Pipettieren – Handbuch für bessere Resultate

Die Good Pipetting Practice soll Forschern bei der Auswahl der richtigen Geräte, Pipettiertechniken und ergonomischen Verfahren sowie Prozesse für die richtige Kalibrierung und des optimalen Routinebetriebs helfen, um die bestmöglichen Resultate zu erzielen. Pipettieren oder das Abmessen und Übertragen von Flüssigkeitsvolumen im Mikro- und Milliliterbereich ist wahrscheinlich die am häufigsten praktizierte Tätigkeit in Forschungslaboren. Die Fähigkeit, diese Tätigkeit exakt und schnell durchzuführen, ist daher eine unabdingbare Voraussetzung für den Erfolg der Arbeit. Moderne Luftpolsterpipetten werden aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile für den Grossteil der Laborarbeit eingesetzt. Sie sind das ideale Instrument zur effizienten Dosierung kleiner Flüssigkeitsmengen. Mit modernen Pipetten und Spitzen hoher Qualität kann ein hohes Mass an Produktivität erreicht werden, wodurch folglich Arbeitsstunden eingespart werden.

Projektplanung und Arbeitsablauf

Die meisten neuen Projekte profitieren von einem vollständigen Planungsprozess, bei dem alle Schritte des Arbeitsablaufs unter der Vorgabe maximaler Effizienz und Datenerzeugung analysiert werden. Beim Handling von Flüssigkeiten ist hier eine Analyse des Startprobentyps, der notwendigen Endpunktanalyse und des Probendurchsatzes erforderlich. Diese wiederum bestimmt die verwendeten Techniken und die notwendigen Formate für die Handhabung von Flüssigkeiten (Röhrchen, Platten usw.). Hieraus ergeben sich schliesslich die für den Arbeitsablauf optimalen Instrumente für die Handhabung von Flüssigkeiten. Bei jeder Pipettiertätigkeit müssen die Pipette, die dazugehörige Spitze und die Bedientechnik als eine Einheit angesehen werden, um das genaue Volumen der erforderlichen Flüssigkeit zu erhalten. Die Auswahl der korrekten Pipette und Spitze und die Anwendung der effektivsten Technik sind wesentliche Bestandteile bei der Gestaltung und Umsetzung von Projekten oder Versuchen.

Analysieren des Arbeitsablaufs

Der erste Schritt dieses Prozesses besteht darin, alle Schritte eines experimentellen Arbeitsablaufs auszumachen – von der anfänglichen Isolierung der Probe bis zur Datenerstellung. Hierunter fallen auch alle Schritte zur Vorbereitung des Arbeitsablaufs, z. B. Puffer- oder Mastermixvorbereitung. Anschliessend wird ermittelt, wie hoch die tolerierbaren Schwankungen bei dem Versuch sein dürfen, um zuverlässige Daten zu erhalten. Einige Anwendungen und Schritte sind erheblich empfindlicher gegenüber Schwankungen als andere. Beispielsweise sind Versuche mit Vervielfältigung, wie etwa qPCR, gelegentlich äusserst empfindlich gegenüber Schwankungen, während eine einfache Puffervorbereitung davon unberührt bleibt. Eine schlechte Pipetten- und Spitzenwahl sowie eine ungeeignete Pipettiertechnik können zu experimentellen Schwankungen führen. Beispielsweise können Versuche, die von einer Standardkurve einer seriellen Verdünnung von Standards abhängen, durch suboptimales Pipettieren stark beeinträchtigt werden.

Optimieren des Arbeitsablaufs

• Anforderungen an den Volumenbereich und den Probendurchsatz
• Anforderungen an die Form des Proben-/Reagenzgefässes
• Proben-/Assayspezifische Anforderungen

Es sind zahlreiche Pipettierinstrumente verfügbar, mit denen sich optimale Resultate und eine höhere Produktivität erzielen lassen. Zugleich bieten sie zusätzliche Vorteile wie eine verbesserte ergonomische Gestaltung sowie bessere Funktionen für eine bestimmte Anwendung. Es gibt zwei Haupttypen von Mikropipetten: Luftpolster- und Direktverdrängungspipetten. Bei beiden Typen wird das Volumen der dosierten Flüssigkeit anhand des Kolbens und der Länge des Kolbenhubs bestimmt.

Luftpolsterpipetten

• Extrem genau bei wässrigen Lösungen
• Sparsam

Luftpolsterpipetten sind die geläufigsten Pipettierinstrumente, die im Labor zu finden sind. Bei diesen Pipetten wird das Spitzenende in die flüssige Probe eingetaucht und anschliessend wird der Pipettierknopf losgelassen.Sobald der Pipettenkolben in der Pipette nach oben geschoben wird, wird ein Teilvakuum erzeugt und die flüssige Probe wird in die Spitze aufgezogen. Die Flüssigkeit nimmt nun den Hohlraum des gewünschten Volumens ein, der durch das Teilvakuum erzeugt wird.

Direktverdrängungspipetten

• Extrem genau bei den meisten Lösungen
• Empfohlen für viskose, dichte, flüchtige oder ätzende Flüssigkeiten

Direktverdrängungspipetten sind zwar nicht so geläufig wie Luftpolsterpipetten, kommen jedoch auch häufig in Laboranwendungen zum Einsatz.Diese Pipetten nutzen einen Einwegkolben und ein Kapillarsystem, um für das gewählte Volumen einen physischen Hohlraum zu erzeugen. Der Kolben hat unmittelbaren Kontakt mit der Probe und wenn der Kolben nach oben geschoben wird, wird sie in die Kapillare aufgenommen. Direktverdrängungspipetten bieten eine hohe Genauigkeit und Präzision beim Pipettieren von wässrigen Lösungen. Sie werden jedoch für viskose, dichte, flüchtige und ätzende Lösungen empfohlen. Die Einwegkapillaren und -kolben, die bei einer Direktverdrängungspipette verwendet werden, sind teurer als Einwegspitzen für Luftpolsterpipetten. Aus diesem Grund werden Luftpolsterpipetten dann empfohlen, wenn sie dieselben Resultate wie Direktverdrängungspipetten erzielen würden.

Optimieren des Arbeitsablaufs

• Anforderungen an den Volumenbereich und den Probendurchsatz
• Elektronische Einkanalpipetten
• Mehrkanalpipetten
• Pipettiersysteme für hohe Durchsätze
• Spezialpipetten
• Direktverdrängungspipetten
• Mehrfachdispenser
• Pipettierhilfen
• Flaschenaufsatz-Dispenser

Die Pipette und die von Hersteller empfohlene Spitze sollten bestenfalls als ein System und nicht als zwei einzelne Komponenten betrachtet werden. Pipettenspitzen, die für den Einsatz mit allen Pipetten beworben werden, weisen häufig Einschränkungen in puncto Passform oder Design auf, da sie mit einer Vielzahl von Pipettenmodellen kompatibel sein sollen. Beim Auswählen von Pipettenspitzen müssen Sie auf Design, Qualität und Passform achten.

Design der Spitzen

Die modernsten Ausführungen weisen eine dünnwandige Spitze mit feinem Punkt oder kleiner Spitzenöffnung auf. Beim Pipettieren kleiner Volumina sorgen Rainin FinePoint™ Spitzen (20 µL) für eine bessere Genauigkeit und Präzision als herkömmliche Pipettenspitzen, die dickwandige oder abgeschrägte Enden aufweisen. FinePoint-Spitzen sind flexibler als die meisten anderen herkömmlichen Spitzen. Somit kann die Probe bei jedem Spitzenwinkel rückstandslos abgegeben werden.Dies bedeutet, dass im Gegensatz zu dickwandigen oder abgeschrägten Spitzen weit weniger Probenmaterial in der Spitze zurückgehalten wird. Unterschiede in der Spitzenausführung wirken sich auf die Leistung, Genauigkeit und Präzision aus. Bei richtiger Verwendung der Pipetten liefern sie jedoch garantiert die angegebene Genauigkeit und Präzision, sofern die vom Hersteller empfohlenen Spitzen verwendet werden.

Qualität der Spitzen

Die gravierendsten Qualitätsmängel treten an der Öffnung der Spitze auf, wo die Probenaufnahme und -dosierung am meisten beeinträchtigt wird. Abbildung 13 zeigt vier Spitzenenden in einer vergrösserten Ansicht.

Bei Graten handelt es sich um Kunststoffrückstände, die beim Spritzgussverfahren an der Innenseite der Spitze oder im Bereich der Öffnung entstehen können.

Spritzgussfehler und koaxiale Mängel entstehen durch unsachgemässes Erhitzen der Kernstifte nach Einspritzen des Kunststoffs. Alle diese Mängel führen zu Probenverlusten beim Pipettieren. Ein hochwertiger Fertigungsprozess minimiert das Risiko von Spitzenmängeln und daraus resultierenden Fehlern.

Pipettenspitzenabdichtung

• LTS™ LiteTouch™ Spitzenabwurfsystem
• Auswahl der Spitzen
• Spezialspitzen für Spezialanwendungen

Die richtige Bewertung Ihrer Anwendung und somit die richtige Auswahl Ihrer Instrumente wirkt sich erheblich auf die Ergebnisse Ihrer Forschung aus. Jedoch sind dies nicht die einzigen Aspekte, die Forscher zur Erzielung optimaler Forschungsergebnisse berücksichtigen müssen. Andere Punkte wie die richtige Pipettiertechnik und Umwelteinflüsse können sich ebenfalls auf die Resultate auswirken. Genauigkeit und Präzision spielen in der wissenschaftlichen Forschung eine entscheidende Rolle. Auf den folgenden Seiten erhalten Sie einen kurzen Überblick über die verschiedenen Pipettiertechniken. Wussten Sie zum Beispiel, dass Sie durch einfaches Befolgen dieser Techniken Ihre Genauigkeit und Präzision um bis zu 5 % steigern können?

Optimaler Volumenbereich

Der normale Betriebsbereich liegt für die meisten Pipetten bei 10 – 100 % des Nennvolumens. Auch wenn dies offiziell als der Betriebsbereich gilt, ändern sich bei sinkender Volumeneinstellung die Leistungsspezifikationen. Die Genauigkeitsspezifikationen für eine 100-Mikroliter-Pipette liegen bei +/- 0,8 % bei 50 – 100 % des Nennvolumens. Wenn Sie jedoch bei 10 µL (oder 10 % des Nennwerts) pipettieren würden, wäre die Ungenauigkeitsspezifikation mehr als dreimal so hoch bzw. würde 2,5 – 3 % des Nennvolumens betragen. Daher liegt das optimale Volumen für die höchste Genauigkeit und Präzision in der Regel bei 35 – 100 % des Nennvolumens. Stellen Sie ein Pipettenvolumen von möglichst nicht weniger als 10 % des Maximalwerts ein. Verwenden Sie stattdessen für geringere Volumina eine kleinvolumige Pipette.

Eintauchtiefe der Spitze

Mit der korrekten Eintauchtiefe der Spitze lässt sich insbesondere bei Mikrovolumenpipetten die Genauigkeit um bis zu 5 % steigern. Die Spitze sollte bei Mikrovolumenpipetten 1 bis 2 mm und bei grossvolumigen Pipetten 6 bis 10 mm tief eingetaucht werden. Zu tiefes Eintauchen erhöht den Druck in der Spitze, sodass zu viel Flüssigkeit aufgenommen wird. Auch Restflüssigkeit auf der Spitzenoberfläche kann die Resultate verfälschen. Wenn Sie die Spitze nicht weit genug eintauchen, kann aufgenommene Luft zu Luftblasen und einem fehlerhaften Volumen führen. Beides führt zu falschen Volumen.

• Der korrekte Aufnahmewinkel
• Sicherstellen der Gleichmässigkeit
• Gleichmässiges Dosieren der Probe
• Vorspülen von Pipettenspitzen
• Vermeiden von Temperaturschwankungen
• Konsistente Mikrometereinstellungen