Wiadomo, że na inaktywację wirusów w biofarmaceutykach metodą niskiego pH mają wpływ takie czynniki jak wartość pH, czas, temperatura, zawartość białka oraz zawartość substancji rozpuszczonej lub buforu. Wiele wirusów ulega nieodwracalnej denaturacji i jest skutecznie niszczonych przy pH w przedziale 5,0–5,5. W zależności od zakresu wirusów, które mają być inaktywowane i usunięte, przedział ten może być wystarczający. Jednak niektóre wirusy otoczkowe ulegają skutecznej inaktywacji dopiero w przedziale pH 3,5–4.
Wiele biofarmaceutyków opartych na przeciwciałach monoklonalnych wymaga szczególnie szerokiego spektrum usuwania różnorodnych wirusów, wobec czego powszechnie stosuje się „niskie” pH docelowe w przedziale 3,5-4 (rysunek A). Jednak długotrwałe narażenie na pH w tym zakresie może również spowodować uszkodzenie lub inaktywację niektórych produktów biofarmaceutycznych, w szczególności białek lub enzymów, na przykład białek krwi lub insuliny (rysunek B). Przy długotrwałej ekspozycji na stres wywołany niskim pH białka i enzymy ulegają znacznej deamidacji, denaturacji i agregacji. Roztwory immunoglobulin (w tym przeciwciał monoklonalnych zarówno klasy IgG, jak i IgM) są zasadniczo mniej wrażliwe niż inne białka lub enzymy przy pH 3,5–5,5, chociaż pozostają wrażliwe w różnym stopniu. Po upływie wystarczającego czasu w warunkach inaktywacji miano wirusów zakaźnych powinno być skutecznie zredukowane, jednak resztkowe cząstki, szczątki wirusa lub inne materiały nie zostaną jeszcze fizycznie usunięte (rysunek C).
W przypadku produktów opartych na immunoglobulinach monoklonalnych najczęściej stosuje się niskie pH, gdyż jest to stosunkowo prosta i mało inwazyjna metoda, która zazwyczaj nie wymaga znacznej interwencji ani dodatkowych czynności w celu usunięcia niepożądanych substancji, w przeciwieństwie do metod z wykorzystaniem środków powierzchniowo czynnych lub innych rozpuszczalników. Jednak odpowiednie i optymalne warunki są różne dla różnych typów cząsteczek i zależą też od wymaganego spektrum eliminacji wirusa. Dlatego należy podjąć badania dla każdego typu cząsteczki, aby scharakteryzować i zweryfikować przestrzeń projektową lub granice operacyjne, w których można przeprowadzić skuteczną inaktywację wirusów. Granice te, jak również rezultaty procesu inaktywacji wirusów, są zwykle definiowane przez wszystkie lub przynajmniej wybrane zmienne lub krytyczne parametry procesu (CPP) mające wpływ na wynik inaktywacji wirusów, a tym samym na jakość substancji leczniczej (DS). Przez określenie tych czynników i manipulowanie nimi można poprawić jakość i ilość produktu.
Tradycyjnie badania inaktywacji wirusów przez obniżenie pH przeprowadza się przy ustalonej objętości i stężeniu roztworu immunoglobuliny w naczyniu takim jak zlewka z mieszadłem magnetycznym. Ponieważ do większości prób wykorzystuje się roztwory immunoglobulin o początkowym pH zbliżonym do warunków fizjologicznych, badania inaktywacji wirusów będą miały na celu określenie wpływu parametrów dodawania odczynników. Zazwyczaj miareczkowanie ręczne wykonuje się przy użyciu biurety lub pipetowania, co pewien czas zapisując wyniki pomiaru pH. Po upływie określonego czasu i z utrzymaniem innych parametrów w warunkach niskiego pH wystarczających do inaktywacji badanego wirusa zawartego w próbce, przeprowadza się miareczkowanie odwrotne substancji leczniczej (DS) lub roztworu immunoglobuliny od niskiego pH do odpowiedniej wartości w przedziale fizjologicznym lub lekko zasadowym. Czynność ta stanowi zakończenie inaktywacji wirusów dokonanej przez utrzymanie niskiego pH. Jednak na przez cały czas miareczkowania przy niskim pH w celu inaktywacji wirusów wymagane jest pobieranie próbek do analizy poza procesem w celu udokumentowania różnych właściwości jakościowych, np. agregacji lub deamidacji, za pomocą metod takich jak chromatografia wykluczania (SEC). Mimo iż wykwalifikowani badacze są w stanie przeprowadzić ten proces z dużą precyzją, inaktywacja wirusów jest zwykle pracochłonna i związana z problemami typowymi dla każdego procesu ręcznego, czyli naturalnymi odchyleniami, niedokładnościami i słabą odtwarzalnością.