte uzorak pomoću filtra štrcaljke.
Napunite uzorak u kivetu uzimajući u obzir z dimenziju držača uzorka. Ovo će osigurati da svjetlost prolazi kroz uzorak. z-dimenzija je udaljenost od dna kivete do visine na kojoj svjetlosna zraka prolazi kroz uzorak.
Prije svakog mjerenja očistite kivetu maramicom koja ne ostavlja dlačice. Koristite novu maramicu svaki put.
Koristite isto otapalo/pufer otopine koji je korišten u pripremi uzorka kao slijepu probu.
6. Koje su primjene UV Vis spektroskopije u raznim industrijama?
UV Vis spektroskopija je svestrana analitička tehnika sa širokim rasponom primjena u raznim industrijama. Neke od značajnih primjena UV Vis spektroskopije u različitim industrijama su:
Hrana i piće
UV Vis spektroskopijom se utvrđuje kvaliteta i sastav hrane i pića. Može se koristiti za analizu boje (npr. vina), okusa i arome prehrambenih proizvoda, kao i za otkrivanje prisutnosti kontaminanata ili nečistoća.
Farmaceutski
UV Vis spektroskopija analizira čistoću, koncentraciju i identitet lijekova i drugih farmaceutskih proizvoda. Također se koristi za praćenje stabilnosti farmaceutskih proizvoda tijekom vremena.
Kozmetika
Procjena fotostabilnosti sredstava za formulacije, karakterizacija čestica agensa za blokiranje UV zraka, procjena indeksa boje, otkrivanje krivotvorenja (industrija parfema), proučavanje optičkih svojstava, kvantifikacija bojila, antioksidansa itd.
Petrokemija
Karakterizacija sirove nafte, izračun frakcija asfaltena, formulacija indeksa za sadržaj aromata, kvalitetu težine sirove nafte, sadržaj sumpora, izračunavanje Hildebrandovog faktora topivosti. (Prošireno na bitumen, teška ulja i ulja iz škriljevca i ulja dobivena fluidnim katalitičkim krekiranjem, koksiranjem ili ukapljivanje ugljena)
Kemijski
Određivanje kemijskih svojstava, konačna ocjena kvalitete gotovog proizvoda, studija sastava polimera, kvalifikacija otpadnih voda, određivanje čistoće i učinkovitosti bojenja, fotokatalitička razgradnja polimera/bojila, ostaci pesticida u tlu ili vodi
Biotehnologija
Koncentracija i čistoća nukleinske kiseline, proteina (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), mjerenja kulture mikrobnih stanica, denaturacije proteina, kinetičke studije (enzimska aktivnost), biološki uzorci kao što su krv, plazma, serum itd.
METTLER TOLEDO nudi širok raspon validiranih metoda primjene. Pronađite aplikaciju koja najbolje odgovara vašim potrebama putem naše online tražilice.
Različite spektroskopske tehnike uglavnom se razlikuju prema zračenju koje koriste, interakciji između energije i materijala te vrsti materijala i aplikacijama za koje se koriste. Spektroskopske tehnike koje se obično koriste za kemijsku analizu su atomska spektroskopija, ultraljubičasta i vidljiva spektroskopija (UV Vis spektroskopija), infracrvena spektroskopija, Ramanova spektroskopija i nuklearna magnetska rezonancija.
Vrsta spektroskopije
Vrsta zračenja
Interakcije
Valna duljina
Spektroskopija ϒ-zraka
ϒ-zrake
Atomske jezgre
< 0,1 nm
X-zračna fluorescentna spektroskopija
X – zrake
Elektroni unutarnje ljuske
0,01 – 2,0 nm
Vakuumska UV spektroskopija
Ultraljubičasto (UV)
Ionizacija
2,0 – 200 nm
UV Vis spektroskopija
UV Vis
Valance elektroni
200 – 800 nm
Infracrvena i Ramanova spektroskopija
Infracrveni
Molekularne vibracije
0,8 – 300 mm
Mikrovalna spektroskopija
Mikrovalne pećnice
Molekularne rotacije
1 mm do 30 cm
Spektroskopija spinske rezonancije elektrona
Spin elektrona
Spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije
Radio valovi
Nuklearni spin
0,6 – 10 m
Koje su različite molekularne interakcije u UV području?
Apsorpcija UV svjetla rezultira elektroničkim prijelazima s nižih energetskih razina na više energetske razine. Apsorpcija ultraljubičastog zračenja u organskim molekulama ograničena je na određene funkcionalne skupine (kromofore) koje sadrže valentne elektrone niske energije pobude. Molekularni prijelazi/interakcije koje se odvijaju zbog UV apsorpcije su:
π- π* (prijelaz pi u pi zvijezdu) – vezivanje na antiveznu orbitalu
n - π* (prijelaz n u pi zvijezdu) – nevezujuća u antiveznu orbitalu
Ovi prijelazi trebaju nezasićenu skupinu u molekuli kako bi osigurali π elektrone.
σ (vezujući) u σ* (nevezani) prijelazi zahtijevaju veću energiju i stoga se ne mogu detektirati pomoću UV Vis spektroskopije.
Kako funkcionalne skupine utječu na spektre?
Razmotrimo funkcionalnu skupinu koja sadrži atome s jednim ili više slobodnih parova elektrona koji ne apsorbiraju ultraljubičasto/vidljivo zračenje. Međutim, kada je ova funkcionalna skupina spojena na kromofor, ona mijenja intenzitet i valnu duljinu apsorpcije. Taj se fenomen naziva auksokromom ili skupinom koja poboljšava boju.
Prisutnost auksokroma uzrokuje pomak položaja vrha ili signala na veću valnu duljinu, što se naziva batokromni ili crveni pomak. Funkcionalne skupine koje doprinose batokromnim skupinama su supstituenti kao što su metil, hidroksil, alkoksi, halogen i amino skupine.
Auksokrom koji uzrokuje pomak položaja vrha ili signala prema kraćoj valnoj duljini naziva se hipsokromni ili plavi pomak. Zapravo, kombinacija kromofora i auksokroma ponaša se kao novi kromofor koji ima različite maksimume apsorpcije (λ max ). Na primjer, benzen pokazuje λ max na 256 nm, dok anilin pokazuje λ max na 280 nm. Dakle, NH 2 skupina djeluje kao auksokrom i uzrokuje pomak λ max na veću vrijednost.
Koja je razlika između spektralne propusnosti i razlučivosti u UV Vis spektroskopiji?
Spektralna propusnost (SBW) spektrofotometra povezana je s fizičkom širinom proreza i optičkom disperzijom monokromatorskog sustava. Rezolucija je sposobnost instrumenta da razdvoji svjetlost u konačna, različita područja valne duljine i da razlikuje svako konačno područje. Spektralna propusnost obično se koristi za instrumente za skeniranje, dok se rezolucija obično koristi za instrumente s nizom.
Za većinu farmakopejskih kvantitativnih svrha dovoljan je spektralni pojas manji od 2 nm, a kriterij prihvatljivosti za omjer je 1,3. Spektralna rezolucija može se koristiti za usporedbu sa spektralnom propusnošću.
Tablica prikazuje rezoluciju spektrofotometara UV/VIS Excellence tvrtke METTLER TOLEDO, koja se mjeri pomoću toluena u heksanu i ekvivalentnog SBW-a.
Instrument
Spektralna rezolucija
Ekvivalent SBW (nm)
UV5
> 1.5
< 2,0
UV5Bio
> 1.5
< 2,0
UV5Nano
> 1.7
< 1,5
UV7
> 1.9
≤ 1,0
Koji se različiti izvori svjetlosti koriste u UV Vis spektrofotometru?
Najbolji izvor svjetlosti bio bi onaj koji pruža dobar intenzitet s niskim šumom na svim ultraljubičastim i vidljivim valnim duljinama i nudi stabilnost tijekom dugog razdoblja. Postoji niz izvora svjetlosti koji se obično koriste kao što je navedeno u nastavku.
Izvor svjetlosti
Raspon valnih duljina
(nm)
Regija
Doživotno
Žarulja s volframovom niti
350 – 2500
VIS + IR
3.000 sati
Deuterijska lučna svjetiljka
190 – 400 (prikaz, stručni).
UV
1.000 sati
Vodikova svjetiljka
190 – 400 (prikaz, stručni).
UV
1.000 sati
Xenon bljeskalica
190 – 1100 (prikaz, stručni).
UV + VIS + NIR
5500 sati*
* Odgovara treptajima od 50 Hz pri konstantnom radu
Kako je difrakcijska rešetka bolja od prizme?
Prizme i difrakcijska rešetka tipični su disperzivni elementi. Prizma postiže disperziju zbog razlike u indeksu loma materijala prema valnoj duljini. Međutim, difrakcijska rešetka koristi razliku u smjeru difrakcije za svaku valnu duljinu zbog interferencije. I prizme i difrakcijske rešetke mogu raširiti spektre svjetlosti u mnoge boje za analizu. Međutim, difrakcijska rešetka manje je osjetljiva na boju svjetlosti i može se napraviti da širi boje pod većim kutom od prizme. Staklo u prizmi prozirno je za vidljivu svjetlost, ali apsorbira i blokira svjetlost u infracrvenom i ultraljubičastom dijelu spektra. Difrakcijska rešetka s nekoliko stotina linija po inču može skrenuti svjetlost u sredini vidljivog spektra za najmanje 20 stupnjeva. Kut otklona staklene prizme općenito je puno manji od ovoga.
Koji se anorganski spojevi mogu mjeriti UV Vis spektroskopijom?
Molekule se mogu analizirati uporabom UV Vis spektroskopije ako posjeduju bilo koju funkcionalnu skupinu ili konjugaciju, ili ako proizvode kompleks boje. Budući da anorganski spojevi ne sadrže nikakvu funkcionalnu skupinu ili konjugaciju, uobičajena metoda za njihovu analizu je reakcija s odgovarajućim spojem. Ovo proizvodi kompleks boja čija se apsorbancija može fotometrijski mjeriti u vidljivom području i korelirati s njegovom stvarnom koncentracijom. Na primjer, željezo se obično analizira reakcijom s 1,10-fentrolinom kako bi se dobio kompleks crvene boje. Apsorpcija kompleksa mjeri se na 570 nm kako bi se procijenila koncentracija željeza.
Kako se razlikuju spektrofotometri s jednim snopom i s dvostrukim snopom?
Slijedi glavna razlika između spektrofotometra s jednom i dvostrukom zrakom.
Spektrofotometar s jednim snopom: jedan snop iz izvora svjetlosti prolazi kroz uzorak
Spektrofotometar s dvostrukim snopom: svjetlosni snop iz izvora svjetlosti dijeli se na dva dijela: jedan dio prolazi kroz uzorak, a drugi dio prolazi kroz referentni
Dijeljenje snopa u spektrofotometru s dvostrukim snopom postiže se na dva načina:
statički, s djelomično zračnim zrcalima ili sličnim uređajem
prigušivanje zraka pomoću pokretnih optičkih i mehaničkih uređaja
Kako analizirati čvrsti polimerni film pomoću UV Vis-a?
Analiza čvrstog uzorka provodi se uglavnom procjenom njegove apsorbancije, propusnosti i refleksije. Uobičajeni parametri koji se određuju za čvrste polimere uključuju % propusnosti, graničnu valnu duljinu i indeks žutila. Uzorak se postavlja na držač posebno dizajniran za krute uzorke i očitavanja se uzimaju na isti način kao i za tekuće uzorke. Držač čvrstog uzorka omogućuje mjerenje čvrstih uzoraka kao što su filmovi ili staklo.
Utječe li temperatura na UV Vis analizu?
Temperatura utječe na vrijednosti apsorbancije. Različita otapala podliježu različitim interakcijama na različitim temperaturama. Parametri otopine koji se mijenjaju zbog promjena temperature su:
Brzina reakcije. Stopa se mijenja kada je temperatura povišena. To može uzrokovati promjenu u aktivnosti uzorka. Enzimske/biomolekularne reakcije vrlo su osjetljive na temperaturu.
Topljivost otopljene tvari. Na topljivost utječu promjene temperature. Slaba topljivost može dovesti do neprecizne apsorpcije.
Širenje ili skupljanje otapala. To može dovesti do promjene koncentracije otopine i utjecati na apsorbanciju, budući da je apsorbancija linearno povezana s koncentracijom.
Schlierenov učinak. Ovaj se učinak može pojaviti s promjenama temperature, što dovodi do niza konvektivnih struja koje mogu promijeniti stvarnu apsorbanciju.
Parametri optičkih performansi kao što su fotometrijski šum, točnost/ponovljivost valne duljine, fotometrijska ponovljivost i rasuto svjetlo nisu pod utjecajem temperature unutar raspona od 10 – 40 °C.
S druge strane, optički parametri poput fotometrijske rezolucije (omjer toluen/heksan) i valne duljine fotometrijske točnosti (K 2 Cr 2 O 7 u HClO 4 ) pokazuju temperaturnu ovisnost u rasponu od 0,014 do -0,034/jedinici unutar 10 – 40 °C.
Kontrola temperature za UV Vis spektrofotometriju može se postići korištenjem termostatskih sustava visokih performansi kao što su CuveT i CuvetteChanger. Saznajte više ovdje .
Što je zalutala svjetlost?
Zalutalo svjetlo definira se kao svjetlo koje dopire do detektora, a koje ne dolazi od izvora svjetlosti instrumenta i ne prati optički put, uzrokujući odstupanje na odgovarajućoj valnoj duljini. Stoga je intenzitet svjetlosti izmjeren detektorom veći nego što bi zapravo trebao biti. Obrnuto, to također znači da je izmjerena apsorbancija niža od prave apsorbancije jer je smanjena doprinosom zalutale svjetlosti. Ovaj učinak je izraženiji pri višim vrijednostima apsorbancije (visoke koncentracije uzorka).
Preuzmite dokument kako biste saznali više o podrijetlu i točnom mjerenju rasute svjetlosti:
Zašto je odjeljak za uzorke u UV Vis Array spektrofotometrima otvoren?
Odjeljak za uzorke u spektrofotometrima UV Vis Array otvoren je zbog činjenice da oni koriste reverznu optiku i istovremenu detekciju svih valnih duljina spektra.
Obrnuta optika: Svjetlost se difragira nakon što je prošla kroz uzorak. Zbog toga samo mali dio vanjskog ambijentalnog svjetla doprinosi signalu u određenom području valne duljine.
Simultano otkrivanje: Korištenjem niza detektora koji daje 2048 signala intenziteta svjetlosti u isto vrijeme, puni se spektar bilježi unutar jedne sekunde. Budući da je mjerenje vrlo brzo, učinak ambijentalnog svjetla je značajno smanjen.
Aplikacije
U nastavku preuzmite posebne vodiče za primjenu UV Vis spektroskopije
