紫外可见光光度计: 基本知识

基础知识、仪器、校准、色标等

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紫外可见光光谱
紫外可见波谱
什么是紫外可见光计?

吸光度/透光率转换器

=

符合比耳-朗伯定律的光吸收
扫描式分光光度计
扫描式分光光度计

传统的扫描式分光光度计的工作原理是:对每个定义的波长进行连续透光率测量。光由衍射光栅分成不同波长。样品比色皿放置在衍射光栅与检测机之间。

阵列式分光光度计
阵列式分光光度计

在阵列分光光度计中,通过连续体照射样品(即:一次性得到光的所有光谱分量),因此可同时吸收不同波长的光。然后通过反射光栅衍射透射光。与使用传统的扫描式分光光度计相比,该仪器有助于更快速获取紫外可见光谱。

阵列式与扫描式紫外可见光谱对比

性能测试

法定标准物质(CRM)

仪器测试参数

验收标准

USP 42 NF 37

欧洲 药典 10

波长准确度与

重复性

Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 ,10 % v/v HClO4

空白: 空气

14个波长

(240 nm – 650 nm)

Xe: 2个波长(260.6, 528.6 nm)

紫外区(200~400 nm):±1 nm

可见光区(400~780 nm):±2 nm

(标准偏差) <0.5 nm

紫外区(< 400 nm):

± 1 nm

可见光区(> 400 nm):

±  3 nm

光度

准确度与

重复性**

K2Cr2O7 ,0.001  M HClO4

空白 0.001 M HClO4

60 mg/L

0 A – 2 A,

235、257、313、350 nm

如果吸光度≤ 1A

准确度:  ± 0.010A

重复性:

标准偏差  ≤ 0.005 A

 

如果吸光度> 1A

准确度:  ± 1%

重复性:

标准偏差  ≤ 0.5%

 

准确度: ±0.010 A或±1 %,以较大值为准

 

烟酸:

0.1 M HCl

空白 0.1 M HCl

12 mg/L

0.26 A – 1.6 A

213、261 nm

光度线性

K2Cr2O7 ,0.001  M HClO4

空白 0.001 M HClO4

 

6 – 200 mg/L,最大吸光度值3.0 A,

235、257、313、350 nm

所有被测量的过滤器均符合 光度准确度验收标准

R2> 0.999

烟酸:

0.1 M HCl

空白 0.1 M HCl

6 – 60 mg/L,最大电流2.5 A

213、261 nm

根据方法A测出的杂散光

(SFRM)

1.2 % w/v KCl/H2O;

10 mm光程

空白 1.2 % w/v KCl/H2O, 5  mm光程

198 nm时最大吸光度值

≥ 0.7 A

(NA)

根据方法B测出的杂散光(SWM)

1.2 % w/v KCl/H2O;

10 mm光程

空白 H2O, 10 mm光程

198 nm时A最大吸光度值

≥ 2.0 A

≥ 2.0 A

分辨率

0.02 % v/v 甲苯-正己烷溶液

空白正己烷/

正庚烷(欧洲 药典 10)

A最大,269/A最小,267

>1.3

级别规定请参见相应专著

**《欧洲药典》中未指定光度重复性 (精确度)

S.D. ——标准偏差

紫外可见分光光度法颜色测量的基础知识
色数
这朵玫瑰花的颜色是什么?

为了按照行业标准对产品进行独特定义,建立了不同色标。这些色标包括:

电子秤

标准

应用

赛波特值

ASTM D156, ASTM D6045

确定燃料(煤油、汽油、柴油、石脑油等)在储存时是否受到污染或发生降解

APHA/Pt-Co/Hazen

ASTM D1209

黄度指数用作水、化学、石油与塑料工业纯度检验的指标

加德纳值

ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2

用于测试通过加热获得颜色的产品,例如:树脂、脂肪酸、清漆与干性油等

CIELAB

DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174

香精与香料以及食品与饮料行业的质量控制

CIELab颜色测量——紫外可见光光谱法

EBC

MEBAK方法2.13.2,EBC方法8.5,EBC方法9.6

以EBC单位测量啤酒、麦芽、焦糖等物质的颜色强度与浊度(雾度)。

USP/EUP

USP-24专著631,EP方法2.2.2

药物质量控制

Hess-Ives

DGK测试方法F 050.2

用于测试化学品与表面活性剂液体(主要用于化妆品行业)

 

核酸的质量控制
用于紫外可见分光光度法分析的比色皿

下图显示比色皿的可用透射范围:

材料

理论透射范围(nm)

远紫外石英

170——2700

光学玻璃

320——2500

近红外石英

220——3800

紫外硅

220——2500

紫外塑料

220——900

一次性PS比色皿

340——750

一次性PMMA比色皿

285——750

 

紫外可见光分光光度计比色皿

 

水溶液

有机分子

难以去除颗粒

蛋白质

重金属

脂肪酸

清洗液

等容积的3 M HCl与乙醇

 

用50%硝酸清洗

浓缩HNO3或2 M HCl

等容积的乙醇与3 M HCl

 

 

在室温下用胰蛋白酶培养

 

(不建议使用乙醇和丙酮进行清洁。)

等容积硫酸2 M与50%去离子水

 

王水

 

 

等容积的IPA与去离子水

浸泡时间*

10分钟

10分钟

30秒

一整夜

20分钟

擦拭

*表中所示浸泡时间为粗略估算;但是仅建议您浸泡比色皿,直至污渍/污染物被去除。

紫外可见光光谱在食品行业中的应用
紫外可见光光谱在制药行业中的应用
紫外可见光光谱在化妆品行业中的应用
紫外可见光谱在石油化工行业中的应用
紫外可见光谱在化工行业中的应用
紫外可见光谱在生物技术中的应用

有哪些不同类型的光谱?

不同的光谱法主要由它们使用的辐射、能量与材料之间的相互作用以及它们用于的材料与应用类型进行区分。常用于化学分析的光谱法包括:原子光谱、紫外可见光谱、红外光谱、拉曼光谱与核磁共振。

光谱类型

辐射类型

交互作用

波长

ϒ射线光谱

ϒ射线

原子核

<0.1 nm

 X射线荧光光谱

X射线

内层电子

0.01——2.0 nm

真空紫外光谱

紫外(UV)

离子化

2.0——200 nm

紫外可见光谱

紫外可见分光光度法

价电子

200——800 nm

红外与拉曼光谱

红外

分子振动

0.8——300 mm

微波光谱 

微波

分子转动

1 mm——30 cm

电子自旋共振光谱

电子自旋

核磁共振光谱

无线电波

核自旋

0.6——10 m

 

紫外区内有哪些不同的分子相互作用?

紫外区内的跃迁类型

官能团对光谱产生怎样的影响?

假设有一个包含原子的官能团,原子中有一对或多对不吸收紫外线/可见光辐射的孤对电子。然而,当这个官能团连接到发色团时,会改变吸收的强度与波长。这种现象称作辅助色素或增色基团。

辅助色素的存在会导致峰值或信号向更长波长的位置偏移,这种现象称作红移。对红移基团产生作用的官能团是甲基、羟基、烷氧基、卤素和氨基等取代基。

导致峰值或信号向更长波长的位置偏移的辅助色素称作蓝移。实际上,发色团和辅助色素的组合如同一个具有不同吸收最大值(λmax)的新发色团。例如,苯在256 nm处显示λmax,而苯胺在280 nm处显示λmax。因此,NH2基团用作辅助色素,并导致λmax朝更大值移动。

紫外可见光谱中的光谱带宽与分辨率之间有何区别?

分光光度计的光谱带宽(SBW)与单色仪系统的物理狭缝宽度和光学色散有关。分辨率指仪器将光分成有限、明显波长区域并且区分每个有限区域的能力。光谱带宽通常用于扫描仪器,而分辨率通常用于阵列仪器。

对于大多数药典定量目的,2 nm以下的光谱带宽足以,比率的验收标准为1.3。光谱分辨率可用于与光谱带宽的比较。

表中显示了梅特勒托利多的超越系列紫外/可见分光光度计的分辨率,使用正己烷中的甲苯以及等效光谱带宽对分辨率进行测量。

仪器

光谱分辨率

等效光谱带宽(nm)

UV5

>1.5

< 2.0

UV5Bio

>1.5

< 2.0

UV5Nano

>1.7

< 1.5

UV7

> 1.9

≤ 1.0

 

紫外可见分光光度计中使用哪些不同的光源?

最好的光源是在所有紫外与可见光波长范围内具有良好强度和低噪声并确保长期稳定性的光源。如下所述,有一系列常用的光源。

光源

光谱范围

(nm)

区域

使用寿命

钨丝灯

350——2500

VIS + IR

3,000小时

氘弧灯

190——400

UV

1,000小时

氢灯

190——400

UV

1,000小时

闪烁氙灯

190——1100

UV + VIS + NIR

5,500小时*

*与持续运行时50 Hz闪烁对应

衍射光栅如何优于棱镜?

棱镜与衍射光栅是典型的色散元件。棱镜利用不同波长的材料折射率差异实现色散。而衍射光栅利用的是干扰造成的每一种波长的衍射方向差异。棱镜和衍射光栅都可以将光谱扩散成用于分析的多种颜色。不过衍射光栅对光颜色的敏感度较低,并且扩散颜色的角度大于棱镜。棱镜中的玻璃对可见光是透明的,但它会吸收和阻挡光谱中的红外与紫外光。每英寸有几百条线的衍射光栅可以将可见光谱中间的光偏转至少20度。玻璃棱镜的偏转角度通常小于此角度。

紫外可见光谱可以测量哪些无机化合物?

如果分子拥有任何官能团或偶联物,或者如果它们可产生彩色复合物,则可以使用紫外可见光谱分析分子。由于无机化合物不包含任何官能团或偶联物,因此与适合的化合物发生反应是分析它们的常用方法。这会产生一种彩色复合物,其吸光度可以在可见光区域中进行光度测量,并且与其实际浓度相关联。例如分析铁时通常采用的方法是:与1, 10——邻苯二酚发生反应,从而产生一种红色络合物。在570 nm处测量复合物的吸光度,以估算铁的浓度。

单光束与双光束分光光度计有何不同?

单光束与双光束分光光度计之间的主要区别如下:

单光束分光光度计: 光源发出的单光束透过样品

双光束分光光度计: 光源发出的光束分成两部分:一部分透过样品,另一部分透过参比物

双光束分光光度计中的光束分裂通过两种方式实现:

  1. 使用部分透射镜或类似装置静态实现
  2. 使用移动的光学与机械装置衰减光束

如何使用紫外可见分光光度法分析固体聚合物薄膜?

如何使用紫外可见分光光度法分析固体聚合物薄膜?

温度是否会影响到紫外可见分光光度法分析?

温度会对吸光值产生影响。不同的溶剂在不同的温度条件下会经历不同的相互作用。因温度变化而改变的溶液参数为:

  • 反应速率。当温度变化时速率变化。这会导致样品的活性发生变化。酶促/生物分子反应对温度非常敏感。
  • 溶质的溶解度。溶解度受温度变化的影响。低溶解度有可能导致吸收不精确。
  • 溶剂的膨胀或收缩。这有可能导致溶液浓度发生变化以及到影响吸光度,因为吸光度与浓度呈线性关系。
  • 纹影效应。这种效应有可能随着温度变化而发生,导致一系列有可能改变真正吸光度的对流电流。

光度噪声、波长准确度/重复性、光度重复性和杂散光等光学性能参数在10——40 °C范围内不受温度影响。

而诸如光度分辨率(甲苯/己烷比)与光度准确度波长(K2Cr2O7 in HClO4)之类的光学参数在10——40 °C内显示出从0.014到-0.034/单位的温度依赖性。

使用高性能恒温系统(例如:酷T与CuvetteChanger)可以实现对紫外可见分光光度法的温度控制。点击此处了解更多信息。

什么是杂散光?

什么是杂散光?

为什么紫外可见阵列分光光度计中的样品室是打开的?

紫外可见阵列分光光度计中的样品室是打开的,这是因为阵列式仪器使用反向光学器件同步检测光谱的所有波长。

反向光学器件: 光线穿过样品后发生衍射。因此,只有一小部分外部环境光会对某一波长区域内的信号产生作用。

同步检测: 使用同时提供2048个光强度信号的阵列式检测机可在一秒内记录全光谱。由于测量速度非常快,因此可明显减小环境光的影响。

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