寡核苷酸合成

寡核苷酸可通过较大生物分子的断裂或者通过靶向化学合成以酶促方式形成。 在后一种情况下，有机核苷酸合成是化学过程，通过该过程合成核苷亚磷酰胺（寡核苷酸的关键单体元素）。 核苷亚磷酰胺（亦称作核苷或亚酰胺）本身是天然或合成核苷的衍生物。

因此，核苷酸是由共价连接的核苷和磷酸基团组成的复合分子。 核苷酸以特异性序列连接以形成所需产物。 因此，寡核苷酸由连接在一起形成单链生物聚合物的核酸短片段组成。 由于大多数寡核苷酸通常由多达20个连接的核苷酸（尽管可能更多）组成，因此可以将其视为小生物制药分子。 

与其他同药物相关的小分子非常相似，寡核苷酸合成需要对温度、pH、底物质量等因素进行严格控制。 由于寡核苷酸合成采用典型方法，因此核苷酸序列越长且越复杂，则越难以满足产量、纯度和成本目标。 过程分析技术（PAT）对于实现这些目标很有用。

寡核苷酸是连接在一起形成单链生物聚合物很短的单链或双链核酸片段。 可将单个核苷酸碱基对视为等同于组成经典化学聚合物的单体。 核苷酸由三部分组成：含氮碱基、包含5个碳原子的糖分子（这两部分为核苷）和一个或多个磷酸基团。 核苷酸也可由非天然或非经典碱基组成。 常见例子包括LNA（锁定核酸）、吗啉代和结构经过改性的碱基或骨架。 

核苷酸的复杂连接可形成生物学上至关重要的RNA和DNA生物分子。 对于RNA（单链生物聚合物）而言，糖为核糖。 在DNA中，双链分子包含糖脱氧核糖。 重要寡核苷酸的组成部分是脱氧核糖核酸和核糖核酸的短序列。 这些核苷酸的特异性连接可产生用于生物、医学、法医学和临床应用的靶生物分子。 

寡核苷酸引物和探针

合成寡核苷酸最普遍的用途是在各种应用中用作相对较短的探针和引物（最多30个聚体）。 这涉及合成与较大的靶DNA或RNA链（靶序列）成对或“反向互补”的核苷酸序列。 作为引物，寡核苷酸通常用于引发酶促反应（例如：寡糖），以生成短或长靶序列的数百万至数十亿个副本。 众所周知的例子是聚合酶链反应（PCR）或Sanger测序方法。 寡核苷酸引物的应用包括DNA测序、基因表达、克隆和分子诊断。

作为探针，寡核苷酸用于鉴定以及结合特定的DNA或RNA靶序列，以确认该序列在特定材料中的存在。 使用寡核苷酸探针的应用包括印迹程序，例如Northern印迹（用于RNA）或Southern印迹（用于DNA），作为微阵列中的荧光团偶联序列，可检测基因表达的变化，或者用于筛选遗传疾病或鉴定特定病原体（分子诊断）。

寡核苷酸治疗/基因治疗

在治疗应用中，反义寡核苷酸（ASO）（通常为20——30个聚体物种）利用自然生物学促进对不良或过度活跃RNA序列的基因抑制或基因沉默（破坏），从而阻止对有可能造成或诱发疾病的某些受损或过度活跃蛋白质的表达。 关于基于寡核苷酸疗法的研究已经明显加强，近年来已经批准了多种药物。

合成核苷酸的未来用途：了解DNA和RNA疫苗的形式

尽管不是严格意义上的寡核苷酸，但是长度为数百或数千个碱基的基于DNA或RNA的疫苗产品（如mRNA或质粒或基于载体的核酸）代表着不断发展的合成核苷酸技术的前沿。

从概念上讲，DNA或RNA疫苗将免除病原细菌或病毒的所有不必要或有害部分。 相反，这种基于核酸的疫苗将仅仅包含病原体DNA或RNA少数部分的代码。 这些DNA或RNA链将指导患者的免疫系统产生单个抗原或病原体片段。 通过现代化运算和计算机模拟，只要存在设计时参考的适当靶序列，便可以在数日或数周内创建这些寡核苷酸疫苗形式。 作为一种平台技术，基于核酸的疫苗依赖于成套标准构件或原材料，可随心所欲地实现多种组合。 因此与传统疫苗形式相比，它们相对便宜且易于生产。 然而，对于生物制药行业而言，这仍然是一种正在成熟的范式，并且正在不断解决新的挑战，其中一些挑战是寡核苷酸和长核酸产物所独有的，而一些挑战则与其他生物治疗形式共有。

寡核苷酸合成是化学过程，通过该过程可以特异性连接核苷酸，以形成所需序列的产物。 使用填充床柱进行的连续固相合成通常用于生产寡核苷酸。 在某些情况下，采用间歇浆料反应。

产生目标寡聚物序列的过程需要执行多次由特定合成步骤组成的循环。 首先，去除固相支持的核苷酸上的4,4'二甲氧基三苯甲基保护基。 其次，活化亚磷酰胺单体并通过固相结合核苷酸上的游离羟基快速偶联，以产生含有亚磷酸三酯键的二核苷。 在第三步，氧化亚磷酸三酯。 在（第一个循环的）最后一步，通过乙酰化将所有未发生反应的被支持核苷“加帽”，以防止在下一个循环中形成不需要的副产物。

寡核苷酸的长度由构成序列的核苷酸数量定义。 就命名而言，长度为20个核苷酸的序列被定义为“二十聚体”。 寡核苷酸长度对于不同应用至关重要。 例如，短聚体寡核苷酸通常用于PCR，而很长的序列（200个碱基或更多）则用于要求苛刻的应用，例如：克隆或CRISPR编辑。 特殊的长聚体寡核苷酸的合成具有挑战性，传递纯序列需要有效的合成控制和纯化方法。 平均而言，大多数寡核苷酸的长度小于60个聚体。 由于寡核苷酸的合成方式需要添加额外核苷酸的重复反应循环，因此所需的序列越长，则形成多余副产物的可能性越大，其中有可能包括删除或截断序列。

根据质量、数量以及成本目标的不同，采用不同的纯化方法。 例如，无盐寡核苷酸消除了化学合成的副产物，但是序列失败情况仍然存在。 从成本与功效角度看，这些脱盐寡核苷酸对于更多常规应用很有用，例如PCR。  对于要求更高的应用，反相色谱法可消除产物中不需要的序列，但效果不如凝胶电泳，后者可提供高度纯化的序列产物，但通常数量有限。 尤其是对于临床问题，在整个合成和下游加工过程中，产量保持率也是一个长期存在的问题。

经典的固相化学合成通常需要使用不受反应条件影响的聚合物或特制玻璃珠。 这些玻璃珠有可能包含在反应物、试剂和溶剂流过的柱中。 玻璃珠旨在用作底物分子共价结合所在的平台，然后通过化学反应对其起作用。 底物分子上某些官能团的保护和脱保护是合成的关键，并可确保获得所需产物。 通过化学破坏合成产物与下方聚合物玻璃珠之间的键去除合成产物。 

固相合成对于快速产生纯化产物非常有效，因为在合成的不同步骤中，会将杂质和未反应的材料冲洗掉。 此外，整个合成过程适合于计算机控制和自动化。  固相合成是定制肽和寡核苷酸生产最常用的方法。 对于后一种情况，需要大量重复循环依次添加核苷酸，从而形成靶序列。 

固相寡核苷酸合成提出了许多难题，包括随着链长的增加产量的降低。 经常将位阻假设为产量不佳的机理，其中一个或多个表面固定链可能会干扰其邻位的每次连续延伸。 

为了解决这些和其他难题，存在许多液相寡核苷酸合成方法。 

液相合成的许多基本步骤与固相合成类似。 主要区别在于合成发生于溶液或液相（即：未固定在任何表面）。 由于该过程依然循环进行，因此存在许多的伴随方法可去除未反应的试剂，同时保留细长的寡核苷酸产物。

1985年开发出了使用PCR进行寡核苷酸合成的技术。 1986年，Taq聚合酶首次使用。 然而，由于以下三种关键原因，工业寡核苷酸合成一直在努力采用酶促寡核苷酸合成：

1. 酶促合成需要使用一个扩展序列的DNA聚合酶可在上方操作的模板。 因此，没有模板，便无法进行酶促从头寡核苷酸合成。 
   
2. 可用作模板的许多寡聚引物、探针或ASO靶本身太短，无法有效引发和触发聚合酶合成。
   
3. 许多人工治疗性寡核苷酸经过化学改性，可延长体液循环的半衰期以及增强功能性，这些改性可几乎或完全抑制其与进化衍生聚合酶的相互作用（这主要涉及较长的寡核苷酸物种，例如mRNA）。

针对能够使用化学改性核苷酸储备液进行ASO合成的工程聚合酶的研究与开发仍在继续

寡核苷酸合成的复杂性有可能受益于更高程度的过程观察、对反应机理和偏差的了解以及可行控制措施。 使用PAT进行的实时分析可最大限度减少或消除对耗时或慢速离线分析的使用。

• ReactIR与ReactRaman可用于跟踪寡核苷酸合成反应的动力学以及运行之间的比较。
• 使用EasyMax自动化化学合成反应器精确控制温度、搅拌和加样，以及与反应趋势和机制相结合，有助于通过iC软件获取数据和简化管理

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy, and Qunying Dai, "Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides", Organic Process Research and Development (2015), 19, 203-214.

作者指出，尽管自动化固相寡核苷酸合成的方案已经相当成熟，然而涉及到的化学依然具有挑战性且成本很高。 制造业中发现的主要风险包括：

• 将不正确的化学溶液连接至合成器的指定输入端口；
• 对溶液进行不正确定量制备；
• 因机械原因或者与合成器相关的其他未知原因造成的错误

无法识别和应对任何这些风险有可能导致过程完全失败。 因此，对实时光谱监测同基于中红外数据的区分、定量和MSPC建模的结合使用进行了评估。 发现ReactIR可为合成过程提供实时保证和控制，并且能够改进寡核苷酸的自动化合成。 尤其是发现该方法的灵敏度、信息深度、广泛的范围以及经验可及性能够直接用于解决与这些化合物相关的大量关键制造难题，包括在线序列和纯度确认等。

在流动条件下，原位FTIR和拉曼光谱法对于化学反应的实时监控能力已得到充分证明，可在寡核苷酸合成的关键步骤中应用。

• 通过核苷酸单体合成确保结构与纯度
• 降低因合成器机械问题或不正确的溶液进给造成的风险
• 跟踪磷酰胺单体对于固相结合核苷酸上游离羟基的偶联反应
• 跟踪双链合成中互补性寡核苷酸的变性和重组。
• 确定重组过程中的化学反应动力学——识别和跟踪中间体或未知物质
• 将光谱中的变化与过程中的关键点关联
• 适用于SPS、间歇与会聚肽合成（SPS +液相）

控制得当的合成环境对于确保反应结果至关重要。 自动化反应器平台在所有关键过程参数方面同时确保准确度和一致性。

• 可重现的环境是良好科学的基础
• 通过将传感器和在线PAT提供的数据相结合的方式了解过程参数对于关键质量属性的影响
• 方案与自动化可减轻手动风险或不一致性
• 促进可搜索的结构化数据
• 利用数十年的引证和证据实现放大生产
• 适用于SPS、间歇与会聚肽合成（SPS +液相）