蛋白质结晶是为复杂大分子创建结构化、有序晶格的行为和方法。蛋白质通常作为固体呈无定形，容易变性，而存在于晶体晶格中的蛋白质则抗变性且具有更高的稳定性。蛋白质如果置于适宜的环境中，可以结晶。蛋白质结晶被视为既是一门艺术，也是一门科学，因为影响蛋白质结晶过程的变量之间存在高度复杂的相互作用。
创建蛋白质晶体的最常见原因是支持结构生物学研究，通常通过X射线衍射晶体学实现。研究人员通过了解蛋白质的三维结构，可以观察框架中允许与其他分子相互作用的区域（例如，更好地理解酶、底物和配体如何相互作用）。此外， 结晶是一种有效的手段，用于制备纯净的蛋白质，避免其他蛋白质或杂质生物物质的污染，从而提供了制备色谱之外的另一种纯化和分离方法。
结晶过程通过一系列相互依赖的机制进行，每个机制均受工艺参数选择的独特影响：成核、生长、油析、聚集、破碎、接种和多晶型转变。
这些机制通常同时发生，使得有效的结晶设计成为一项挑战。在缺乏机理理解的情况下，科学家依赖反复试验调整工艺参数，以优化产率、纯度和晶体尺寸。通过了解结晶过程中发生的机制，科学家可以采用策略，获得具有期望特性的晶体产品。
蛋白质作为治疗药物的重要性日益增加。然而，生产具有必要稳定性的蛋白质面临关键挑战，包括产品变异、结构丧失导致疗效降低以及潜在有害副产物的形成。蛋白质结晶是一种生产纯净、稳定固体剂型的方法，许多注射和输注治疗剂与蛋白质晶体相关。过去，蛋白质结晶主要作为支持X射线晶体学的实验室活动，但随着蛋白质基治疗剂的指数增长，将蛋白质结晶规模化至生产水平变得越来越重要，且成为重点关注领域。
蛋白质结晶的规模放大在本质上类似于小分子结晶，其要求在实验室规模优化关键工艺参数（CPPs），以实现商业规模结晶药物物质的关键质量属性（CQAs）。蛋白质结晶工艺开发和规模放大的整体平台通常包括：
蛋白质结晶相关的主要制药应用包括：通过结构生物学进行药物化学、蛋白质药物开发、规模放大、分离和纯化、配方和药物递送。
有多种方法用于生长蛋白质晶体；其中最常见的是蒸气扩散法和微批法。前者有两种变体，称为悬滴法和坐滴法，基本原理相同。在密封系统中，含有蛋白质、缓冲液和沉淀剂的溶液滴与含有相同溶液但无蛋白质的高浓度溶液储液池达到平衡。蛋白质溶液滴中的水分蒸发并被储液池中较高浓度的溶液吸引。随着滴中溶质浓度的增加，蛋白质开始结晶。在微批法中，蛋白质和其他试剂被引入并覆盖在一层薄薄的矿物油下，防止水分扩散。微批法本质上是一个小型反应器，含有所有必要成分，且浓度稳定，允许结晶发生。
由于找到结晶蛋白质所需的正确试剂、参数和条件通常是经验性的，最实用的成功蛋白质结晶方法是基于以往经验使用多种实验条件。最简单的方法是使用市售的蛋白质晶体筛选试剂盒，这些试剂盒包含预包装的缓冲液、沉淀剂等溶液，装在多孔板中。悬滴蒸气扩散法用于利用这些试剂盒生长晶体。当需要大规模筛选时，有高通量系统可自动化微批法，节省时间和繁琐操作，同时最大限度减少所需纯化蛋白质的量。对于制药或工业应用所需的大规模蛋白质结晶，筛选实验获得的信息构成了应用于更大规模自动化反应器系统的基础，该系统具有原位实时过程分析技术（PAT）。
为了支持工艺开发和制造，成功结晶蛋白质的最重要初步步骤之一是确保有足够供应的高纯度且表征良好的蛋白质。除了蛋白质纯净（即无发酵基质等杂质污染）外，蛋白质应在溶液中均一且稳定（或被稳定化），具备：
此外，蛋白质结晶过程中使用的所有试剂和溶剂都需无污染，因为这些会对成核产生显著影响。
与小分子结晶类似，蛋白质从过饱和溶液中结晶。对于形成稳固晶格的小分子，调节温度是实现过饱和的主要手段；这对蛋白质同样适用。然而，允许的温度范围较窄，因为蛋白质晶体通常含有溶剂作为晶体结构的一部分，且常对温度敏感，易变性和聚集。
小分子具有显著较少的立体自由度，因此结晶更容易。大分子肽具有更多内部酸性、碱性、极性、非极性相互作用和排斥力，抵抗有序结晶，这种现象在更大的蛋白质中更为严重。大多数适合结晶的肽还含有大量二硫键，这对固定结构基序至关重要。分子内部无序程度或结构可能变化是决定肽或蛋白质是否能结晶而非沉淀的重要属性。即使分子具备适合结晶的属性，也有许多影响工艺商业可行性的过程参数需要表征。
除了温度外，还有许多其他因素通过过饱和影响或辅助蛋白质结晶，包括pH调整和溶液的离子强度，添加盐类和沉淀剂如PEG以降低蛋白质溶解度，存在的配体类型等。关键是在不干扰蛋白质正常特性的环境中实现溶液的过饱和。这强调了找到一组变量和条件以获得具有正确形态、纯度和可接受生长速率晶体的重要性。
蛋白质治疗剂结晶的开发和放大需要深入了解影响结晶过程的变量和条件。与其他结晶过程一样，实现所需的晶体形态、形状、粒径及粒径分布需要精确控制，以确保产品质量一致。蛋白质晶体悬浮液的关键质量属性（CQA）任何变化都会直接影响治疗效果。由于蛋白质晶体对其生长环境高度敏感，且容易受到过高温度、溶剂损失及其他外部应力甚至取样过程的损伤，因此理想情况下应在原位测量关键过程参数（CPP）和产品质量，即无需将晶体从其溶液环境中取出。
当自动化实验室反应器与实时原位分析仪器联合使用时，可识别过程参数对结晶机制（如聚集、生长、团聚、破碎和形状变化）的影响。通过对结晶过程的精确控制及晶体形成进程的连续原位监测，实现基于事实和数据驱动的优化和放大。
EasyMax自动化实验室反应器是蛋白质结晶参数优化的完整工作站，支持开发和放大设计与执行。该全自动系统实现对过程参数的精确控制。
ReactIR利用中红外光谱技术测量结晶研究中的溶液相。ReactIR测量不受悬浮固体、气泡或其他颗粒物质的影响。
ReactRaman利用拉曼光谱技术对溶液中的颗粒进行分子分析
ParticleTrack 使用 聚焦光束反射测量 (FBRM) 技术，是一种光学探针式仪器，直接插入容器中实时跟踪粒径和粒子计数的变化。ParticleTrack 使用弦长分布测量来获得晶体尺寸分布 (CSD)。
EasyViewer 是一种探针式仪器，直接插入容器中捕捉粒子系统的图像。EasyViewer 进行图像分析，并从过程的时间分辨在线图像中测量粒子计数、尺寸分布和形态，从而使群体随时间变化趋势得以观察。
Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). 生物制药结晶的实时监测：从弦长分布到溶菌酶、重组人胰岛素和维生素 B12 的晶体尺寸分布。工业与工程化学研究, 58(18), 7607–7619。
作者报告成功开发了一种高效的生物制药结晶实时监测方法。该方法使用 ParticleTrack 测量一系列生物制药分子的 CLD，在静态和动态条件下，并应用数学建模将 CLD 转换为 CSD。所研究的生物分子具有不同的晶体形态，这取决于结晶的实验条件。溶菌酶可产生四方形和针状晶体，重组人胰岛素形成菱形晶体，维生素 B12 形成多面体晶体。
作者开发了模型以确定低长宽比的四方形、菱形、多面体晶体和高长宽比针状晶体的 CSD。作者使用了三种不同的模型来确定晶体尺寸分布：
用 FBRM 测量计算 CSD 的模型结果随后与图像分析获得的 CSD 测量结果进行了比较。
尝试监测不透明的晶体浆液存在挑战，尤其是在制造规格要求粒径分布 (PSD) 较窄时。对于注射用蛋白质晶体配方，PSD 会极大影响粘度，并作为聚集或其他可能危及配方的降解事件的早期预警。现场监测被用于人类生长激素 (hGH) 晶体形成和生长的放大批量结晶研究。实时分析检测到由于容器间混合差异导致的 PSD 轮廓偏离。这一点随后通过离线图像分析 (IA) 得到确认。
